牦牛葡萄糖轉運蛋白和單羧酸轉運蛋白基因的克隆測序及在肌肉中的表達

金素鈺+王國生+徐亞歐+林亞秋+鄭玉才

摘要：采用RT-PCR方法克隆九龍牦牛（Bos grunniens）肌肉中葡萄糖轉運蛋白（GLUT）和單羧酸轉運蛋白（MCT）基因GlUT4、MCT1和MCT4的cDNA序列，并與普通牛（Bos taraus）進行基因序列和肌肉中mRNA水平的比較，以探索牦牛適應高原低氧的分子基礎。結果表明，GlUT4、MCT1和MCT4的核苷酸序列和推導的氨基酸序列與普通牛的相似性均在99.5%以上。實時熒光定量PCR分析顯示，成年九龍牦牛與黃牛背最長肌中GLUT4、MCT4基因 mRNA 水平無差別，而牦牛PMCT1基因mRNA水平顯著低于黃牛（P<0.05）。乳酸脫氫酶（LDH）總活力和同工酶譜測定結果表明，牦牛背最長肌中LDH總活力、LDH5比例顯著高于黃牛，顯示出更強的無氧酵解能力。結合MCT1基因mRNA水平的差異發現，牦牛背最長肌對乳酸的氧化代謝能力低于黃牛，更傾向于無氧酵解，與其適應高原低氧有關。

關鍵詞：九龍牦牛；葡萄糖轉運蛋白；單羧酸轉運蛋白；肌肉；低氧適應；基因表達

中圖分類號：S823.8+52 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2014）08-0029-03

牦牛（Bos grunniens）是青藏高原特有的牛種，對高寒、低氧等惡劣生態環境有良好的適應性。低氧環境能導致細胞多種能量代謝通路的適應性變化，例如無氧酵解增加，單位葡萄糖產生的能量減少，進而導致細胞膜葡萄糖轉運蛋白（GLUT）適應性增加。肌肉組織中最重要的GLUT家族成員包括GLUT1和GLUT4，其中GLUT4是肌肉和脂肪細胞中的主要葡萄糖轉運蛋白^[1]，存在于細胞內，受胰島素、運動和缺氧等因素影響^[2-3]。肌肉是產生乳酸的主要組織，氧化型肌纖維（紅肌）和心肌能以乳酸為燃料分子為機體提供能量^[4]。在乳酸轉運進入細胞的過程中，單羧酸轉運蛋白（MCT）發揮重要作用。MCT有多個家族成員，其中，在肌肉中表達的主要有MCT1、MCT2和MCT4，在乳酸轉運中發揮功能^[5-6]。MCT1在氧化型纖維中表達水平高，被認為在乳酸向細胞內轉運中發揮重要的作用^[5]。Jurie等研究表明，低氧適應能使肌肉組織在能量代謝方面更依賴于葡萄糖^[7]。因此，分析GLUT、MCT基因序列及其組織表達規律，對認識動物低氧適應的分子機制是重要的切入點。目前，關于暫時性缺氧對GLUT、MCT基因表達影響的研究已有不少，但對于低氧馴化的牦牛組織中GLUT、MCT還未見報道。因此，試驗假設長期的低氧適應可能導致牦牛GLUT、MCT基因序列或組織表達水平發生改變，重點分析九龍牦牛GLUT4、MCT1和MCT4的基因序列及其在肌肉中的表達特點，并與普通牛比較，以探索牦牛適應低氧環境的分子機制。

1 材料與方法

1.1 試驗動物及樣品采集

試驗所用九龍牦牛（Bos grunniens）樣品采自四川省甘孜州九龍縣，其中，0.5歲犢牛6頭，3.5～5.5歲牦牛10頭，7～10歲牦牛8頭。屠宰時，迅速采集背最長肌和股四頭肌，用錫箔紙包好，置于液氮內帶回實驗室，-80 ℃保存備用。另外，從四川省青白江市某屠宰場采集6頭成年黃牛背最長肌和股四頭肌樣本作為對照。

1.2 試劑及器材

主要儀器包括高速冷凍離心機（日立）、超聲波破碎儀（Sonics）、分光光度計（Cary 50，Varian）、電動勻漿器（PT-1200E，Kinematica）、凝膠成像系統（Gel Doc 2000，Bio-Rad）。熒光定量PCR試劑SYBR Premix Ex TaqTM（2×）購自TaKaRa公司；反轉錄試劑盒購自MBI公司；2×LongTaq Mix、Trizol試劑均購自天根公司。引物均由上海英駿生物技術有限公司合成。

1.3 牦牛GLUT4、MCT1和MCT4基因的克隆測序

取RNA 8 μL，用Random hexamer引物按Fermentas反轉錄試劑盒說明書進行反轉錄。根據GenBank中普通牛GLUT4、MCT1和MCT4基因mRNA序列（序列號依次為AY458600、BC104598和NM_001109980），用Primer premier 5.0軟件設計引物。GLUT4-F：5′-CTAAGACAAGATGCCGTCG-3′，GLUT4-R：5′-TCAGTCATGCTCATCTGG C-3′；MCT1-F：5′-CGAGCCGCGTATAACGAT-3′；MCT1-R：5′-CCACAGGTTCAAACTGGACTCT-3′，MCT4-F：5′-CTTGGAACAGCCTCTGTCA-3′，MCT4-R：5′-GAGCGTTGACGGTCTCTG-3′。預期片段長度：GLUT4為1 540 bp，MCT1為 1 574 bp，MCT4為1 483 bp。PCR反應體系：2×Long Taq Mix 12.5 μL，滅菌水 8.5 μL，正、反引物各1 μL，cDNA 2 μL。PCR條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃ 45 s，53 ℃（GLUT4）/55 ℃（MCT1）/56 ℃（MCT4）1 min，72 ℃ 2 min，共40個循環；72 ℃ 10 min。擴增產物用1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測，然后經膠回收試劑盒純化，按常規基因克隆技術進行克隆，每個基因的陽性克隆取3～5個菌液送上海英駿生物技術有限公司進行雙向測序。

1.4 定量PCR分析牦牛肌肉中GLUT4、MCT1和MCT4 mRNA 水平

根據獲得的九龍牦牛3個基因的cDNA序列，用Primer Premier 5.0軟件跨內含子設計引物。GLUT4-F1：5′-TGGGGACACTCAATCAACT-3′；GLUT4-R1：5′-TCAGCCAACACCTCAGACA-3′，MCT1-F1：5′-AAACGCTGATGGACCTTG-3′；MCT1-R2：5′-TATGCCACATGCCCAGTA-3′；MCT4-F1：5′-GTCCACTGCCAGCAACTAC-3′，MCT4-R1：5′-AGCACCAGCACAAGGGA-3′。內參基因的引物根據GenBank中普通牛GAPDH序列（NM_001034034）設計，GAPDH-F：5′-CACCCTCAAGATTGTCAGC-3′，GAPDH-R：5′-TCATAAGTCCCTCCACGAT-3′。根據熒光定量PCR試劑盒說明配制20 μL的反應體系，其中，正、反向引物各0.5 μL，cDNA 1 μL。PCR條件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 10 s，58 ℃（GLUT4、GAPDH）/62 ℃（MCT1、MCT4）10 s，72 ℃ 30 s，共45個循環。采用目的基因、內參基因的質粒作為標準品，制作標準曲線，目的基因的表達水平用內參基因校正。

1.5 肌肉組織LDH總活力及其同工酶譜分析

準確稱取0.2 g肌肉組織，加勻漿液（含10 mmol/L Tris、pH值為8.0，0.25 mol/L蔗糖，2 mmol/L EDTA）2.8 mL，用電動勻漿器在冰上勻漿30 s，取1 mL以轉速10 000 g于4 ℃離心10 min，參照Marchat等方法^[8]測定上清液LDH活力。酶活力的定義為：在25 ℃條件下，1 g新鮮組織1 min催化 1 μmol 底物轉化為1個單位。LDH同工酶采用非變性的聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，酶活性染色^[9]。

2 結果與分析

2.1 牦牛GLUT4、MCT1和MCT4基因的克隆測序

采用RT-PCR方法擴增九龍牦牛背最長肌的GLUT4、MCT1和MCT4基因，均得到1條特異的擴增條帶，并分別均與預期分子量大小相符（圖略）。測序結果證實得到了GLUT4、MCT1和MCT4等3個基因的編碼序列（CDS序列），并提交GenBank。

由表1可見，牦牛GLUT4基因（HM055486）CDS全長 1 530 bp，編碼509個氨基酸，與普通牛相比有5個堿基差異和1個氨基酸差異，牦牛第293位為Val（纈氨酸），而普通牛為Met（甲硫氨酸），核苷酸和氨基酸相似性分別為99.67%和99.8%；牦牛MCT1基因（HM061149）CDS全長1 506 bp，編碼501個氨基酸，與普通牛相比有6個堿基差異和2個氨基酸差異，牦牛第325位、354位分別為Iso（異亮氨酸）、Val（纈氨酸），而普通牛分別為Val、Iso，核苷酸和氨基酸相似性均為99.6%；牦牛MCT4基因（HM583655）CDS全長 1 386 bp，編碼460個氨基酸，與普通牛相比有6個堿基差異，核苷酸相似性為99.56%，但氨基酸序列完全相同。牦牛3個基因與普通牛的堿基差異類型主要是轉換。

2.2 牦牛肌肉GLUT4、MCT1、MCT4基因的發育譜

3個目的基因和內參基因的實時熒光定量PCR標準曲線擴增效率為94.5%～102.9%，符合分析要求。在牦牛背最長肌和股四頭肌中，GLUT4、MCT1、MCT4 mRNA水平在各年齡段（0.5、3.5～5.5、7～10歲）均無顯著差異。

2.3 牦牛與黃牛肌肉GLUT4、MCT1、MCT4基因表達比較

實時熒光定量PCR分析顯示，成年九龍牦牛（n=10）與黃牛（n=8）背最長肌中，GLUT4、MCT4 mRNA水平無差別，MCT1 mRNA水平黃牛顯著高于牦牛（P<0.05，圖1）；而在股四頭肌中，GLUT4、MCT1、MCT4的mRNA水平均未見顯著差異。

2.4 肌肉組織LDH活力和酶譜

試驗結果表明，牦牛背最長肌中LDH總活力顯著高于黃牛[牦牛（510±30） U/mg，黃牛（407±35） U/mg]，而腿肌中LDH總活力接近[牦牛（305±31） U/mg，黃牛（282±47） U/mg]。由圖2可見，牦牛背最長肌中LDH5的比例顯著高于黃牛，而LDH2比例極顯著低于黃牛。股四頭肌中LDH同工酶比例無顯著差異。

3 結論與討論

酸序列及推導的氨基酸序列與普通牛相似性很高，均在99.5%以上，與其他很多功能基因研究結果^[10-11]一致，這也說明牦牛與普通牛的親緣關系很近。牦牛和普通牛存在氨基酸差異的有2個基因GlUT4和MCT1，存在差異的氨基酸性質相似（Val、Iso、Met），推測這些氨基酸的變化對相應載體蛋白功能影響很小，GlUT4、MCT1和MCT4基因序列具有保守性。

年齡增長的變化趨勢，發現在骨骼肌中MCT1和MCT4 mRNA水平隨年齡增加而發生不同程度的改變^[12]；Kirat等研究發現MCT1在成年牛肝臟的表達量極顯著高于犢牛^[13]。本試驗結果與Hatta等研究結論存在差異，原因尚不清楚。

有關低氧刺激對GLUT、MCT基因表達影響的研究已有很多報道。Wood等研究發現，低氧能提高人的脂肪細胞GLUT1水平，但不會改變GLUT4水平^[14]。Ullah等研究了體外培養的細胞（HeLa、COS、HL-1）中MCT1、 MCT2、MCT4對缺氧刺激的反應，結果表明，MCT4 mRNA和蛋白質表達水平均增加，MCT1和MCT2水平未見變化^[15]。本研究中由于牦牛對低氧的長期馴化，相關能量代謝機制可能與暫時性缺氧有所不同。

MCT1在氧化型纖維中表達水平高，幫助乳酸向細胞內轉運，參與乳酸的氧化利用^[5]。McCullagh等研究了MCT1的表達，證實MCT1在紅肌的表達與肌肉中乳酸吸收相關，與檸檬酸合成酶活性呈相關（肌肉氧化能力的標志），這說明MCT1能促進肌纖維細胞對乳酸的吸收，與LDH（心型）及氧化代謝相關酶協同表達^[16]。由于LDH參與無氧酵解，而且LDH5傾向于將丙酮酸還原成乳酸^[17]。九龍牦牛背最長肌中MCT1 mRNA表達量顯著低于黃牛，背最長肌中LDH總活力、LDH5比例顯著高于黃牛，這說明牦牛背最長肌糖代謝中乳酸的氧化低于黃牛，更傾向于無氧酵解，與牦牛生活環境中的氧含量是相適應的。然而，由于肌肉組織中可表達多種MCT^[18]，因此，牦牛和黃牛對乳酸的利用及其轉運的分子基礎比較，需要更加精細和全面的分析。

本試驗結果初步表明，牦牛GLUT4、MCT1和MCT4基因序列與普通牛相似性高；與普通牛比較，牦牛背最長肌中較低的MCT1 mRNA水平與其較強的無氧代謝能力相吻合，可能是牦牛從分子水平上適應低氧環境的表現之一。

參考文獻：

[1]Ishiki M，Klip A. Minireview：recent developments in the regulation of glucose transporter-4 traffic：new signals，locations，and partners[J]. Endocrinology，2005，146（12）：5071-5078.

[2]Roy D，Marette A. Exercise induces the translocation of GLUT4 to transverse tubules from an intracellular pool in rat skeletal muscle[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications，1996，223（1）：147-152.

[3]Cartee G D，Douen A G，Ramlal T，et al. Stimulation of glucose transport in skeletal muscle by hypoxia[J]. Journal of Applied Physiology，1991，70（4）：1593-1600.

[4]Gladden L B. Lactate metabolism：a new paradigm for the third millennium[J]. The Journal of Physiology，2004，558（1）：5-30.

[5]Wilson M C，Jackson V N，Heddle C，et al. Lactic acid efflux from white skeletal muscle is catalyzed by the monocarboxylate transporter isoform MCT3[J]. Journal of Biological Chemistry，1998，273（26）：15920-15926.

[6]Dimmer K S，Friedrich B，Lang F，et al. The low-affinity monocarboxylate transporter MCT4 is adapted to the export of lactate in highly glycolytic cells[J]. The Biochemical Journal，2000，350（1）：219-227.

[7]Jurie C，Ortigues-Marty I，Picard B，et al. The separate effects of the nature of diet and grazing mobility on metabolic potential of muscles from Charolais steers[J]. Livestock Science，2006，104（1/2）：182-192.

[8]Marchat L，Loiseau P M，Petek F. Purification and characterization of lactate dehydrogenase isoenzymes 1 and 2 from Molinema dessetae（Nematoda：Filarioidea）[J]. Parasitology Research，1996，82（8）：672-680.

[9]He Q H，Hong J，Zheng Y C，et al. Cloning and sequence analysis of multiple splice variants of lactate dehydrogenase C in yak testes[J]. Journal of Reproduction and Development，2008，54（3）：229-232.

[10]Zhang L P，Ma B Y，Wu J P，et al. Cloning and characterization of the yak gene coding for calpastatin and in silico analysis of its putative product[J]. Acta Biochimica Polonica，2010，57（1）：35-41.

[11]Bai W L，Yin R H，Zheng Y C，et al. Cloning and molecular characterization of a yak α-lactalbumin cDNA from mammary tissue[J]. Livestock Science，2010，129（1/3）：122-128.

[12]Hatta H，Tonouchi M，Miskovic D，et al. Tissue-specific and isoform-specific changes in MCT1 and MCT4 in heart and soleus muscle during a 1-yr period[J]. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism，2001，281（4）：E749-E756.

[13]Kirat D，Inoue H，Iwano H，et al. Monocarboxylate transporter 1（MCT1）in the liver of pre-ruminant and adult bovines[J]. The Veterinary Journal，2007，173（1）：124-130.

[14]Wood I S，Wang Bohan，Lorente-Cebrián S，et al. Hypoxia increases expression of selective facilitative glucose transporters（GLUT）and 2-deoxy-D-glucose uptake in human adipocytes[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications，2007，361（2）：468-473.

[15]Ullah M S，Davies A J，Halestrap A P. The plasma membrane lactate transporter MCT4，but not MCT1，is up-regulated by hypoxia through a HIF-1α-dependent mechanism[J]. Journal of Biological Chemistry，2006，281（14）：9030-9037.

[16]Mccullagh K J，Poole R C，Halestrap A P，et al. Role of the lactate transporter（MCT1）in skeletal muscles[J]. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism，1996，271（1）：E143-E150.

[17]Holbrook J J，Liljas A，Steindel S J，et al. Lactate dehydrogenase[M]//Boyer P D. The enzymes. New York：Academic Press，1975：191-291.

[18]Bonen A，Heynen M，Hatta H. Distribution of monocarboxylate transporters MCT1-MCT8 in rat tissues and human skeletal muscle[J]. Applied Physiology，Nutrition，and Metabolism，2006，31（1）：31-39.

[14]Wood I S，Wang Bohan，Lorente-Cebrián S，et al. Hypoxia increases expression of selective facilitative glucose transporters（GLUT）and 2-deoxy-D-glucose uptake in human adipocytes[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications，2007，361（2）：468-473.

[15]Ullah M S，Davies A J，Halestrap A P. The plasma membrane lactate transporter MCT4，but not MCT1，is up-regulated by hypoxia through a HIF-1α-dependent mechanism[J]. Journal of Biological Chemistry，2006，281（14）：9030-9037.

[16]Mccullagh K J，Poole R C，Halestrap A P，et al. Role of the lactate transporter（MCT1）in skeletal muscles[J]. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism，1996，271（1）：E143-E150.

[17]Holbrook J J，Liljas A，Steindel S J，et al. Lactate dehydrogenase[M]//Boyer P D. The enzymes. New York：Academic Press，1975：191-291.

[18]Bonen A，Heynen M，Hatta H. Distribution of monocarboxylate transporters MCT1-MCT8 in rat tissues and human skeletal muscle[J]. Applied Physiology，Nutrition，and Metabolism，2006，31（1）：31-39.

[14]Wood I S，Wang Bohan，Lorente-Cebrián S，et al. Hypoxia increases expression of selective facilitative glucose transporters（GLUT）and 2-deoxy-D-glucose uptake in human adipocytes[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications，2007，361（2）：468-473.

[15]Ullah M S，Davies A J，Halestrap A P. The plasma membrane lactate transporter MCT4，but not MCT1，is up-regulated by hypoxia through a HIF-1α-dependent mechanism[J]. Journal of Biological Chemistry，2006，281（14）：9030-9037.

[16]Mccullagh K J，Poole R C，Halestrap A P，et al. Role of the lactate transporter（MCT1）in skeletal muscles[J]. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism，1996，271（1）：E143-E150.

[17]Holbrook J J，Liljas A，Steindel S J，et al. Lactate dehydrogenase[M]//Boyer P D. The enzymes. New York：Academic Press，1975：191-291.

[18]Bonen A，Heynen M，Hatta H. Distribution of monocarboxylate transporters MCT1-MCT8 in rat tissues and human skeletal muscle[J]. Applied Physiology，Nutrition，and Metabolism，2006，31（1）：31-39.