丙酮丁醇高產菌株的選育研究

王素玲

摘要：通過1-methyl-3-nitro-1-nitroso-guanidin與coldplasma復合誘變Bacillussp.（兼性厭氧產丁醇芽孢桿菌）C2菌株，再利用分離篩選獲得總溶劑產量與三株丁醇都有較為顯著提高的突變菌株，突變菌株發酵10%木薯醪液之后總溶劑產量與丁醇分別達到20.79g/L、20.14g/L、20.36g/L與12.74g/L、12.44g/L、12.59g/L，與出發菌株相比較分別提高了15.4%-19.1%、21.6%-24.5%。優化編號414的突變菌株的發酵條件，在100mL的三角瓶發酵體系里面，編號為414的突變菌株的最佳發酵條件為接種量10%，種齡為24h，ph值控制在7左右，裝液量為100mL，然后在37℃溫度環境下靜置發酵72h，在這個發酵條件之下，此菌株發酵7%木薯醪液產總溶劑量與丁醇分別達到了26-30g/L，17-19g/L。

關鍵詞：丙酮丁醇高產菌株、選育、優化、研究

現今全球對石油資源的需求量越來越大及其價格持續攀升，很多國家都已著手開展重大的戰略轉向，利用生物資源替代石油資源，放棄化學技術戰略，通過生物技術戰略生產生物燃料以替代越來越少的石油資源。丁醇作為新開發的生物燃料，可以大量摻入石油，與燃料乙醇相比較在經濟性方面也就具有更大的優勢。本論文通過長期研究中獲得Bacillussp.（兼性厭氧產丁醇芽孢桿菌）C2菌株，Bacillussp.（兼性厭氧產丁醇芽孢桿菌）C2菌株突破了以往僅能利用Clostridiumsp.（專性厭氧梭狀芽孢桿菌）的局限，為研究生產丁醇奠定了基礎。本論文通過1-methyl-3-nitro-1-nitroso-guanidin與coldplasma復合誘變選育Bacillussp.（兼性厭氧產丁醇芽孢桿菌）C2菌株，且采取有效措施優化Bacillussp.（兼性厭氧產丁醇芽孢桿菌）C2菌株的發酵條件，進而有效提升了丁醇發酵的產量，對于丁醇大批量的工業生產具有指導性意義。

1材料與方法

1.1菌種

在實驗室中從種植懷地黃的土壤中篩選、分離、保存得到Bacillussp.（兼性厭氧產丁醇芽孢桿菌）C2菌株。

1.2培養基

1.2.1分離純化培養基

1000mL蒸餾水，20g/L瓊脂，30g/L葡萄糖，5g/L蛋白胨，0.01g/L氯化鈉，0.2g/L硫酸鎂，0.01g/L七水合硫酸亞鐵，0.5g/L磷酸氫二鉀，0.5g/L磷酸二氫鉀。

1.2.2活化培養基

制作10%的木薯醪液：將少許水加入木薯粉中，慢慢調制成糊狀，再將調好的木薯糊緩緩倒入沸水中，一邊倒一邊攪拌，煮15-20min。然后再將制作好的活化培養基裝入試管之中，經過15min121℃的滅菌。

1.2.3發酵培養基

利用制作活化培養基的方式配置10%的木薯醪液作為發酵培養基。

1.2.4P2培養基

儲備溶液10mL/L，0.1L/g酵母浸膏，30g/L葡萄糖。

1.3菌種活化

取木薯醪試管菌種，在木薯醪試管培養基中接種10%的接種量，通過一百攝氏度水中浴熱處理六十至九十秒之后又用冷水急速冷卻，之后在三十七攝氏度的環境下靜置培養24h。

1.4利用1-methyl-3-nitro-1-nitroso-guanidin與coldplasma復合誘變菌種

把通過10%的木薯醪液活化的Bacillussp.（兼性厭氧產丁醇芽孢桿菌）C2菌株接種到18mm×180mm的p2試管培養基10mL中，三十七攝氏度培養24h達到對數生長期之后，在0.5mL的反應鐵片上涂0.5mL的菌液，之后在把涂好菌液的反應鐵片放在距離離子發射孔1-2mm的位置，利用60v、120w的離子發射90s之后，在反應鐵片用2mL無菌生理鹽水洗滌，然后在10%的木薯醪液中接種進處理好的菌液活化，活化好之后根據10%的接種量放入p2培養基中，在37℃的條件下培養24h之后獲得的菌體用每分鐘五千轉的速度離心5min，用緩沖液離心洗滌菌體四次，再將菌體懸浮在體積相同的磷酸鹽緩沖液之中。之后在含有16mL每升的分離純化培養基平板上涂布通過以上操作的菌液，在37℃的條件下培養2-3天。在10%的木薯醪液中接入從分離純化培養基平板上挑選出來的較大飽滿的菌落，之后發酵篩選出的優良的菌株。

1.5丁醇發酵篩選

菌種經10%的木薯醪液活化24h后，按10%接種量接種入發酵培養基（100mL三角瓶，裝液量100mL）中，37℃靜置發酵27h。發酵結束后，取2mL發酵液，每分鐘12000轉速離心10min，取上清液保存于-20℃冰箱中，待測其中丙酮、丁醇和乙醇（總溶劑，ABE）的含量。

1.6發酵條件優化

在100mL的三角瓶發酵體系（總容積約150mL，裝液量100mL）中，按1.5發酵條件，分別對初始pH值、種齡、接種量和發酵時間進行發酵條件優化研究。

1.7溶劑含量測定

高效氣相色譜法：Agilent7890A氣相色譜儀，進樣量0.2μL，進樣口溫度為200℃，分流比30∶1，氮氣流量每分鐘1.5mL，柱箱溫度60攝氏度，保持時間4min，檢測器（FID）溫度250℃。

2結果與分析

2.1誘變育種結果

將出發菌株經低溫等離子體和亞硝基胍復合誘變后涂布分離篩選平板（培養基中含16mL/L丁醇作為選擇壓力），挑取長勢良好的菌落接種入10%木薯醪液中連續傳代培養（10代以上），選擇木薯醪液液化良好的菌株進行發酵篩選，結果見表1。其中菌株213、42和414丁醇和總溶劑產量分別達到12.59g/L、12.44g/L、12.74g/L和20.36g/L、20.14g/L、20.79g/L，較出發菌株丁醇和總溶劑產量分別提高了21.6%～23.1%和15.4%～19.4%。

表1丁醇產生菌株復合誘變發酵篩選結果

2.2培養基初始pH值對發酵的影響

在100mL的三角瓶發酵體系中，裝液量100mL、種齡24小時、接種量10%、發酵溫度37℃、發酵時間72h，調整發酵培養基的初始pH值分別為5、6、7、8、9的5個梯度，考察發酵培養基初始pH值對丁醇發酵的影響。結果（圖1）表明，當培養基的初始pH值為7時，丁醇和總溶劑的產量最高，分別達到12.78g/L和21.54g/L。木薯醪液的初始pH值為7左右，因此發酵培養基不必調整pH值（圖1）。

3結論

利用低溫等離子體和亞硝基胍（NTG）對丁醇發酵芽孢桿菌C2菌株進行復合誘變，通過平板分離、連續傳代培養、液體發酵篩選等過程，得到多株丁醇產量明顯提高的突變菌株，其中編號為213、42和414的突變菌株發酵10%木薯醪液后丁醇和總溶劑產量分別為12.59g/L、12.44g/L、12.74g/L和20.36g/L、20.14g/L、20.79g/L，分別比出發菌株C2提高23.1%、21.6%、24.5%和16.7%、15.4%、19.1%。對414號菌株的發酵條件進行優化，在100mL三角瓶發酵體系中，該菌株的最適發酵條件為：裝液量100mL，種齡24h，接種量10%，pH值為7（自然），37℃靜置發酵72h，在此條件下，414菌株發酵7%木薯醪液產丁醇和總溶劑量分別為17-19g/L和26-30g/L。

參考文獻

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