披針葉黃華生物堿成分分析

林源 王志昇 李勇 劉河濤 何生虎

摘要 [目的]研究披針葉黃華生物堿的具體種類及含量。[方法]采用生物堿系統提取、硅膠柱層析分離及重結晶技術從披針葉黃華干草粉中分離生物堿，并用GC-MS對總堿和結晶進行測定。[結果]分離出2種生物堿結晶Ⅰ和結晶Ⅱ，總堿中含有7種喹諾里西啶生物堿，結晶Ⅰ為黃華堿，結晶Ⅱ為Tetrahydrodeoxoargentamin。[結論]該試驗為進一步研究披針葉黃華動物中毒的毒性毒理提供了理論依據。

關鍵詞 披針葉黃華;生物堿;成分分析

中圖分類號 S567 文獻標識碼

A 文章編號 0517-6611（2014）33-11660-02

Analysis on the Contents of Alkaloid in Thermopsis lanceolate

LIN Yuan1， WANG Zhi-sheng1， LI Yong2，HE Sheng-hu3* et al

（1. Ningxia Medical University， Yinchuan，Ningxia 750021; 2. Ningxia Polytechnic，Yinchuan，Ningxia 750021; 3.Ningxia University， Yinchuan，Ningxia 750021）

Abstract [Objective] The research aimed to study the specific types and contents of alkaloids in Thermopsis lanceolate. [Method]Alkaloid crystal was isolated from Thermopsis lanceolate powder by silica gel column and recrystal technology. The total alkaloids and crystallization were further determined by GC-MS. [Result]Two kinds alkaloid of crystalline Ⅰ and crystalline Ⅱ were isolated.The total alkaloids containing 7 kinds Kui Nuolixi Ding alkaloid， that crystal I is d-Thermopsine and crystal II is Tetrahydrodeoxoargentamin. [Conclusion] This experiment provides the theoretical basis for funther research on toxicity and toxicology of Thermopsis lanceolate-poisoning animal.

Key words Thermopsis lanceolate;Alkaloid;Contents analysis

作者簡介 林源（1982- ），男，寧夏銀川人，講師，博士，從事天然藥物及基因工程藥物研究。*通訊作者，教授，碩士，博士生導師，從事家畜內科學疾病和有毒植物研究。

收稿日期 2014-10-17

披針葉黃華（Thermopsis lanceolate），又稱牧馬豆或土馬豆，屬豆科野決明屬，多年生草本植物。分布于我國的東北、華北、內蒙古、陜西、甘肅、寧夏、青海、新疆、四川等省區，俄羅斯、蒙古也有分布。本種即是一種有毒植物[1]，牲畜誤食種子或全草后會引起中毒;但其可作為一種藥用植物，具有興奮呼吸、抗輻射及祛痰止咳等功效。引起披針葉黃華中毒的成分主要是喹諾里西啶生物堿類，已報道的有黃花堿、臭豆堿、金雀花堿、d-鷹爪豆堿、羽扇豆堿、N-甲基金雀花堿、N-甲醛基金雀花堿等，該類生物堿具有抗癌、抗心率失調、抗微生物、抗潰瘍和升高白細胞等多方面的藥理作用[2]，具有潛在的藥用價值。筆者在此采用生物堿系統提取、硅膠柱層析分離及重結晶技術從披針葉黃華干草粉中分離生物堿，并用GC-MS對總堿和結晶進行測定。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 植物材料。

披針葉黃華于2006年10月采自寧夏鹽池縣，洗凈、曬干、粉碎后備用。黃華堿、金雀花堿標準品購自上海融禾醫藥科技發展有限公司，規格為20 mg。

1.1.2 主要儀器。

島津GC-MSQP2010氣質聯用分析儀，美國惠普公司;AR1140電子天平，美國制造; 2XZ-2旋片式真空泵，浙江黃巖求精真空泵廠生產;RE52-05型旋轉蒸發儀，上海亞榮生化儀器廠;Db-2型不銹鋼電熱板，蘇州威爾實驗用品有限公司。

1.1.3 試劑。薄層層析硅膠GF254，青島海洋化工有限公司;柱層層析用硅膠，批號01284304，青島海洋化工廠分廠。所用試劑和藥品均為國產分析純和AR級。

1.2 試驗方法

1.2.1 披針葉黃華總堿的提取。

85%酒精加熱回流提取，濃縮提取液得浸膏。用1N HCl溶解后氯仿除雜，氨水堿化至pH為9～11后氯仿萃取[3-4]。

1.2.2 總堿的薄層層析。

總生物堿、黃華堿、金雀花堿用甲醇溶解，再用毛細管點樣于硅膠板上，乙酸乙脂-甲醇做展開劑，上行法展開[5]。展開劑跑至距硅膠板前沿1～2 cm處時取出，揮干溶劑。置于 254 nm紫外燈下觀察熒光，再用改良碘化鉍鉀試劑噴霧顯色，計算各點比移值（Rf）值。

1.2.3 總堿的柱層析分離。

稱取15 g總堿，用甲醇溶解后與柱層析硅膠按1∶1（g/g）進行拌樣，將拌好的樣品揮干，研細備用。用石油醚裝柱，采用濕法裝柱、干法上樣方法將處理好的樣品上于硅膠柱[6-7]。洗脫液選用乙酸乙脂-甲醇系統梯度洗脫，梯度順序為乙酸乙脂→乙酸乙脂∶甲醇（12∶1、6∶1、3∶1、1∶1、1∶2）→甲醇。每15 ml收集1份。乙酸乙脂∶甲醇（3∶1）做展開劑進行TLC檢測，合并相同組分，待其自然揮干，收集管壁析出晶體，并重結晶進行純化。

1.2.4 氣相-質譜（Gas chromatograph-Mass spectrum，GC-MS）分析。對標準品、提取的總堿、結晶Ⅰ、結晶Ⅱ進行GC-MS分析[8]。各樣品用甲醇溶解，進樣量1 μl。

1.2.4.1 色譜條件。采用GC-MSQP2010氣質聯用分析儀，GC-MS接口溫度280 ℃，檢索譜庫為DB-5MX。

1.2.4.2 GC條件。色譜柱HP-SE-54石英玻璃毛細管柱（甲基硅氧烷，0.25 mm×30 m），載氣He，分流比20∶1，柱溫190～280 ℃，程序升溫5 ℃/min，進樣口溫度250 ℃，用峰面積歸一法計算各化合物的相對百分含量。

1.2.4.3 MS條件。EI離子源，電子能量70 ev，離子源溫度230 ℃，倍增器電壓0.7 kV，質量掃描范圍40～400 u，掃描周期0.5 s。DB-5MX質譜數據庫檢索，分析結果。

2 結果與分析

2.1 披針葉黃華生物堿提取結果

對5組提取試驗的結果進行統計學分析，計算得出乙醇提取浸膏量為93.4 g/kg，總生物堿量為3.82 g/kg，披針葉黃華中生物堿的提取率平均為0.38%。

2.2 總生物堿薄層層析檢查結果

總生物堿薄層層析以乙酸乙脂∶甲醇（3∶1）做展開劑分離效果最好，可以看到8個點，其中5個點清晰明顯且比較集中，2個點模糊。根據薄層層析結果（表1）判定披針葉黃華生物堿至少含有5種以上不同生物堿。

表1 總生物堿薄層層析檢查結果

注：*表示該點不明顯。

2.3 總堿柱層析分離結果

共收集244管洗脫液，經TLC檢測合并Rf相同的試管。13～24管管壁有淡黃色片狀結晶，試管底部為褐色油狀物和結晶混合物，TLC檢測出現3點;187～223管管壁有大量長絲狀黃色結晶、TLC檢測出現1點。共收獲2種結晶，命名為結晶Ⅰ和結晶Ⅱ，結晶Ⅰ經甲醇重結晶后為淡黃色片裝結晶，結晶Ⅱ經丙酮重結晶為針狀淡黃色結晶。

2.4 GC-MS檢測結果

總堿經GC-MS分析，共出峰24個，總離子流色譜圖如圖1所示，經質譜數據庫檢索，確定了7種生物堿成分（表2）。在總堿中首次測得了生物堿Tetrahydrodeoxoargentamin ，其余6種生物堿已見于以往的報道。總生物堿總離子流色譜圖結果（圖1）顯示，總堿中5號和6

號生物堿的出峰時間與金雀花堿和黃華堿標準品的出峰時

圖1 總生物堿總離子流色譜圖

表2 披針葉黃華總堿GC-MS分析鑒定結果

間一致;而結晶I的出峰時間

與黃華堿相同、結晶Ⅱ出峰時間與金雀花堿標準品不同。

結晶Ⅰ經GC-MS檢測并與標準品進行比對鑒定為黃華堿，純度達96%;結晶Ⅱ經GC-MS檢測為Tetrahydrodeoxoargentamin，純度達70%，需進一步與標準品進行比對后確定?？倝A中金雀花堿含量很少，僅為0.3%。

3 結論與討論

（1）寧夏中草藥手冊記載該植物含生物堿量為0.5%～3.0%，其中莖葉0.79%、根0.76%、種子和花含量較高，分別為2.02%和1.46%。該試驗采用醇類溶劑提取法提取披針葉黃華總生物堿，由于原料采用的是全草且采時已過開花時期，故草粉中生物堿含量低，提取總堿量僅占全草質量的0.38%。另一個原因是由于披針葉黃華中以大極性生物堿為主，故采用氯仿未能完全萃取出所含生物堿，應該繼續用正丁醇提取殘留生物堿。

（2）總堿薄層層析時，乙酸乙脂∶甲醇（3∶1）分離效果最好，在碘化鉍鉀顯色劑下呈現8個點。但在GC-MS分析中，儀器所檢測并確定的物質只有7種，含量最小的生物堿僅占總堿的0.3%。因為氣質聯用儀精密度很高，故推測薄層層析中顯色模糊的點有可能是其他生物堿的脫尾。

（3）經質譜數據庫檢索，確定的7種生物堿，有6種均為已知的披針葉黃華生物堿[9]，而Tetrahydrodeoxoargentamin未見報道存在于該植物當中，需進一步通過紅外光譜（IR）、紫外光譜（UV）、核磁共振（NMR）來鑒定其化學結構。以往報道披針葉黃華含量最高的是金雀花堿，約占總堿含量的40%左右[7-8]，而該試驗中測得的金雀花堿僅占總堿的0.3%，可能是受植物采摘季節、提取部位以及提取分離方法等因素的影響。

參考文獻

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[3] 趙寶玉，阮娜，何生虎，等.牧馬豆中生物堿的提取分離及鑒定[J].動物醫學進展，2003，24（4）：87-89.

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[6] 李揚漢.中國雜草志[M].北京：中國農業出版社，1998：285-288.

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[8] 周云鳳，朱忠珂，趙寶玉.披針葉黃華的營養成分及生物堿成分分析[J].動物醫學進展，2001（2）：415-418.

[9] 史志誠.動物毒物學[M].北京：中國農業出版社，2001.