肉制品中驢源性成分PCR方法的建立及應用

郭鳳柳+熊蕊+劉曉慧+趙同欣+王娜+顏紅

摘要：建立了驢源性成分的快速分子檢測方法，確立了1對驢源性成分的特異性引物HorseF/HorseR，擴增目的片段的長度是294 bp，經驗證引物對驢源性成分的特異性良好，確立了PCR反應的最佳反應體系和最優反應條件。反應體系的檢測靈敏度是13.7 pg/μL。擴增片段經AluⅠ酶切分析確認，所得181、113 bp片段與分析結果一致。利用該方法對市售樣品進行檢測，檢測結果準確。

關鍵詞：驢源性成分；檢測；PCR反應；肉品貿易；造假檢測

中圖分類號：S851.34 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2014）08-0035-04

隨著人們生活水平的提高，對肉的要求也越來越高，而目前國內市場上在肉和肉制品的生產與銷售中，一些不法商家或個人利用摻雜摻假、以次充好等手段欺騙消費者以牟取暴利的事件屢屢出現。我國食品工業飛速發展，食品摻假方式越來越多，范圍越來越廣，內容越來越復雜。一些不法商家或個人為了追求自身利益以低價、劣質肉冒充高價、優質肉^[1]，如用雞肉冒充豬肉，用豬肉、鴨肉冒充牛肉、羊肉等造假行為最為常見。這不僅涉及經濟、營養價值和食品安全等問題，更直接影響消費者健康。此外，在清真食品中摻雜豬肉等行為還涉及宗教信仰等問題。因此，對食品中原料肉進行摻假、摻雜檢驗十分必要，其重點就是快速、準確鑒定肉制品品種。

保定驢肉火燒是著名小吃，和“保定三寶”并駕齊驅。驢肉中富含人體必需的氨基酸和脂肪酸，是一種高蛋白、低脂肪的營養食物。此外，驢肉中礦物元素鐵含量高于其他畜禽肉，其食用價值高、營養豐富、味道鮮美，值得大力開發研究和推廣^[2]。也是由于上述原因，驢肉在人們日常生活中的需求量越來越大，價格越來越高，致使其摻假問題也越來越普遍，因此肉種類鑒定是食品分析的一個重要方面。PCR技術是食品中肉類成分鑒別的主流技術，研究對象集中在市場上常見的羊肉、牛肉、豬肉、雞肉上，目前還沒有關于驢源性成分PCR檢測方法的報道。本研究合成了1對用于檢測驢源性成分的特異性引物，通過對反應體系的摸索及反應條件的優化，驗證了該方法的特異性與靈敏度，建立了鑒定驢源性成分的PCR技術，旨在為杜絕食品貿易中的欺騙行為提供檢測方法。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

蛋白酶K、RNA酶、dNTPs、10×PCR緩沖液、MgCl2、Taq DNA聚合酶、2 000 bp ladder DNA marker、DNA瓊脂糖凝膠回收試劑盒以及血液、細胞、組織基因組DNA提取試劑盒等均購自北京天根生化科技有限公司；Sau3AⅠ、AluⅠ限制性內切酶購自寶生物工程有限公司。引物合成及序列測定均由生工生物工程（上海）股份有限公司完成；其他試劑均為國產分析純。

試驗儀器：進口ABI梯度PCR擴增儀、凝膠成像儀及電泳系統、sigma臺式離心機。

1.2 PCR引物

合成1對特異性引物，用高壓滅菌后的超純水溶解，配制成100 mol/L的儲備液。引物序列：上游引物序列為5′-TGCCACAGTTGGATACATCAAC-3′；下游引物序列為5′-ATTGAGATTAGGCGATTGTT-3′；擴增目的條帶長294 bp。

1.3 樣本總DNA的提取

驢肉基因組DNA提取根據血液、細胞、組織基因組DNA提取試劑盒說明書進行。取適量基因組DNA在紫外分光光度計下檢測其濃度和純度。當D260 nm/D280 nm為1.7～1.9時，DNA純度才適宜進行PCR擴增。

1.4 目的條帶擴增

PCR反應體系：10×PCR反應緩沖液（Mg2+ free）5 μL，25 mmol/L MgCl2 3 μL，2.5 mmol/L 4×dNTPs 4 μL，引物HorseF和HorseR（10 μmol/L）各1 μL，DNA 模板10 μL，Taq DNA聚合酶（5 U/μL）0.3 μL，補足無菌超純水到25 μL。

PCR反應條件：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性60 s，56 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，35個循環；72 ℃延伸5 min。結束后4 ℃保存。

PCR結束后用2%瓊脂糖凝膠，TAE電泳緩沖系統，9 V/cm 恒壓電泳，2 000 bp ladder作為分子量對照對目的條帶進行檢測。

1.5 目的條帶Sau3AⅠ、AluⅠ的酶切鑒定及測序

由于目的條帶可能是馬源性成分，因此對擴增產物要用馬源性成分的限制性內切酶Sau3AⅠ進行酶切，片段大小分別是226、68 bp。驢源性成分的PCR擴增產物經限制性內切酶AluⅠ進行酶切，片段大小分別是113、181 bp。

用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收目的條帶，將其進行酶切反應，體系為：Sau3AⅠ/AluⅠ1 μL，10×H Buffer 5 μL，PCR回收產物20 μL，用無菌ddH2O補足到50 μL。將反應體系配制好后放入37 ℃溫浴1 h后65 ℃溫浴5 min終止反應，酶切產物用2.5%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測。

將回收的目的條帶交由生工生物工程（上海）股份有限公司進行序列測定，序列校對后，在GenBank中進行Blastn比對分析，驗證所得片段。

1.6 檢測體系的靈敏度、特異性檢測

1.6.1 靈敏性檢測

將熟驢肉的DNA模板依次進行10倍梯度稀釋，直到10-6，每個稀釋度各取2 μL作為模板，進行PCR擴增，同時設立陰性對照、陽性對照，電泳檢測。

1.6.2 特異性檢測

取已制備的牛、羊、狗、兔、羊、鴨等15種動物肉的DNA各0.1 μg作為模板，加入體系中進行擴增，同時設立陽性對照及空白對照，電泳檢測。

1.7 市售肉制品檢測

購置市售驢肉火燒、驢肉大餅和真空袋包裝的驢肉樣品，提取其DNA，用已建立的檢測方法進行PCR擴增鑒定。

2 結果與分析

2.1 基因組提取和引物擴增結果

對熟驢肉提取的基因組DNA的D260 nm/D280 nm值均為 1.7～1.9，說明質量較好，可以用于下游試驗操作。引物對驢肉的基因組DNA擴增出了目的條帶（圖1），目的條帶回收后的酶切效果也較好（圖2），得到了181、113 bp的條帶。擴增的目的片段測序結果經校對后，在NCBI中經 Blastn分析，結果表明該片段的核苷酸序列與GenBank中已登記的Equus asinus（家驢）的相似性是100%，與Equus hemionus（野驢）等基因序列的相似性大于95 %，證明所得片段為目的片段。

2.2 PCR反應的靈敏度

驢肉提取的DNA濃度是68.5 ng/μL，將提取的DNA進行10～106倍梯度稀釋后，如圖4所示，在模板稀釋104倍后再未出現反應條帶，因此反應體系的靈敏度是 13.7 pg/μL。

2.3 PCR反應的特異性

引物對驢肉的基因組DNA擴增出了目的條帶。如圖5所示，引物對其他動物的DNA沒有擴增出條帶，但是對羊、狗的基因組也擴增出了相似條帶。如圖6所示，進一步進行酶切驗證，結果沒有得到正確的酶切結果，表明引物的特異性較高。

3 結論與討論

肉類檢測方法有多種多樣，其中ELISA技術應用較多，ELISA技術是將抗原、抗體反應的高度特異性和酶的高效催化作用相結合發展建立的一種免疫分析方法^[3]，但是該方法有一定的局限性：首先要有足夠的抗體供檢測分析；其次肉類食品在加工過程中經過加熱、高壓、輻射等處理，蛋白遭到破壞，不適合用ELISA方法檢測。DNA分子分布廣泛、結構穩定，作為遺傳信息的載體，分子結構中攜帶了豐富的種源特異性信息^[4]，DNA檢測是目前物種鑒定的最有效手段^[5-8]。DNA鑒定主要是通過PCR反應來實現。目前還沒有驢肉檢測方法，一般是憑色澤、紋理等簡單方法進行辨認，因此需要找到具有說服力的檢測方法。本研究使用的PCR方法靈敏度高、特異性強、速度快。

肉類產品放置1、2、9、16 d后，DNA片段會由3萬bp降解到1.6萬bp。加熱到80 ℃，DNA片段長度不受影響，而達到100 ℃則DNA長度銳減至1 100 bp，加熱至120 ℃減至600 bp以下。市售驢肉多經過高壓處理，因此本研究中選擇294 bp的短片段，這樣即使經過高壓處理，肉中模板DNA也不被破壞而出現假陰性結果。

引物是根據驢肉線粒體DNA設計合成的，因此具有高度的特異性，本研究表明，引物對其他動物的基因組DNA沒有擴增到可以酶切到目的片段的PCR產物，因此該檢測技術具有高度的特異性。

參考文獻：

[1]劉帥帥，李 宏，羅世芝，等. PCR技術在肉類摻假檢驗中的應用進展[J]. 食品安全質量檢測學報，2011，2（6）：280-284.

[2]尤 娟，羅永康，張巖春，等. 驢肉主要營養成分及與其它畜禽肉的分析比較[J]. 肉類研究，2008（7）：20-22.

[3]張占軍，王富花. 酶聯免疫吸附技術及其在食品安全檢測中的應用[J]. 食品研究與開發，2011，32（1）：157-160.

[4]Fajardo V，Gonzalez I，Rojas M，et al. A review of current PCR-based methodologies for the authentication of meats from game animal species[J]. Trends in Food Science & Technology，2010，21（8）：408-421.

[5]王 薇，王利麗，熊莉麗，等. ITS序列作為DNA條形碼在蟲草鑒定及系統發育關系中的研究與應用[J]. 江蘇農業學報，2012，28（3）：680-682.

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[7]田慧敏，劉鐵志. DNA分子標記技術在紅菇分子鑒定中的應用進展[J]. 江蘇農業科學，2013，41（4）：28-31.

[8]Lockley A K，Bardsley R G. DNA-based methods for food authentication[J]. Trends in Food Science & Technology，2000，11（2）：67-77.

1.7 市售肉制品檢測

購置市售驢肉火燒、驢肉大餅和真空袋包裝的驢肉樣品，提取其DNA，用已建立的檢測方法進行PCR擴增鑒定。

2 結果與分析

2.1 基因組提取和引物擴增結果

對熟驢肉提取的基因組DNA的D260 nm/D280 nm值均為 1.7～1.9，說明質量較好，可以用于下游試驗操作。引物對驢肉的基因組DNA擴增出了目的條帶（圖1），目的條帶回收后的酶切效果也較好（圖2），得到了181、113 bp的條帶。擴增的目的片段測序結果經校對后，在NCBI中經 Blastn分析，結果表明該片段的核苷酸序列與GenBank中已登記的Equus asinus（家驢）的相似性是100%，與Equus hemionus（野驢）等基因序列的相似性大于95 %，證明所得片段為目的片段。

2.2 PCR反應的靈敏度

驢肉提取的DNA濃度是68.5 ng/μL，將提取的DNA進行10～106倍梯度稀釋后，如圖4所示，在模板稀釋104倍后再未出現反應條帶，因此反應體系的靈敏度是 13.7 pg/μL。

2.3 PCR反應的特異性

引物對驢肉的基因組DNA擴增出了目的條帶。如圖5所示，引物對其他動物的DNA沒有擴增出條帶，但是對羊、狗的基因組也擴增出了相似條帶。如圖6所示，進一步進行酶切驗證，結果沒有得到正確的酶切結果，表明引物的特異性較高。

3 結論與討論

肉類檢測方法有多種多樣，其中ELISA技術應用較多，ELISA技術是將抗原、抗體反應的高度特異性和酶的高效催化作用相結合發展建立的一種免疫分析方法^[3]，但是該方法有一定的局限性：首先要有足夠的抗體供檢測分析；其次肉類食品在加工過程中經過加熱、高壓、輻射等處理，蛋白遭到破壞，不適合用ELISA方法檢測。DNA分子分布廣泛、結構穩定，作為遺傳信息的載體，分子結構中攜帶了豐富的種源特異性信息^[4]，DNA檢測是目前物種鑒定的最有效手段^[5-8]。DNA鑒定主要是通過PCR反應來實現。目前還沒有驢肉檢測方法，一般是憑色澤、紋理等簡單方法進行辨認，因此需要找到具有說服力的檢測方法。本研究使用的PCR方法靈敏度高、特異性強、速度快。

肉類產品放置1、2、9、16 d后，DNA片段會由3萬bp降解到1.6萬bp。加熱到80 ℃，DNA片段長度不受影響，而達到100 ℃則DNA長度銳減至1 100 bp，加熱至120 ℃減至600 bp以下。市售驢肉多經過高壓處理，因此本研究中選擇294 bp的短片段，這樣即使經過高壓處理，肉中模板DNA也不被破壞而出現假陰性結果。

引物是根據驢肉線粒體DNA設計合成的，因此具有高度的特異性，本研究表明，引物對其他動物的基因組DNA沒有擴增到可以酶切到目的片段的PCR產物，因此該檢測技術具有高度的特異性。

參考文獻：

[1]劉帥帥，李 宏，羅世芝，等. PCR技術在肉類摻假檢驗中的應用進展[J]. 食品安全質量檢測學報，2011，2（6）：280-284.

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[8]Lockley A K，Bardsley R G. DNA-based methods for food authentication[J]. Trends in Food Science & Technology，2000，11（2）：67-77.

1.7 市售肉制品檢測

購置市售驢肉火燒、驢肉大餅和真空袋包裝的驢肉樣品，提取其DNA，用已建立的檢測方法進行PCR擴增鑒定。

2 結果與分析

2.1 基因組提取和引物擴增結果

對熟驢肉提取的基因組DNA的D260 nm/D280 nm值均為 1.7～1.9，說明質量較好，可以用于下游試驗操作。引物對驢肉的基因組DNA擴增出了目的條帶（圖1），目的條帶回收后的酶切效果也較好（圖2），得到了181、113 bp的條帶。擴增的目的片段測序結果經校對后，在NCBI中經 Blastn分析，結果表明該片段的核苷酸序列與GenBank中已登記的Equus asinus（家驢）的相似性是100%，與Equus hemionus（野驢）等基因序列的相似性大于95 %，證明所得片段為目的片段。

2.2 PCR反應的靈敏度

驢肉提取的DNA濃度是68.5 ng/μL，將提取的DNA進行10～106倍梯度稀釋后，如圖4所示，在模板稀釋104倍后再未出現反應條帶，因此反應體系的靈敏度是 13.7 pg/μL。

2.3 PCR反應的特異性

引物對驢肉的基因組DNA擴增出了目的條帶。如圖5所示，引物對其他動物的DNA沒有擴增出條帶，但是對羊、狗的基因組也擴增出了相似條帶。如圖6所示，進一步進行酶切驗證，結果沒有得到正確的酶切結果，表明引物的特異性較高。

3 結論與討論

肉類檢測方法有多種多樣，其中ELISA技術應用較多，ELISA技術是將抗原、抗體反應的高度特異性和酶的高效催化作用相結合發展建立的一種免疫分析方法^[3]，但是該方法有一定的局限性：首先要有足夠的抗體供檢測分析；其次肉類食品在加工過程中經過加熱、高壓、輻射等處理，蛋白遭到破壞，不適合用ELISA方法檢測。DNA分子分布廣泛、結構穩定，作為遺傳信息的載體，分子結構中攜帶了豐富的種源特異性信息^[4]，DNA檢測是目前物種鑒定的最有效手段^[5-8]。DNA鑒定主要是通過PCR反應來實現。目前還沒有驢肉檢測方法，一般是憑色澤、紋理等簡單方法進行辨認，因此需要找到具有說服力的檢測方法。本研究使用的PCR方法靈敏度高、特異性強、速度快。

肉類產品放置1、2、9、16 d后，DNA片段會由3萬bp降解到1.6萬bp。加熱到80 ℃，DNA片段長度不受影響，而達到100 ℃則DNA長度銳減至1 100 bp，加熱至120 ℃減至600 bp以下。市售驢肉多經過高壓處理，因此本研究中選擇294 bp的短片段，這樣即使經過高壓處理，肉中模板DNA也不被破壞而出現假陰性結果。

引物是根據驢肉線粒體DNA設計合成的，因此具有高度的特異性，本研究表明，引物對其他動物的基因組DNA沒有擴增到可以酶切到目的片段的PCR產物，因此該檢測技術具有高度的特異性。

參考文獻：

[1]劉帥帥，李 宏，羅世芝，等. PCR技術在肉類摻假檢驗中的應用進展[J]. 食品安全質量檢測學報，2011，2（6）：280-284.

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[5]王 薇，王利麗，熊莉麗，等. ITS序列作為DNA條形碼在蟲草鑒定及系統發育關系中的研究與應用[J]. 江蘇農業學報，2012，28（3）：680-682.

[6]Aida A A，Man Y B，Wong C M，et al. Analysis of raw meats and fats of pigs using polymerase chain reaction for halal authentication[J]. Meat Science，2005，69（1）：47-52.

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[8]Lockley A K，Bardsley R G. DNA-based methods for food authentication[J]. Trends in Food Science & Technology，2000，11（2）：67-77.