紅平菇HP1漆酶基因及啟動子克隆和序列分析

鄭苗苗+邵淑麗+張令昻+焦戰(zhàn)戰(zhàn)

摘要：以優(yōu)化后的漆酶培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，將RT-PCR、RACE技術(shù)相結(jié)合，從紅平菇菌株中獲得漆酶基因cDNA全長及Genomic DNA全長序列，Genomic DNA大小為2 344 bp。通過對漆酶基因cDNA全長和Genomic DNA全長序列的比較，結(jié)果顯示該基因包含13個外顯子和12個內(nèi)含子。基因cDNA全長為1 746 bp，其中包含1個完整的ORF，長度為1 590 bp，編碼529個氨基酸。序列在氨基酸水平上與桃紅側(cè)耳Pleurotus salmoneostramineus的氨基酸序列具有較高的同源性，相似性達97%，與齒耳菌Steccherinum murashkinskyi漆酶氨基酸序列相似性達到72%。通過SEFA-PCR的方法，擴增得到漆酶基因起始密碼子上游長1 126 bp的啟動子序列。分析表明，該啟動子區(qū)域上除分布有TATA-box、CAAT-box、AP2等基本的轉(zhuǎn)錄起始元件外，還存在多個潛在的順式作用元件序列位點，包括4個MRE元件、2個CreA熱擊元件、2個STRE元件、1個NIT2元件、1個HSEs元件、1個XRE異生物質(zhì)反應(yīng)元件、4個氮因子結(jié)合位點等。不同外源誘導(dǎo)物可以調(diào)節(jié)紅平菇HP1漆酶基因的表達。

關(guān)鍵詞：紅平菇；漆酶基因；啟動子克隆；轉(zhuǎn)錄調(diào)控

中圖分類號：S646.1+40.1 文獻標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-1302（2014）08-0021-05

漆酶（laccase）是一種含銅的多酚氧化酶，屬于氧化酶的藍銅家族。漆酶含有4個銅原子，分別位于3個不同結(jié)合位點，并且高度保守^[1]。1883年吉田在漆樹中發(fā)現(xiàn)漆酶，1893年Laborde在真菌中發(fā)現(xiàn)漆酶。目前證實漆酶普遍存在于細菌、真菌、植物、昆蟲中^[2]。其中真菌中的白腐菌是最重要的漆酶生產(chǎn)菌。近年來，漆酶是醫(yī)學(xué)、化學(xué)、生物學(xué)、環(huán)境科學(xué)等領(lǐng)域的研究熱點^[3]。目前對漆酶生理生化的研究比較明確，已經(jīng)研究到分子水平并深入基因工程階段，已經(jīng)克隆許多漆酶基因cDNA及Genomic DNA全長序列，并對其序列進行了核苷酸分析^[4]。真菌漆酶存在很多同工酶基因，由于菌株生長環(huán)境和生理狀態(tài)不同，其表達量也有所不同^[5]。研究表明，真菌漆酶的分泌受金屬離子、營養(yǎng)元素及芳香化合物影響，這些因素是在轉(zhuǎn)錄水平誘導(dǎo)漆酶上調(diào)表達^[6]。由起始密碼子上游的啟動子及相應(yīng)順式作用元件的作用，轉(zhuǎn)錄水平的表達量增加。因此，研究真菌漆酶基因上游的啟動子結(jié)構(gòu)及功能對于提高漆酶蛋白的表達產(chǎn)量非常重要。本研究從紅平菇HP1中提取總DNA，利用SEFA-PCR技術(shù)克隆了漆酶基因的啟動子序列并對其結(jié)構(gòu)進行分析，以期為進一步了解漆酶基因的表達調(diào)控機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株與試劑

紅平菇HP1 Pleurotus djamor采集于涼水國家自然保護區(qū)，由齊齊哈爾大學(xué)微生物實驗室保存。DNAquick_快捷型植物基因組DNA提取系統(tǒng)、DNAquick Plant System均購自TIANGEN公司；SMART RACE cDNA擴增試劑盒（Clontech）；E.Z.N.A真菌RNA提取試劑盒（OMEGA）；E.Z.N.A凝膠回收試劑盒（OMEGA）；兩步法RT-PCR試劑盒、Genome Walking Kit試劑盒、3′RACE試劑盒均購自TaKaRa公司；E.coli JM109感受態(tài)細胞購自TaKaRa公司；pMD20-T Vector、LA Taq DNA聚合酶（Promega）；其余試劑為進口或國產(chǎn)分析純。

1.2 基因組DNA和總RNA的提取

以陳軍等報道的優(yōu)化后的漆酶培養(yǎng)基^[7]培養(yǎng)紅平菇HP1。提取紅平菇HP1基因組DNA和總RNA，用核酸檢測儀測定產(chǎn)物純度，通過瓊脂糖凝膠電泳檢驗完整性。

1.3 cDNA核心片段克隆

合成cDNA第1鏈參照兩步法RT-PCR試劑盒使用說明進行。在GenBank中選取20條漆酶基因全長的氨基酸序列，根據(jù)比對結(jié)果查找出同源序列保守區(qū)，從而設(shè)計1對簡并引物（表1），PCR反應(yīng)體系30 μL，含10×PCR buffer 3 μL，2.5 mmol/L dNTP Mixture 1μL，5 U/μL TaKaRa Ex TaqTM HS 0.5 μL，引物L(fēng)cc1-RT1和Lcc1-RT2各 1 μL，cDNA 2 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 40 s，55 ℃ 35 s，72 ℃ 3 min，30個循環(huán)；72 ℃延伸8 min。取5 μL擴增產(chǎn)物用 12 g/L 瓊脂糖凝膠電泳鑒定（以下檢測方法同）。

1.4 漆酶cDNA3′/5′末端的RACE-PCR擴增

參照3′RACE試劑盒和SMART RACE cDNA擴增試劑盒使用說明合成cDNA，根據(jù)漆酶cDNA基因片段序列，設(shè)計3′/5′RACE特異性引物，獲得其3′/5′末端序列（表1），cDNA 3′末端套式PCR反應(yīng)體系25 μL，第1次PCR反應(yīng)含10×LA PCR buffer Ⅱ（Mg2+Free）2 μL，25 mmol/L MgCl2 1 μL，1×cDNA Dilution buffer Ⅱ 1 μL，10 μmol/L 3′RACE Outer Primer 1 μL，5 U/μL TaKaRa LA Taq

15 min。第2次PCR反應(yīng)含10×LA PCR buffer Ⅱ（Mg2+Free）2.5 μL，25 mmol/L MgCl2 2.5 μL，2.5 mmol/L dNTP Mixture 4 μL，10 μmol/L Gene Specific Inner Primer 1 μL，10 μmol/L 3′ RACE Inner Primer 1 μL，5 U/μL TaKaRa LA Taq 0.25 μL，第1次 PCR產(chǎn)物 0.5 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，30個循環(huán)；72 ℃ 15 min。cDNA5′末端套式PCR反應(yīng)體系25 μL，10×Advantage2 PCR buffer 2.5 μL，10 mmol/L dNTP Mix 0.5 μL，50×Advantage2 polymerase Mix 0.5 μL，5′ RACE-Ready cDNA 1.5 μL，10 μmol/L GSP1 0.5 μL，UPM（10×）2.5 μL。反應(yīng)條件同3′ RACE。

1.5 漆酶cDNA全長及漆酶Genomic DNA全長的擴增

根據(jù)cDNA 3′/5′末端核苷酸序列結(jié)果，分別在其3′和5′末端設(shè)計特異性引物，用于擴增漆酶cDNA全長序列（表1）。同時以基因組DNA為模板，擴增漆酶基因組全長。cDNA全長PCR反應(yīng)體系50 μL，含5×Prime STARTM buffer（Mg2+ plus） 10 μL，10 mmol/L dNTP Mixture 4 μL，2.5 U/μL Prime STARTM HS DNA Polymerase 0.5 μL，引物L(fēng)cc1-S1和 Lcc1-S2 各1 μL，反轉(zhuǎn)錄cDNA 5 μL。Genomic DNA全長PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件同“1.3”節(jié)。

1.6 SEFA-PCR法克隆漆酶基因的啟動子序列

根據(jù)已獲得的漆酶Genomic DNA全長序列，設(shè)計5′端啟動子特異性引物，分別為Lcc1-SP1、Lcc1-SP2、Lcc1-SP3，以基因組DNA為模板進行3輪PCR擴增，獲得漆酶基因5′端啟動子序列（表1）。

1.7 漆酶基因結(jié)構(gòu)及啟動子結(jié)構(gòu)分析

將上述得到的漆酶全長基因cDNA和基因組全長以及5′端啟動子序列經(jīng)過膠回收試劑盒純化后，進行T載體克隆，并送交北京英俊公司測序。運用生物信息學(xué)技術(shù)對獲得的漆酶全長基因cDNA和基因組以及5′端啟動子序列進行同源性比較及結(jié)構(gòu)特點分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 總RNA檢測

提取紅平菇菌絲體總RNA后，經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果表明，28S rRNA、18S rRNA條帶較清晰，且2條帶比值接近于2 ∶1，證明總RNA較完整。經(jīng)核酸檢測儀檢測，280/260、260/230分別為2.01、2.57，說明純度較高。所提取總RNA可以用于后續(xù)試驗（圖1）。

2.2 紅平菇HP1漆酶基因cDNA全長的克隆與序列分析

根據(jù)真菌漆酶高度保守Cu-bind結(jié)構(gòu)域Ⅰ、Ⅳ的氨基酸序列，設(shè)計1對簡并引物并擴增漆酶基因cDNA片段，得到1條約1 000 bp大小條帶，將其進行大腸桿菌轉(zhuǎn)化并測序，測序結(jié)果為1 021 bp，進行Blastx比對后證明是漆酶基因（圖2）。根據(jù)已知的漆酶cDNA片段，設(shè)計3′端特異性的正向引物：3′RACE GSP （outer）和3′RACE NGSP （inner），以反轉(zhuǎn)錄的 cDNA 第1條鏈為模板，擴增3′ cDNA末端，獲得約750 bp大小條帶，進行測序后漆酶基因片段為742 bp，其3′末端有典型的PolyA尾巴，并且具有加尾信號（AATAAA）（圖3、圖4）。根據(jù)已知的漆酶cDNA片段設(shè)計5′端特異性反向互補引物：5′RACE GSP，以反轉(zhuǎn)錄液為模板，擴增5′ cDNA末端，獲得約 750 bp 大小條帶，進行測序后基因片段為732 bp，5′端有一典型UTR區(qū)（1～66 bp），編碼區(qū)長度為666 bp，該基因片段與RT-PCR擴增的基因片段有重復(fù)區(qū)域，進行Blastx比對后證明是漆酶基因（圖5）。

將RT-PCR獲得的漆酶基因片段與3′/5′RACE獲得的漆酶基因片段進行剪切拼接，得到cDNA基因全長為 1 746 bp，命名為Pd-lac1。漆酶具有真核生物基因的一般特征，在其5′端有1個UTR區(qū)，長度為66 bp；3′端具有PolyA尾巴和加尾信號（AATAAA）。通過NCBI的ORF Finder檢測到1條長1 590 bp的完整開放式閱讀框，其編碼529個氨基酸，預(yù)測蛋白分子質(zhì)量為55.52 ku，限制性酶切位點有78個，等電點pI約為4.72。應(yīng)用RPS-Blast軟件進行Cu-bind結(jié)構(gòu)域分析表明，該蛋白有3個Cu-bind結(jié)構(gòu)域，即pfam07732、pfam07731、pfam00394，其中pfam07732、pfam07731是多銅氧化酶中與次級代謝物運輸、分解代謝和生物合成相關(guān)的結(jié)構(gòu)域；pfam00394是Cu離子保守結(jié)構(gòu)域。利用SignalP V2.0軟件分析位于氨基酸序列N端具有真核基因的信號肽序列（1～19aa），剪切位點為AHA-AI。利用Scanprosite軟件分析得出，在漆酶基因編碼的氨基酸序列中含有3個N-糖基化位點（N-X-S/T），天冬酰胺殘基分別位于序列中的第216、311、444處，它們是潛在的糖基化位點。將漆酶編碼的氨基酸序列與已知的蛋白序列進行Blastp比對后發(fā)現(xiàn)，它與桃紅側(cè)耳Pleurotus salmoneostramineus的氨基酸序列具有較高的同源性，相似性達97%，與齒耳菌Steccherinum murashkinskyi漆酶氨基酸序列相似性達到72%。

2.3 漆酶Genomic DNA全長的克隆與結(jié)構(gòu)分析

根據(jù)漆酶全長cDNA序列設(shè)計1對特異性全長引物，以提取總DNA為模板通過全長PCR擴增得到該漆酶Genomic DNA的全長序列，全長為2 258 bp，命名為Pd-lac1（圖6）。

利用NCBI網(wǎng)站的Align Sequences Nucleotide BLAST對漆酶基因cDNA全長和基因組DNA全長序列進行分析，在所克隆的漆酶基因組DNA中包含13個外顯子和12個內(nèi)含子。內(nèi)含子長度分別為56、48、53、51、55、66、51、51、58、68、51、56 bp，是典型的真菌內(nèi)含子長度（49～85 bp）。每個內(nèi)含子剪切位點序列為5′GT…AG-3′（圖7）。

2.4 漆酶基因啟動子的獲得與轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件分析

根據(jù)漆酶Genomic DNA全長序列信息，參照Liu的方法^[8]，靠近5′端設(shè)計3條反向引物L(fēng)cc1-SP1、Lcc1-SP2、Lcc1-SP3，以紅平菇HP1基因組DNA為模板對該基因上游片段進行hiTAIL_PCR擴增。3輪反應(yīng)后，引物L(fēng)cc1-SP1、Lcc1-SP2、Lcc1-SP3獲得了較長的PCR產(chǎn)物（圖8）。對第3輪PCR中的Lcc1-SP3、AP3引物產(chǎn)物進行回收測序，獲得了總長度1 500 bp的序列信息，分析發(fā)現(xiàn)該序列包括漆酶基因5′末端及其上游。

利用Biological Services網(wǎng)站的Sequence Analysis對克隆得到的Pd-lac啟動子序列進行分析。在Pd-lac啟動子序列中，具有真核生物典型的啟動子基本轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，Pd-lac的啟動子序列中存在許多潛在的外源誘導(dǎo)物響應(yīng)結(jié)合元件，1個CAAT框，位于第-105位；2個熱擊元件（CreA）（SYGGRG），分別位于-78、-396位；2個AP2元件，分別位于第-164、-566位；1個潛在的熱擊響應(yīng)元件（HSEs）（TCNNGAAN），位于第-660位；2個潛在的壓力響應(yīng)元件（STRE）（CCCCT/AGGGG），分別位于第-157、-866位；4個金屬應(yīng)答元件（MRE）（TGCRCNG），分別位于第-381、-466、-803、-928位；1個異生物質(zhì)反應(yīng)元件（XRE）（CACGCW），位于第-687位；以及 4個氮因子結(jié)合位點（GATA）或其互補序列（TATC），分別位于第-299、-356、-708、-983位；1個NIT2元件，位于第-418位；1個熱擊元件（CreA）（SYGGRG），位于-396位^[9-10]（圖7）。

2.5 紅平菇HP1漆酶基因的系統(tǒng)進化分析

從150個菌株中選取34個相關(guān)性菌株，與Pleurotus djamor按照UPGMA聚類法進行系統(tǒng)進化樹分析。從圖9可以看出，35個菌株分為3大類群，其中1類是16個菌株聚成第1個大類群，為多孔菌（Polyporales）；2類是16個菌株聚成第2個大類群，為傘菌（Agaricales）；3類是3個菌株聚成第3個大類群，為子囊菌（Ascomycota）。紅平菇漆酶cDNA基因?qū)儆趥憔cPleurotus salmoneostramineus遺傳距離最近，同源性為97%。從系統(tǒng)進化樹可以看出，同一菌株漆酶cDNA基因的同工酶遺傳距離也具有差異，如Lenzites gibbosa等。

3 結(jié)論與討論

紅平菇漆酶5′端調(diào)控區(qū)域具有真核生物典型的啟動子轉(zhuǎn)錄元件，CAAT-box、TATA-box、GC-box還具有金屬離子效應(yīng)位點（MRE），MRE對金屬硫蛋白基因響應(yīng)重金屬離子的誘導(dǎo)起著至關(guān)重要的作用。另外，還分布有2個潛在的壓力響應(yīng)元件（STRE）和1個潛在的熱激響應(yīng)元件（HSEs），HSEs通過感受外界熱刺激，進而激活金屬硫蛋白基因的轉(zhuǎn)錄，因而STRE、HSEs可能會共同響應(yīng)高濃度Cu2+的壓力而激活紅平菇漆酶基因的轉(zhuǎn)錄^[2]。紅平菇漆酶5′啟動子的克隆，為漆酶表達調(diào)控機制的研究奠定了基礎(chǔ)。紅平菇漆酶5′啟動子屬于可誘導(dǎo)型啟動子，這為構(gòu)建紅平菇誘導(dǎo)型表達載體提供了理論基礎(chǔ)。

1個漆酶cDNA全長基因和基因組DNA全長序列，這對于今后研究漆酶基因的同源表達、異源表達及蛋白質(zhì)的純化奠定了基礎(chǔ)。利用SEFA-PCR技術(shù)在紅平菇菌株中克隆1個漆酶5′啟動子序列，這對于今后研究紅平菇漆酶的表達調(diào)控具有十分重要的意義。

參考文獻：

[1]Baldrian P. Fungal laccases-occurrence and properties[J]. FEMS Microbiology Reviews，2006，30（2）：215-242.

[2]Faraco V，Giardina P，Sannia G. Metal-responsive elements in Pleurotus ostreatus laccase gene promoters[J]. Microbiology，2003，149（8）：2155-2162.

[3]Rushmore T H，King R G，Paulson K E. Regulation of glutathione S-transferase Ya subunit gene expression：identification of a unique xenobiotic-responsive element controlling inducible expression by planar aromatic compounds[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，1990，87（13）：3826-3830.

[4]Soden D M，Dobson A. Differential regulation of laccase gene expression in Pleurotus sajorcaju[J]. Microbiology，2008，147（8）：1755-1763.

[5]Xiao Y Z，Chen Q，Hang J，et al. Selective induction，purification and characterization of a laccase isozyme from the basidiomycete Trametes sp. AH28-2[J]. Mycologia，2010，96（1）：26-35.

[6]Marzluf G A. Genetic regulation of Nitrogen metabolism in the fungi[J]. Microbiological Reviews，1997，61（1）：17-32.

[7]陳 軍，高大文，池玉杰，等. 偏腫擬栓菌 Pseudotrametes gibbosa 產(chǎn)漆酶的條件優(yōu)化[J]. 菌物學(xué)報，2008，27（6）：940-946.

[8]Liu Y G，Chen Y L. High-efficiency thermal asymmetric interlaced PCR for amplification of unknown flanking sequences[J]. Biotechniques，2007，43（5）：649-650.

[9]Treger J M，Magee T R，Mcentee K. Functional analysis of the stress response element and its role in the multistress response of Saccharomyces cerevisiae[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications，1998，243（1）：13-19.

[10]Strauss J，Horvath H K，Abdallah B M，et al. The function of CreA，the carbon catabolite repressor of Aspergillus nidulans，is regulated at the transcriptiosl and post-transcriptional level[J]. Molecular Microbiology，1999，32（1）：169-178.

利用Biological Services網(wǎng)站的Sequence Analysis對克隆得到的Pd-lac啟動子序列進行分析。在Pd-lac啟動子序列中，具有真核生物典型的啟動子基本轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，Pd-lac的啟動子序列中存在許多潛在的外源誘導(dǎo)物響應(yīng)結(jié)合元件，1個CAAT框，位于第-105位；2個熱擊元件（CreA）（SYGGRG），分別位于-78、-396位；2個AP2元件，分別位于第-164、-566位；1個潛在的熱擊響應(yīng)元件（HSEs）（TCNNGAAN），位于第-660位；2個潛在的壓力響應(yīng)元件（STRE）（CCCCT/AGGGG），分別位于第-157、-866位；4個金屬應(yīng)答元件（MRE）（TGCRCNG），分別位于第-381、-466、-803、-928位；1個異生物質(zhì)反應(yīng)元件（XRE）（CACGCW），位于第-687位；以及 4個氮因子結(jié)合位點（GATA）或其互補序列（TATC），分別位于第-299、-356、-708、-983位；1個NIT2元件，位于第-418位；1個熱擊元件（CreA）（SYGGRG），位于-396位^[9-10]（圖7）。

2.5 紅平菇HP1漆酶基因的系統(tǒng)進化分析

從150個菌株中選取34個相關(guān)性菌株，與Pleurotus djamor按照UPGMA聚類法進行系統(tǒng)進化樹分析。從圖9可以看出，35個菌株分為3大類群，其中1類是16個菌株聚成第1個大類群，為多孔菌（Polyporales）；2類是16個菌株聚成第2個大類群，為傘菌（Agaricales）；3類是3個菌株聚成第3個大類群，為子囊菌（Ascomycota）。紅平菇漆酶cDNA基因?qū)儆趥憔cPleurotus salmoneostramineus遺傳距離最近，同源性為97%。從系統(tǒng)進化樹可以看出，同一菌株漆酶cDNA基因的同工酶遺傳距離也具有差異，如Lenzites gibbosa等。

3 結(jié)論與討論

紅平菇漆酶5′端調(diào)控區(qū)域具有真核生物典型的啟動子轉(zhuǎn)錄元件，CAAT-box、TATA-box、GC-box還具有金屬離子效應(yīng)位點（MRE），MRE對金屬硫蛋白基因響應(yīng)重金屬離子的誘導(dǎo)起著至關(guān)重要的作用。另外，還分布有2個潛在的壓力響應(yīng)元件（STRE）和1個潛在的熱激響應(yīng)元件（HSEs），HSEs通過感受外界熱刺激，進而激活金屬硫蛋白基因的轉(zhuǎn)錄，因而STRE、HSEs可能會共同響應(yīng)高濃度Cu2+的壓力而激活紅平菇漆酶基因的轉(zhuǎn)錄^[2]。紅平菇漆酶5′啟動子的克隆，為漆酶表達調(diào)控機制的研究奠定了基礎(chǔ)。紅平菇漆酶5′啟動子屬于可誘導(dǎo)型啟動子，這為構(gòu)建紅平菇誘導(dǎo)型表達載體提供了理論基礎(chǔ)。

1個漆酶cDNA全長基因和基因組DNA全長序列，這對于今后研究漆酶基因的同源表達、異源表達及蛋白質(zhì)的純化奠定了基礎(chǔ)。利用SEFA-PCR技術(shù)在紅平菇菌株中克隆1個漆酶5′啟動子序列，這對于今后研究紅平菇漆酶的表達調(diào)控具有十分重要的意義。

參考文獻：

[1]Baldrian P. Fungal laccases-occurrence and properties[J]. FEMS Microbiology Reviews，2006，30（2）：215-242.

[2]Faraco V，Giardina P，Sannia G. Metal-responsive elements in Pleurotus ostreatus laccase gene promoters[J]. Microbiology，2003，149（8）：2155-2162.

[3]Rushmore T H，King R G，Paulson K E. Regulation of glutathione S-transferase Ya subunit gene expression：identification of a unique xenobiotic-responsive element controlling inducible expression by planar aromatic compounds[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，1990，87（13）：3826-3830.

[4]Soden D M，Dobson A. Differential regulation of laccase gene expression in Pleurotus sajorcaju[J]. Microbiology，2008，147（8）：1755-1763.

[5]Xiao Y Z，Chen Q，Hang J，et al. Selective induction，purification and characterization of a laccase isozyme from the basidiomycete Trametes sp. AH28-2[J]. Mycologia，2010，96（1）：26-35.

[6]Marzluf G A. Genetic regulation of Nitrogen metabolism in the fungi[J]. Microbiological Reviews，1997，61（1）：17-32.

[7]陳 軍，高大文，池玉杰，等. 偏腫擬栓菌 Pseudotrametes gibbosa 產(chǎn)漆酶的條件優(yōu)化[J]. 菌物學(xué)報，2008，27（6）：940-946.

[8]Liu Y G，Chen Y L. High-efficiency thermal asymmetric interlaced PCR for amplification of unknown flanking sequences[J]. Biotechniques，2007，43（5）：649-650.

[9]Treger J M，Magee T R，Mcentee K. Functional analysis of the stress response element and its role in the multistress response of Saccharomyces cerevisiae[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications，1998，243（1）：13-19.

[10]Strauss J，Horvath H K，Abdallah B M，et al. The function of CreA，the carbon catabolite repressor of Aspergillus nidulans，is regulated at the transcriptiosl and post-transcriptional level[J]. Molecular Microbiology，1999，32（1）：169-178.

利用Biological Services網(wǎng)站的Sequence Analysis對克隆得到的Pd-lac啟動子序列進行分析。在Pd-lac啟動子序列中，具有真核生物典型的啟動子基本轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，Pd-lac的啟動子序列中存在許多潛在的外源誘導(dǎo)物響應(yīng)結(jié)合元件，1個CAAT框，位于第-105位；2個熱擊元件（CreA）（SYGGRG），分別位于-78、-396位；2個AP2元件，分別位于第-164、-566位；1個潛在的熱擊響應(yīng)元件（HSEs）（TCNNGAAN），位于第-660位；2個潛在的壓力響應(yīng)元件（STRE）（CCCCT/AGGGG），分別位于第-157、-866位；4個金屬應(yīng)答元件（MRE）（TGCRCNG），分別位于第-381、-466、-803、-928位；1個異生物質(zhì)反應(yīng)元件（XRE）（CACGCW），位于第-687位；以及 4個氮因子結(jié)合位點（GATA）或其互補序列（TATC），分別位于第-299、-356、-708、-983位；1個NIT2元件，位于第-418位；1個熱擊元件（CreA）（SYGGRG），位于-396位^[9-10]（圖7）。

2.5 紅平菇HP1漆酶基因的系統(tǒng)進化分析

從150個菌株中選取34個相關(guān)性菌株，與Pleurotus djamor按照UPGMA聚類法進行系統(tǒng)進化樹分析。從圖9可以看出，35個菌株分為3大類群，其中1類是16個菌株聚成第1個大類群，為多孔菌（Polyporales）；2類是16個菌株聚成第2個大類群，為傘菌（Agaricales）；3類是3個菌株聚成第3個大類群，為子囊菌（Ascomycota）。紅平菇漆酶cDNA基因?qū)儆趥憔cPleurotus salmoneostramineus遺傳距離最近，同源性為97%。從系統(tǒng)進化樹可以看出，同一菌株漆酶cDNA基因的同工酶遺傳距離也具有差異，如Lenzites gibbosa等。

3 結(jié)論與討論

紅平菇漆酶5′端調(diào)控區(qū)域具有真核生物典型的啟動子轉(zhuǎn)錄元件，CAAT-box、TATA-box、GC-box還具有金屬離子效應(yīng)位點（MRE），MRE對金屬硫蛋白基因響應(yīng)重金屬離子的誘導(dǎo)起著至關(guān)重要的作用。另外，還分布有2個潛在的壓力響應(yīng)元件（STRE）和1個潛在的熱激響應(yīng)元件（HSEs），HSEs通過感受外界熱刺激，進而激活金屬硫蛋白基因的轉(zhuǎn)錄，因而STRE、HSEs可能會共同響應(yīng)高濃度Cu2+的壓力而激活紅平菇漆酶基因的轉(zhuǎn)錄^[2]。紅平菇漆酶5′啟動子的克隆，為漆酶表達調(diào)控機制的研究奠定了基礎(chǔ)。紅平菇漆酶5′啟動子屬于可誘導(dǎo)型啟動子，這為構(gòu)建紅平菇誘導(dǎo)型表達載體提供了理論基礎(chǔ)。

1個漆酶cDNA全長基因和基因組DNA全長序列，這對于今后研究漆酶基因的同源表達、異源表達及蛋白質(zhì)的純化奠定了基礎(chǔ)。利用SEFA-PCR技術(shù)在紅平菇菌株中克隆1個漆酶5′啟動子序列，這對于今后研究紅平菇漆酶的表達調(diào)控具有十分重要的意義。

參考文獻：

[1]Baldrian P. Fungal laccases-occurrence and properties[J]. FEMS Microbiology Reviews，2006，30（2）：215-242.

[2]Faraco V，Giardina P，Sannia G. Metal-responsive elements in Pleurotus ostreatus laccase gene promoters[J]. Microbiology，2003，149（8）：2155-2162.

[3]Rushmore T H，King R G，Paulson K E. Regulation of glutathione S-transferase Ya subunit gene expression：identification of a unique xenobiotic-responsive element controlling inducible expression by planar aromatic compounds[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，1990，87（13）：3826-3830.

[4]Soden D M，Dobson A. Differential regulation of laccase gene expression in Pleurotus sajorcaju[J]. Microbiology，2008，147（8）：1755-1763.

[5]Xiao Y Z，Chen Q，Hang J，et al. Selective induction，purification and characterization of a laccase isozyme from the basidiomycete Trametes sp. AH28-2[J]. Mycologia，2010，96（1）：26-35.

[6]Marzluf G A. Genetic regulation of Nitrogen metabolism in the fungi[J]. Microbiological Reviews，1997，61（1）：17-32.

[7]陳 軍，高大文，池玉杰，等. 偏腫擬栓菌 Pseudotrametes gibbosa 產(chǎn)漆酶的條件優(yōu)化[J]. 菌物學(xué)報，2008，27（6）：940-946.

[8]Liu Y G，Chen Y L. High-efficiency thermal asymmetric interlaced PCR for amplification of unknown flanking sequences[J]. Biotechniques，2007，43（5）：649-650.

[9]Treger J M，Magee T R，Mcentee K. Functional analysis of the stress response element and its role in the multistress response of Saccharomyces cerevisiae[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications，1998，243（1）：13-19.

[10]Strauss J，Horvath H K，Abdallah B M，et al. The function of CreA，the carbon catabolite repressor of Aspergillus nidulans，is regulated at the transcriptiosl and post-transcriptional level[J]. Molecular Microbiology，1999，32（1）：169-178.