廢棄煙沫堆置發酵有機肥腐熟菌種的分離、篩選和鑒定

王明旭 江維維 劉艷霞 遲蓀琳 石俊雄 李想

摘要 [目的]為加速煙草廢棄物的資源化利用，篩選適合廢棄煙沫快速發酵腐熟的微生物菌種成為資源化利用的重要一環。[方法]利用纖維素剛果紅選擇性培養基，分別從廢棄煙絲、腐熟牛糞、油枯有機肥和味精下腳料等田固體廢棄物中分離篩選腐熟菌種，并進行復篩、純化和鑒定。[結果]共篩得16株腐熟菌株，其中復篩出6株高效菌株分別為F1、F2、F3、N1、N2、W1。經16S rDNA和Biolog鑒定，該6種菌菌株分別為Bacillus subtillis，Bacillus subtillis，Bacillus amyloliquefaciens，Bacillus amyloliquefaciens，Mycobacterium vaccae，Bacillis amyloliquefaciens;纖維素分解能力試驗結果表明，6種降解菌對煙沫中纖維素的降解能力為N1>F3>N2>F2>F1>W1;在煙堿濃度為低濃度0.1%時耐煙堿能力為F2>F3=N1>W1>F1>N2，在煙堿濃度為高濃度0.5%時耐煙堿能力為F2>F3>N1>N2>W1=F1，同時N1與N2、N1與F1、N1與F2之間沒有拮抗作用。[結論]N1與N2復配構成廢棄煙沫專用腐熟菌種為最佳選擇。

關鍵詞 煙沫廢棄物;腐熟菌種;纖維素降解菌;煙堿;16S rDNA;Biolog

中圖分類號 S182 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2014）33-11686-05

Isolation， Screening and Identification of Decompositing Microorganisms for Tobacco Scrap Solid-state Fermentation

WANG Ming-xu1， JIANG Wei-wei1， LIU Yan-xia2， LI Xiang2* et al

（1. Renhuai Tobacco Filiale， Renhuai， Guizhou 564500; 2. Guizhou Academy of Tobacco Science， Guiyang， Guizhou 550081）

Abstract [Objective]In order to accelerate the decomposition of solid organic wastes of tobacco， the screening of composting microorganism plays a key role in tobacco scrap rapid process fermentation. [Method]Decomposing strains from tobacco crap， dairy manure， rapeseed meal and monosodium glutamate waste samples were screened， purified and identified by Congo red screening medium in this experiment. [Result]Six dominant strains of sixteen strains，named as F1，F2，F3，N1，N2 and W1 were isolated and identified as Bacillus subtillis，Bacillus subtillis，Bacillus amyloliquefaciens，Bacillus amyloliquefaciens，Stenotrophomonas maltophilia，Bacillis amyloliquefaciens by 16S rDNA sequence homologies and Biolog Identification. The results showed that the ability of cellulose decomposition of strains were N1>F3>N2>F2>F1>W1. Besides， the tolerances to 0.1% nicotine of 6 strains were F2>F3=N1>W1>F1>N2， while to 0.5 % nicotine were F2>F3>N1>N2>W1=F1. There was no antagonistic effect between N1 and N2， N1 and F1， and N1 and F2. [Conclusion] The combination of N1 and N2 was considered as the best complex decompositing strains for tobacco srap solid-state fermentation.

Key words Tobacco scrap; Decomposing microorganisms; Cellulose decomposition strain; Nicotine; 16S rDNA; Biolog

基金項目 國家自然科學基金《貴州省青枯病導病與抑病型土壤微生物網絡差異研究》項目（41461068）;公益性行業（農業）科研專項201103004;貴州省科學技術基金項目黔科合J字[2013]2197、2198;中國煙草總公司貴州省公司科技項目《酒糟快速腐熟生產有機肥技術研究及在烤煙生產上的應用》（201410）。

作者簡介 王明旭（1970- ），男，貴州綏陽人，助理農藝師，從事煙草生產與管理方面的研究。*通訊作者，助理研究員，博士，從事植物營養與土壤微生物等方面的研究。

收稿日期 2014-10-20

我國煙草的種植面積和產量均居世界首位，目前國內外煙草主要用作卷煙。作為煙草生產大國，我國煙草種植面積約130萬hm2，年產量450萬～500萬t。在卷煙加工生產中會產生大量的煙葉、煙沫等下腳料廢棄物。我國煙草廢棄物的年總量在90萬～100萬t，約占總產量的25%[1]，其中大部分被廢棄，不僅造成資源浪費，而且嚴重污染環境。

煙沫廢棄物指除去具有烘烤價值葉片以外的煙草莖株部分，包括煙莖、煙根、土腳葉、“優化結構”政策優化掉的葉片、煙花、煙種、腋芽[2]。煙草體內已檢測出的化學物超過1 000多類，主要包括各種烴、芳香烴、醛、酮、甾醇、醇、醌、酯、生物堿、色素、類異戊二烯衍生物、氨基酸和蛋白類等十幾大類物質[3]。經進一步細分，鑒定出包括植物堿、有機酸、蛋白質、淀粉、甘油三脂、糖類、單寧、果膠、纖維素等3 000多種化合物，其中多數化合物是光合作用的產物，具有很高的使用價值[4]。

對廢棄煙葉的綜合利用，一直受到國內外研究者的重視。有很多的研究報道，如從廢棄煙葉中提取煙堿，生產煙堿農藥，提取茄尼醇用于生產輔酶Q10等藥物[5];從未成熟的鮮煙葉中提取類似大豆蛋白質的煙草蛋白質，作為優質飼料的添加劑[6]等。但是，尚有大量的煙草廢棄物未得到很好的利用。煙草廢棄物中有很強植物毒性的煙堿存在，所以雖然含有豐富的有機質，但不能作為有機肥直接施于土壤，而單獨堆肥腐熟耗時較長，煙堿降解效果差，且會造成環境污染和資源浪費，而且可能導致滋生病蟲害的傳播。目前國內常通過添加大量的植物秸稈于煙草廢棄物中，以稀釋降解不徹底的煙堿對農作物帶來的負面影響，使煙草廢棄物成為很好的有機肥源[7]。

高附加值的農業廢棄物的肥料化利用，特別是高附加值的生物有機肥及有機無機復合肥的開發，不但能解決環境污染問題，而且可以為農業生產提供大量的有機肥料。這是減少農業面源污染、節約資源發展可持續農業和循環經濟的重要途徑[8]。在農業廢棄物高附加值肥料利用過程中，加快升溫速度、縮短堆腐時間是有機肥生產經濟效益的關鍵，而接種菌劑是加快堆肥升溫、促進發酵腐熟過程的措施[9-10]。竹江良等[11]研究了配備不同比例豬糞對煙草廢棄物高溫堆肥腐熟進程的影響，發現在煙草廢棄物中加入豬糞能縮短進入高溫分解階段的時間，延長高溫分解持續時間，增加全氮含量，加快物料NH2-N轉化和C/N 比降低的速率，縮短堆肥腐熟時間。該課題主要是篩選出能夠使煙沫廢棄物高效腐熟的微生物菌種，使得煙沫廢棄物能夠資源化利用，不僅能夠解決烤煙區的環境問題，而且能夠為煙農帶來更多的收入。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1

分離樣品。堆肥后期（10 d）的廢棄煙沫、牛糞有機肥、油枯有機肥、味精下腳料等樣品用于腐熟菌種的分離、篩選，并用篩選到的菌種驗證纖維素降解能力。

1.1.2

培養基及配方。纖維素降解菌富集培養基：NaNO3 0.5 g，KCl 0.5 g，K2HPO4 1.0 g，FeSO4·7H2O 痕量，MgSO4·7H2O 0.5 g，濾紙條，蒸餾水1 000 ml。濾紙條用濃度1%稀醋酸浸泡24 h，再用濃度2%蘇打水沖洗至中性，滅菌后備用。

纖維素降解菌篩選培養基：CMC-Na 5.0 g，KH2PO4 1.0 g，尿素 0.5 g，（NH4）2SO4 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，FeSO4·7H2O 7.5 mg，MnSO4·H2O 2.5 mg，ZnSO4·7H2O 3.6 mg，CoCl2·6H2O 3.7 mg，CaCl2 0.5 g，0.02%剛果紅，16 g瓊脂，去離子水定容至1 L。

牛肉膏蛋白胨培養基：牛肉膏 5 g，蛋白胨 10 g，NaCl 5 g，固體加瓊脂 16 g，用于細菌的分離、培養。

PDA培養基：馬鈴薯（去皮） 200 g，蔗糖（或葡萄糖） 20 g，固體加瓊脂16 g，用于真菌的分離、培養。

高氏一號合成培養基：可溶性淀粉 20.0 g，KNO3 1.0 g，K2HPO4 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，NaCl 0.5 g，FeSO4·7H2O 0.01 g，固體加瓊脂16 g，用于放線菌的分離、培養。

1.2 試驗方法

1.2.1

纖維素降解菌的分離與篩選。

1.2.1.1

富集。稱取10 g混合均勻的樣品，加入90 ml無菌水中，振蕩，制成懸濁液，靜置約5 min后取上清液2 ml到5 ml滅菌的富集培養基中，將處理過的濾紙條放入富集培養基中，并將試管置于搖床中，170 r/min，37 ℃培養，待濾紙崩解后取2 ml轉接至新鮮的富集培養基內，連續富集3次。

1.2.1.2

初篩。吸取連續富集3次的富集液0.5 ml，梯度稀釋后，選擇10-4、10-5和10-6 3個梯度，分別吸取0.1 ml涂布于篩選培養基，30 ℃培養，待出現明顯菌落后用1 mol/L NaCl倒入培養基中處理10～15 min，選擇有透明圈的菌株，將細菌轉接到牛肉膏蛋白胨培養基上，放線菌轉接到高氏一號培養基上，并且劃線純化，鏡檢沒有雜菌后，用濃度15%甘油-20 ℃保存。將長出的真菌菌落在PDA培養基上單孢分離純化3次后，制備真菌孢子懸液后，同樣用濃度15%甘油-20 ℃保存。

1.2.1.3

復篩。將4 ℃保存的菌體接種到篩選培養基，30 ℃培養72 h后測定菌落與透明圈的大小。

1.2.2

細菌的鑒定。

1.2.2.1

分子生物學鑒定。將純菌落接種到4.5 ml牛肉膏蛋白胨培養基上培養，170 r/min，30 ℃搖床培養24 h，12 000×g離心30 s后收集菌體，進行基因組DNA的提取。基因組DNA的提取使用Axygen菌體DNA提取試劑盒完成，具體步驟參照說明書。

細菌16S rRNA基因擴增以具體各自的基因組DNA為模板，使用16S rRNA基因通用引物進行PCR擴增[12]。

16S rRNA基因擴增的引物為27F和1541R。 PCR反應體系：

Premix TaqVersion 2.0 25 μl，

模板DNA 1 μl，

引物1 1 μl，

引物2 1 μl，

dH2O 22 μl。

PCR反應條件：

95 ℃， 5 min;

95 ℃， 30 s;

58 ℃， 30 s 32周期;

72 ℃， 1 min;

72 ℃， 10 min;

4 ℃， ∞。

1.2.2.2

Biolog鑒定。將獲得的純培養菌種劃線接種至羊血培養基，30 ℃培養轉化菌種12～16 h;用Inoculatorz棉簽從瓊脂平板中有細胞生長的地方沾取直徑3 mm的菌落接種于接種液A中調好濁度;將菌懸液倒入V型加樣水槽中，使用8道移液槍將接種液接于GenⅢ板上;將GenⅢ板放于Biolog系統中，30 ℃培養24 h。

1.2.3

細菌生長曲線的測定。取純化3～5代后的菌種，活化在平板上后接入30 ml液體培養基中，30 ℃、170 r/min培養24 h，作為種子液;以1%的接種量接入裝有200 ml牛肉膏蛋白胨培養基的1 L三角瓶中，在微生物搖床中30 ℃、170 r/min培養48～72 h，每隔2 h取樣1次，用分光光度計在波長600 nm的條件下測量吸光度。以時間為橫坐標，以吸光度為縱坐標，繪制生長曲線[13]。

1.2.4

菌種分解纖維素能力大小的測定。將純化的菌種點接到以纖維素為唯一碳源的剛果紅篩選培養基中央，30 ℃培養箱培養72 h后，用1 mol/L NaCl處理，測量透明圈的大小。

1.2.5

菌種的耐煙堿程度檢驗。根據廢棄煙沫中的煙堿含量，設置煙堿濃度為0、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%，每個梯度設置3個重復，將不同濃度梯度煙堿加入裝有30 ml培養基的100 ml三角瓶中。將待測菌種的種子液以1%的接種量接入培養基中，30 ℃、170 r/min培養24 h后用紫外分光光度計以波長600 nm測量OD值。細菌用牛肉膏蛋白胨培養基，放線菌用高氏一號培養基。

1.2.6

菌種的復配試驗。

1.2.6.1

復配菌株之間拮抗作用測試。將纖維素降解能力較強的6個菌株分別編號為F1、F2、F3、N1、N2、W1。在測定菌株F1對其他5個菌株是否具有拮抗作用時，將菌株F1點接到固體牛肉膏蛋白胨培養基中央，在30 ℃培養箱中靜置培養24 h后，分別用猴頭瓶均勻噴灑其他5個菌株在牛肉膏蛋白胨培養基表面，然后于30 ℃微生物培養箱靜置培養24 h，觀察是否有拮抗圈，并且測量其大小。以此類推，分別測定菌株F2、F3、N1、N2、W1對其他菌株是否具有拮抗作用。

1.2.6.2

復配菌株耐煙堿能力測試。將沒有拮抗作用2個菌株的種子液等量加入配置好的煙堿濃度為0、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%的培養基中，30 ℃、170 r/min振蕩培養24 h后，用分光光度計，以波長600 nm測量吸光度，測定無拮抗作用的復配菌株對煙堿的耐性濃度。

2 結果與分析

2.1 纖維素降解菌的分離、篩選和鑒定

2.1.1

纖維素降解菌的分離、篩選。以纖維素為唯一碳氮源，經過初篩和純化，從發酵后的廢棄煙沫中得到3株菌株F1、F2和F3;從牛糞肥料中得到2株菌株N1和N2;從味精下腳料中得到1株菌株W1，共6個純的細菌菌株，確定為試驗菌株。表1為篩選菌株的培養特性。菌株的菌落形態見圖1。

表1 菌株的培養特征

2.1.2

菌種鑒定。由表2可知，菌株F1為

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtillis），菌株F3為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens），菌株N1為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens），菌株W1同樣為

解淀粉芽孢桿菌（Bacillis amyloliquefaciens）。菌株F2和N2的2種鑒定方法的結果不同。這是由于2種鑒定方法的原理不同，用16S rDNA和特征性C源測序各有優缺點[14]。經過中國微生物研究所鑒定，菌株F2為枯草芽孢桿菌，菌株N2為母牛分枝桿菌（Mycobacterium vaccae）。

2.2 菌株生長曲線

以菌株液體培養的時間為橫坐標，以各時間點所測得菌液的平均OD600值為縱坐標，繪制出各菌株的生長曲線。所有篩選到的菌種在適宜的條件下培養經歷了延遲期、對數期、穩定期、衰亡期4個階段。從圖2可以

圖1 菌株的菌落形態

表2 菌株的16S rDNA 和Biolog 鑒定結果

看出，0～4 h為F1和F3的延遲期，0～2 h為F2、N1、N2、W1的延遲期，菌種適應新的環境，繁殖的速度很慢;5～28 h為F1和F3的對數生長期，3～24 h為F2的對數生長期，3～10 h為N1的對數生長期，3～14 h為N2的對數生長期，3～22 h為W1的對數生長期，此時營養物質很充分，細菌呈對數快速增長;對數生長期后為穩定期，由于培養基中的營養物質不斷地被消耗掉，細菌新陳代謝產生的毒性物質的積累及pH下降等因素的影響，細菌繁殖的速度逐漸下降，而死亡的細菌數開始逐漸增加，增殖數與死亡數漸趨平衡，細菌總數處于穩定的狀態;當營養物質逐漸減少，而毒性物質越來越多，細菌的繁殖速度逐漸減緩，死亡菌數明顯增多，衰亡的速度超過繁殖的速度，細菌總數呈現下降趨勢，進入衰亡期。

2.3 菌株纖維素分解能力

剛果紅瓊脂培養基是較好的分離篩選培養基。纖維素降解菌能夠在紅色平板上形成透明圈（圖3），且透明圈/菌落直徑比值大致反映其降解纖維素能力[15]。從表3可以看出，將菌株按降解纖維素能力強弱順序排列為N1>F3>N2> F2>F1>W1。

2.4 菌株耐煙堿能力測試

從表4可以看出，在煙堿濃度為0.1%時，菌株F2的煙堿耐性在0.05水平顯著高于其他5種菌株，耐性最高，菌株F3與N1的煙堿耐性無顯著差異，菌株N2的煙堿耐性最低;在煙堿濃度為0.2%時，菌株F3的煙堿耐性最高，菌株F1的煙堿耐性最低;在煙堿濃度為0.3%時，菌株F3的煙堿耐性最高，菌株F2和N1的煙堿耐性無顯著差異，菌株W1的煙堿耐性最低;在煙堿濃度為0.4%時，菌株N2的煙堿耐性最高，W1的煙堿耐性最低;在煙堿濃度為0.5%時，菌種F2的煙堿耐性最高，菌種F1和W1的煙堿耐性無顯著性差異，為最低。由此可知，菌株F2、F3和N2的煙堿耐性較好。

2.5 菌種組配試驗

2.5.1

菌株之間的拮抗分析。從表5可以看出，N1與N2、N1與F1、N1與F2之間沒有拮抗作用，可以進行復配試驗。

圖2 菌株的生長曲線

圖3 菌株F3降解纖維素透明圈

表3 菌株大小及透明圈

2.5.2

復配菌株的耐煙堿能力研究。從表6可以看出，將N1和N2進行復配后的煙堿耐性要在0.05水平顯著高于N1和N2純菌株的煙堿耐性。在煙堿濃度為0.5%時，N1+N2在0.05水平顯著高于N1，是N1煙堿耐性的4.34倍，同時在0.05水平顯著高于N2，為N2的8.67倍。

表4 菌株的煙堿耐性

注：同列不同小寫字母表示差異在0.05水平顯著。

表5 菌株間的拮抗作用

注：“-”表示菌株間無拮抗作用;“+”表示菌株間有拮抗作用。

從表7可以看出，只有在煙堿濃度為0.2%和0.4%時，菌株復配后N1+F2的煙堿耐性在0.05水平顯著高于N1和F2純菌株的煙堿耐性;在煙堿濃度為0.1%時，復配菌株N1+F2的煙堿耐性為最低，僅為F2的92.3%。

從表8可以看出，菌株N1和F1復配后的煙堿耐性在各煙堿濃度上均在0.05水平顯著高于菌株N1和F1的煙堿耐性。

表6 復配菌株N1、N2與純菌株耐煙堿能力比較

注：同列不同小寫字母表示差異在0.05水平顯著。

表7 復配菌株N1， F2與純菌株耐煙堿能力比較

注：同列不同小寫字母表示差異在0.05水平顯著。

表8 復配菌株N1， F1與純菌株耐煙堿能力比較

注：同列不同小寫字母表示差異在0.05水平顯著。

從表9可以看出，在3種復配組合中，N1和N2菌株的復配后耐煙堿的效果在各煙堿濃度上均在0.05水平顯著高于N1+F2，在煙堿0.2%濃度上與N1+F1處理之間無差異，超過煙堿0.3%濃度后，N1+F2處理耐煙堿能力在0.05水平顯著高于N1+F1，分別是其1.15倍（0.3%）、1.99倍（0.4%）和1.58倍（0.5%）。

表9 三種復配菌株耐煙堿能力比較

注：同列不同小寫字母表示差異在0.05水平顯著。

3 結論與討論

腐熟的作物秸稈含有大量有機質和煙草生長發育所必須的多種營養元素，可以增加土壤中腐殖質含量，改善土壤理化性質，增強地力，涵養水分，對促進煙株健壯生長、提高煙葉產質量都有積極作用[16]。近年來，對于作物秸稈降解菌的研究越來越受到關注[17]，但由于煙稈和煙葉具有煙堿的特殊性，煙沫廢棄物的纖維降解菌不但具有較好的降解纖維素的能力，而且需要對煙堿有一定的耐性。該研究從廢棄煙絲、腐熟牛糞、油枯有機肥、味精下腳料中分離并篩選出Bacillus subtillis，Bacillus amyloliquefaciens，Mycobacterium vaccae等6株對纖維素具有降解能力且不同程度耐鹽堿的細菌。綜合6株細菌分解煙沫纖維素能力和耐煙堿能力，最終確定適宜的煙沫廢棄物堆置發酵腐熟菌種。然而，由于單一菌種的功能性有限，采用復配菌種更能達到預期效果[18]。Lwin等[19]分別用離體和活體2種方法驗證了混合光合細菌對茄科勞爾氏菌的拮抗作用，發現這些有效的混合微生物不但可以通過增加植物光合和固氮作用提高作物產量，而且可以防控土傳病害，加快降解土壤中的木質素。該試驗綜合菌株的各項綜合能力，最終確定彼此

無拮抗作用的N1與N2復配構建煙沫專用腐熟菌種。該研究結果對解決當前有效利用烤煙廢棄秸稈、煙葉及肥力轉化有一定的實際意義。

竹江良等[11]研究認為，在煙草廢棄物高溫堆肥過程中，在添加合適豬糞比例的基礎上加入外源微生物菌劑（NNY、FB），有利于堆體迅速進入高溫分解階段，延長高溫分解持續時間，縮短發酵堆肥時間，顯著增加腐熟后堆肥產品的總孔隙度和持水孔隙度，提高堆肥產品品質。吉增福等[20]對秸稈的營養轉化做了詳盡的研究，發現纖維分解菌用于對玉米秸稈的營養轉化，能使營養水平低的秸稈的營養成分得到明顯改善。其中，粗蛋白由5.22%提高到24.62%，粗脂肪由0.67%提高到12.52%，成為可替代15%～20%的混合日糧用于豬的飼料。在發酵過程中，一方面煙沫廢棄物為菌種提供生存和繁育的營養，另一方面菌種加速物料中各種物質的分解與轉化，使廢棄物盡快“變廢為寶”。

該試驗篩選出的菌株N1和N2的纖維素降解能力較強，但其耐鹽堿能力相比F3和F2較弱。這可能是由于菌株F2、F3從發酵煙絲中篩選出來的，其生存過程中已經適應較高濃度煙堿的環境，因此具有較強的耐鹽堿。應用微生物處理烤煙廢棄物作為一種安全、無污染環保形式，可以縮短烤煙廢棄物的發酵時間，減少廢棄物中有害成分（包括煙堿、蛋白質、果膠以及煙草特有的亞硝胺（TSNA）等）。將經過微生物處理的烤煙廢棄物置于土壤中，有利于土壤結構的改良和養分的補充。隨著生物技術的不斷發展，微生物將具有更大的應用潛力。如何更加有效利用篩選出的6種菌株，并將其實際應用到田間有待進一步研究。

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