丙酮丁醇高產(chǎn)菌株的選育研究

王素玲

摘要：通過(guò)1-methyl-3-nitro-1-nitroso-guanidin與coldplasma復(fù)合誘變Bacillussp.（兼性厭氧產(chǎn)丁醇芽孢桿菌）C2菌株，再利用分離篩選獲得總?cè)軇┊a(chǎn)量與三株丁醇都有較為顯著提高的突變菌株，突變菌株發(fā)酵10%木薯醪液之后總?cè)軇┊a(chǎn)量與丁醇分別達(dá)到20.79g/L、20.14g/L、20.36g/L與12.74g/L、12.44g/L、12.59g/L，與出發(fā)菌株相比較分別提高了15.4%-19.1%、21.6%-24.5%。優(yōu)化編號(hào)414的突變菌株的發(fā)酵條件，在100mL的三角瓶發(fā)酵體系里面，編號(hào)為414的突變菌株的最佳發(fā)酵條件為接種量10%，種齡為24h，ph值控制在7左右，裝液量為100mL，然后在37℃溫度環(huán)境下靜置發(fā)酵72h，在這個(gè)發(fā)酵條件之下，此菌株發(fā)酵7%木薯醪液產(chǎn)總?cè)軇┝颗c丁醇分別達(dá)到了26-30g/L，17-19g/L。

關(guān)鍵詞：丙酮丁醇高產(chǎn)菌株、選育、優(yōu)化、研究

現(xiàn)今全球?qū)κ唾Y源的需求量越來(lái)越大及其價(jià)格持續(xù)攀升，很多國(guó)家都已著手開(kāi)展重大的戰(zhàn)略轉(zhuǎn)向，利用生物資源替代石油資源，放棄化學(xué)技術(shù)戰(zhàn)略，通過(guò)生物技術(shù)戰(zhàn)略生產(chǎn)生物燃料以替代越來(lái)越少的石油資源。丁醇作為新開(kāi)發(fā)的生物燃料，可以大量摻入石油，與燃料乙醇相比較在經(jīng)濟(jì)性方面也就具有更大的優(yōu)勢(shì)。本論文通過(guò)長(zhǎng)期研究中獲得Bacillussp.（兼性厭氧產(chǎn)丁醇芽孢桿菌）C2菌株，Bacillussp.（兼性厭氧產(chǎn)丁醇芽孢桿菌）C2菌株突破了以往僅能利用Clostridiumsp.（專性厭氧梭狀芽孢桿菌）的局限，為研究生產(chǎn)丁醇奠定了基礎(chǔ)。本論文通過(guò)1-methyl-3-nitro-1-nitroso-guanidin與coldplasma復(fù)合誘變選育Bacillussp.（兼性厭氧產(chǎn)丁醇芽孢桿菌）C2菌株，且采取有效措施優(yōu)化Bacillussp.（兼性厭氧產(chǎn)丁醇芽孢桿菌）C2菌株的發(fā)酵條件，進(jìn)而有效提升了丁醇發(fā)酵的產(chǎn)量，對(duì)于丁醇大批量的工業(yè)生產(chǎn)具有指導(dǎo)性意義。

1材料與方法

1.1菌種

在實(shí)驗(yàn)室中從種植懷地黃的土壤中篩選、分離、保存得到Bacillussp.（兼性厭氧產(chǎn)丁醇芽孢桿菌）C2菌株。

1.2培養(yǎng)基

1.2.1分離純化培養(yǎng)基

1000mL蒸餾水，20g/L瓊脂，30g/L葡萄糖，5g/L蛋白胨，0.01g/L氯化鈉，0.2g/L硫酸鎂，0.01g/L七水合硫酸亞鐵，0.5g/L磷酸氫二鉀，0.5g/L磷酸二氫鉀。

1.2.2活化培養(yǎng)基

制作10%的木薯醪液：將少許水加入木薯粉中，慢慢調(diào)制成糊狀，再將調(diào)好的木薯糊緩緩倒入沸水中，一邊倒一邊攪拌，煮15-20min。然后再將制作好的活化培養(yǎng)基裝入試管之中，經(jīng)過(guò)15min121℃的滅菌。

1.2.3發(fā)酵培養(yǎng)基

利用制作活化培養(yǎng)基的方式配置10%的木薯醪液作為發(fā)酵培養(yǎng)基。

1.2.4P2培養(yǎng)基

儲(chǔ)備溶液10mL/L，0.1L/g酵母浸膏，30g/L葡萄糖。

1.3菌種活化

取木薯醪試管菌種，在木薯醪試管培養(yǎng)基中接種10%的接種量，通過(guò)一百攝氏度水中浴熱處理六十至九十秒之后又用冷水急速冷卻，之后在三十七攝氏度的環(huán)境下靜置培養(yǎng)24h。

1.4利用1-methyl-3-nitro-1-nitroso-guanidin與coldplasma復(fù)合誘變菌種

把通過(guò)10%的木薯醪液活化的Bacillussp.（兼性厭氧產(chǎn)丁醇芽孢桿菌）C2菌株接種到18mm×180mm的p2試管培養(yǎng)基10mL中，三十七攝氏度培養(yǎng)24h達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期之后，在0.5mL的反應(yīng)鐵片上涂0.5mL的菌液，之后在把涂好菌液的反應(yīng)鐵片放在距離離子發(fā)射孔1-2mm的位置，利用60v、120w的離子發(fā)射90s之后，在反應(yīng)鐵片用2mL無(wú)菌生理鹽水洗滌，然后在10%的木薯醪液中接種進(jìn)處理好的菌液活化，活化好之后根據(jù)10%的接種量放入p2培養(yǎng)基中，在37℃的條件下培養(yǎng)24h之后獲得的菌體用每分鐘五千轉(zhuǎn)的速度離心5min，用緩沖液離心洗滌菌體四次，再將菌體懸浮在體積相同的磷酸鹽緩沖液之中。之后在含有16mL每升的分離純化培養(yǎng)基平板上涂布通過(guò)以上操作的菌液，在37℃的條件下培養(yǎng)2-3天。在10%的木薯醪液中接入從分離純化培養(yǎng)基平板上挑選出來(lái)的較大飽滿的菌落，之后發(fā)酵篩選出的優(yōu)良的菌株。

1.5丁醇發(fā)酵篩選

菌種經(jīng)10%的木薯醪液活化24h后，按10%接種量接種入發(fā)酵培養(yǎng)基（100mL三角瓶，裝液量100mL）中，37℃靜置發(fā)酵27h。發(fā)酵結(jié)束后，取2mL發(fā)酵液，每分鐘12000轉(zhuǎn)速離心10min，取上清液保存于-20℃冰箱中，待測(cè)其中丙酮、丁醇和乙醇（總?cè)軇珹BE）的含量。

1.6發(fā)酵條件優(yōu)化

在100mL的三角瓶發(fā)酵體系（總?cè)莘e約150mL，裝液量100mL）中，按1.5發(fā)酵條件，分別對(duì)初始pH值、種齡、接種量和發(fā)酵時(shí)間進(jìn)行發(fā)酵條件優(yōu)化研究。

1.7溶劑含量測(cè)定

高效氣相色譜法：Agilent7890A氣相色譜儀，進(jìn)樣量0.2μL，進(jìn)樣口溫度為200℃，分流比30∶1，氮?dú)饬髁棵糠昼?.5mL，柱箱溫度60攝氏度，保持時(shí)間4min，檢測(cè)器（FID）溫度250℃。

2結(jié)果與分析

2.1誘變育種結(jié)果

將出發(fā)菌株經(jīng)低溫等離子體和亞硝基胍復(fù)合誘變后涂布分離篩選平板（培養(yǎng)基中含16mL/L丁醇作為選擇壓力），挑取長(zhǎng)勢(shì)良好的菌落接種入10%木薯醪液中連續(xù)傳代培養(yǎng)（10代以上），選擇木薯醪液液化良好的菌株進(jìn)行發(fā)酵篩選，結(jié)果見(jiàn)表1。其中菌株213、42和414丁醇和總?cè)軇┊a(chǎn)量分別達(dá)到12.59g/L、12.44g/L、12.74g/L和20.36g/L、20.14g/L、20.79g/L，較出發(fā)菌株丁醇和總?cè)軇┊a(chǎn)量分別提高了21.6%～23.1%和15.4%～19.4%。

表1丁醇產(chǎn)生菌株復(fù)合誘變發(fā)酵篩選結(jié)果

2.2培養(yǎng)基初始pH值對(duì)發(fā)酵的影響

在100mL的三角瓶發(fā)酵體系中，裝液量100mL、種齡24小時(shí)、接種量10%、發(fā)酵溫度37℃、發(fā)酵時(shí)間72h，調(diào)整發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH值分別為5、6、7、8、9的5個(gè)梯度，考察發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH值對(duì)丁醇發(fā)酵的影響。結(jié)果（圖1）表明，當(dāng)培養(yǎng)基的初始pH值為7時(shí)，丁醇和總?cè)軇┑漠a(chǎn)量最高，分別達(dá)到12.78g/L和21.54g/L。木薯醪液的初始pH值為7左右，因此發(fā)酵培養(yǎng)基不必調(diào)整pH值（圖1）。

3結(jié)論

利用低溫等離子體和亞硝基胍（NTG）對(duì)丁醇發(fā)酵芽孢桿菌C2菌株進(jìn)行復(fù)合誘變，通過(guò)平板分離、連續(xù)傳代培養(yǎng)、液體發(fā)酵篩選等過(guò)程，得到多株丁醇產(chǎn)量明顯提高的突變菌株，其中編號(hào)為213、42和414的突變菌株發(fā)酵10%木薯醪液后丁醇和總?cè)軇┊a(chǎn)量分別為12.59g/L、12.44g/L、12.74g/L和20.36g/L、20.14g/L、20.79g/L，分別比出發(fā)菌株C2提高23.1%、21.6%、24.5%和16.7%、15.4%、19.1%。對(duì)414號(hào)菌株的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，在100mL三角瓶發(fā)酵體系中，該菌株的最適發(fā)酵條件為：裝液量100mL，種齡24h，接種量10%，pH值為7（自然），37℃靜置發(fā)酵72h，在此條件下，414菌株發(fā)酵7%木薯醪液產(chǎn)丁醇和總?cè)軇┝糠謩e為17-19g/L和26-30g/L。

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