高原習(xí)服黃牛腦組織不同部位SLC25A6 mRNA絕對(duì)定量分析

王志強(qiáng)+俞紅賢+荊海霞+張勤文+魏青+梁林+牛亮

摘要：為研究SLC25A6 mRNA在高原習(xí)服黃牛腦組織中的表達(dá)量對(duì)能量利用的影響，建立用于SLC25A6基因絕對(duì)定量的標(biāo)準(zhǔn)曲線；標(biāo)準(zhǔn)曲線擴(kuò)增效率為E=104.9%，回歸系數(shù)r值為-0.996，斜率為-3.210，溶解曲線峰值單一；絕對(duì)定量檢測(cè)值表明，高原習(xí)服黃牛腦組織各部位SLC25A6 mRNA表達(dá)量總體差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，SLC25A6 mRNA檢測(cè)值從高至低依次為小腦、海馬、枕葉、額葉、顳葉、頂葉，小腦SLC25A6基因表達(dá)量顯著高于其他各組織；頂葉表達(dá)量最低，小腦表達(dá)量為頂葉表達(dá)量的2.79倍；額葉、顳葉、頂葉之間差異，枕葉、海馬之間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果表明，高原習(xí)服黃牛腦組織中小腦耗能強(qiáng)度可能最大，細(xì)胞活動(dòng)旺盛；相反頂葉耗能強(qiáng)度最低。

關(guān)鍵詞：高原習(xí)服黃牛；腦組織；線粒體；SLC25A6基因；ANT3；絕對(duì)定量

中圖分類號(hào)：S852.16+1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-1302（2014）08-0039-03

青藏高原平均海拔在4 500 m左右，大氣壓及氧分壓較低，高寒干燥、紫外輻射強(qiáng)度大，特殊的地理及氣候條件造就了特殊的生態(tài)環(huán)境；由于獨(dú)特的高原環(huán)境長(zhǎng)期影響，使得土著動(dòng)物及人類在機(jī)體各個(gè)方面形成了對(duì)高原環(huán)境的低氧適應(yīng)。機(jī)體獲取的氧氣最終通過(guò)線粒體被利用，糖類、脂肪、氨基酸在細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中完成糖酵解過(guò)程后，通過(guò)線粒體的三羧酸循環(huán)及氧化磷酸化途徑，利用組織氧生成三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP），從而為機(jī)體提供能量。

動(dòng)物及人由低海拔地區(qū)進(jìn)入高海拔地區(qū)后，機(jī)體會(huì)通過(guò)代償?shù)确绞絹?lái)適應(yīng)低氧環(huán)境，從而減輕缺氧初期出現(xiàn)的癥狀，促使機(jī)體產(chǎn)生高原習(xí)服。研究表明，哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)對(duì)氧分壓的改變極為敏感，腦組織不同區(qū)域會(huì)通過(guò)分子、細(xì)胞等各個(gè)水平的改變來(lái)適應(yīng)低氧^[1]。但急性低氧暴露仍會(huì)損傷腦組織，造成神經(jīng)細(xì)胞出現(xiàn)散在性壞死等現(xiàn)象^[2]。急性重復(fù)性低氧刺激可使腦組織線粒體功能受到抑制，同時(shí)提高腦組織ATP相對(duì)水平^[3]。低氧預(yù)適應(yīng)能夠減輕腦組織缺血后海馬細(xì)胞凋亡數(shù)^[4]，提高線粒體的膜電位、減少線粒體活性氧及一氧化氮的產(chǎn)生^[5]，并通過(guò)降低線粒體通透性轉(zhuǎn)變的概率來(lái)減少細(xì)胞凋亡數(shù)^[6]。

研究表明，線粒體內(nèi)膜上的腺甘酸轉(zhuǎn)運(yùn)體（adenine nucleotide translocator，ANT）能夠促進(jìn)胞質(zhì)和線粒體之間二磷酸腺苷（adenosine diphosphate，ADP）與ATP的交換，使能量代謝順利進(jìn)行；而且ANT的4種異構(gòu)體均與細(xì)胞凋亡途徑有關(guān)^[7]，由SLC25A6基因編碼的線粒體內(nèi)膜蛋白ANT3表達(dá)量增高可引起線粒體膜通透性的改變，從而誘發(fā)細(xì)胞凋亡^[8-9]。

應(yīng)用絕對(duì)定量的方法，對(duì)高原習(xí)服黃牛SLC25A6 mRNA在腦組織不同部位的表達(dá)情況進(jìn)行研究，以期揭示低氧環(huán)境對(duì)高原習(xí)服黃牛腦組織不同部位能量代謝的影響，為哺乳動(dòng)物低氧適應(yīng)的分子機(jī)制及高原醫(yī)學(xué)積累基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物來(lái)源及樣品處理

于青海省海晏縣（海拔3 000 m左右）選取臨床健康成年高原習(xí)服黃牛，頸動(dòng)脈放血致死后，迅速取大腦額葉、顳葉、頂葉、枕葉、海馬及小腦皮層樣本，將其置于液氮中低溫保存，用于提取總RNA。

1.2 主要儀器與試劑

低溫高速離心機(jī)、普通PCR擴(kuò)增儀、核酸電泳儀、紫外凝膠成像儀、核酸蛋白檢測(cè)儀、real-time PCR擴(kuò)增儀；2×Taq PCR MasterMix（含染料）、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒，均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；TaKaRa SYBR Premix Ex Taq Ⅱ、PMD19-T Vector，均購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；RNAsimple Total RNA Kti試劑盒、FastQuant cDNA第一鏈合成試劑盒，均購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司、質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒、EcoRⅠ，均購(gòu)自上海生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 設(shè)計(jì)并合成引物 通過(guò)美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心查詢普通牛（Bos taurus）SLC25A6基因的mRNA序列（NM_174660.2），根據(jù)其序列利用DNAMAN、Primer5設(shè)計(jì)特異性引物（表1），預(yù)計(jì)擴(kuò)增目的基因片段長(zhǎng)度為95 bp。引物設(shè)計(jì)后交由上海生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.3.2 總RNA的提取及RT-PCR反應(yīng) 利用RNAsimple Total RNA Kti試劑盒，按照說(shuō)明書(shū)步驟，提取高原習(xí)服黃牛總RNA。

1.3.3 絕對(duì)定量標(biāo)準(zhǔn)品的制備

1.3.3.1 SLC25A6基因片段擴(kuò)增 以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，PCR反應(yīng)加樣體系如下：模板1 μL，濃度為10 μmol/L的上、下游引物各0.5 μL，ddH2O2 10.5 μL，Solarbio 2×Taq PCR MasterMix（含染料）12.5 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s， 72 ℃ 延伸30 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 4 min充分延伸。產(chǎn)物以1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.3.3.2 克隆SLC25A6基因片段并驗(yàn)證 利用Solarbio 瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒進(jìn)行PCR產(chǎn)物純化，純化產(chǎn)物與PMD19-T Vector在 16 ℃條件下連接1 h。后經(jīng)42 ℃熱擊及冰浴等反應(yīng)與E.coil DH5α感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行連接，將菌液均勻涂布于含氨芐青霉素、半乳糖苷酶和異丙基硫代半乳糖苷的LB固體培養(yǎng)基平板上，37 ℃溫箱中培養(yǎng)12 h。挑取白色陽(yáng)性單菌落，接種于含Amp的LB液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)12 h。利用通用引物對(duì)菌液進(jìn)行PCR初步鑒定后，對(duì)陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行測(cè)序以進(jìn)一步驗(yàn)證。

1.3.3.3 質(zhì)粒DNA抽提、酶切及純化 利用質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒對(duì)鑒定正確的陽(yáng)性菌液進(jìn)行質(zhì)粒提取。通過(guò)EcoRⅠ對(duì)抽提的質(zhì)粒進(jìn)行酶切37 ℃孵育1 h后，65 ℃ 20 min 使酶失活。將酶切好的質(zhì)粒DNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并利用solarbio 瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒對(duì)目標(biāo)DNA條帶進(jìn)行回收純化，從而去除酶切不完全的環(huán)狀質(zhì)粒。

1.3.3.4 質(zhì)粒DNA濃度測(cè)定及梯度稀釋 利用核酸蛋白檢測(cè)儀對(duì)純化后的線性質(zhì)粒進(jìn)行濃度測(cè)定。根據(jù)公式：質(zhì)粒拷貝數(shù)（拷貝數(shù)/μL）=6.02×1023（拷貝數(shù)/mol） ×質(zhì)粒濃度（g/μL）/質(zhì)粒分子量（g/mol），得出質(zhì)粒拷貝數(shù)，然后將質(zhì)粒進(jìn)行10倍梯度稀釋，分別稀釋成1×108～1×102拷貝數(shù)/μL的7個(gè)梯度，作為標(biāo)準(zhǔn)品。

1.3.4 real-time PCR反應(yīng) real-time PCR擴(kuò)增反應(yīng)的加樣體系如下：模板2 μL，濃度為10 μmol/L的上、下游引物各1 μL，ddH2O2 8.5 μL，SYBR Premix Ex Taq Ⅱ12.5 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s。首先將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA上機(jī)后進(jìn)行1個(gè)循環(huán)，使cDNA由單鏈變?yōu)殡p鏈，后與標(biāo)準(zhǔn)品一同進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。待測(cè)樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 總RNA檢測(cè)結(jié)果

利用BIO-RAD核酸蛋白檢測(cè)儀測(cè)定RNA純度及濃度，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2，各項(xiàng)指標(biāo)均符合要求。凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖1，泳道自左至右以此為：額葉、顳葉、頂葉、枕葉、小腦及海馬，18S及28S條帶清晰，并無(wú)降解現(xiàn)象出現(xiàn)。

2.4 高原習(xí)服黃牛腦組織內(nèi)SLC25A6基因mRNA表達(dá)量

通過(guò)反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄時(shí)，20 μL的反轉(zhuǎn)錄體系中共加入了1 μg的總RNA，而進(jìn)行Real-time PCR時(shí)，反應(yīng)體系中加入了2 μL反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線中CT值與基因拷貝數(shù)的關(guān)系，換算出SLC25A6基因在總RNA/μg中的絕對(duì)表達(dá)量。高原習(xí)服黃牛腦組織內(nèi)SLC25A6基因mRNA表達(dá)量見(jiàn)表3、圖5。高原習(xí)服黃牛腦組織中小腦SLC25A6基因表達(dá)量最高，拷貝數(shù)均值為3.683×107拷貝數(shù)/μg，顯著高于其他各組織；頂葉表達(dá)量最低，小腦表達(dá)量為頂葉表達(dá)量的2.79倍；顳葉與枕葉、海馬表達(dá)量均值之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；頂葉與枕葉、海馬表達(dá)量均值之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；額葉、顳葉、頂葉均值之間差異，枕葉與海馬之間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

度地利用氧，并產(chǎn)生盡可能多的能量；腦組織的缺氧適應(yīng)能夠使損壞腦細(xì)胞的不良因素得到抑制或調(diào)整，使腦組織在不良環(huán)境下度過(guò)危險(xiǎn)期^[10]。ANT在能量代謝中發(fā)揮著重要作用，本試驗(yàn)通過(guò)測(cè)定SLC25A6基因在高原習(xí)服黃牛腦組織中的表達(dá)情況，間接反映腦組織不同部位在高原低氧習(xí)服情況下對(duì)能量的利用情況。

由于反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA為單鏈，而標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒為雙鏈，所以進(jìn)行Real-time PCR時(shí)，先將cDNA進(jìn)行1個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增，使其變?yōu)殡p鏈，后與標(biāo)準(zhǔn)品一同進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，以避免單鏈與雙鏈之間的差異^[11]。試驗(yàn)結(jié)果表明，標(biāo)準(zhǔn)曲線的擴(kuò)增效率為E=104.9%，回歸系數(shù)r=-0.996，斜率為-3.210，溶解曲線峰值單一。從這些參數(shù)可以看出標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系良好，引物特異性較強(qiáng)。結(jié)果能夠真實(shí)反映出SLC25A6基因在高原習(xí)服黃牛腦組織中的實(shí)際拷貝數(shù)。

本研究結(jié)果表明，在高原習(xí)服黃牛腦組織中SLC25A6基因的表達(dá)量從高到低依次為小腦、海馬、枕葉、額葉、顳葉、頂葉，小腦表達(dá)量顯著高于其組織，小腦SLC25A6基因表達(dá)量為額葉表達(dá)量的2.79倍。頂葉消耗能量強(qiáng)度較低，細(xì)胞能量代謝較弱，小腦消耗能量強(qiáng)度較大，細(xì)胞能量代謝較強(qiáng)。可以推斷頂葉為低氧環(huán)境敏感區(qū)域，小腦抗低氧能力較強(qiáng)。

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1.3.3.3 質(zhì)粒DNA抽提、酶切及純化 利用質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒對(duì)鑒定正確的陽(yáng)性菌液進(jìn)行質(zhì)粒提取。通過(guò)EcoRⅠ對(duì)抽提的質(zhì)粒進(jìn)行酶切37 ℃孵育1 h后，65 ℃ 20 min 使酶失活。將酶切好的質(zhì)粒DNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并利用solarbio 瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒對(duì)目標(biāo)DNA條帶進(jìn)行回收純化，從而去除酶切不完全的環(huán)狀質(zhì)粒。

1.3.3.4 質(zhì)粒DNA濃度測(cè)定及梯度稀釋 利用核酸蛋白檢測(cè)儀對(duì)純化后的線性質(zhì)粒進(jìn)行濃度測(cè)定。根據(jù)公式：質(zhì)粒拷貝數(shù)（拷貝數(shù)/μL）=6.02×1023（拷貝數(shù)/mol） ×質(zhì)粒濃度（g/μL）/質(zhì)粒分子量（g/mol），得出質(zhì)粒拷貝數(shù)，然后將質(zhì)粒進(jìn)行10倍梯度稀釋，分別稀釋成1×108～1×102拷貝數(shù)/μL的7個(gè)梯度，作為標(biāo)準(zhǔn)品。

1.3.4 real-time PCR反應(yīng) real-time PCR擴(kuò)增反應(yīng)的加樣體系如下：模板2 μL，濃度為10 μmol/L的上、下游引物各1 μL，ddH2O2 8.5 μL，SYBR Premix Ex Taq Ⅱ12.5 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s。首先將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA上機(jī)后進(jìn)行1個(gè)循環(huán)，使cDNA由單鏈變?yōu)殡p鏈，后與標(biāo)準(zhǔn)品一同進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。待測(cè)樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 總RNA檢測(cè)結(jié)果

利用BIO-RAD核酸蛋白檢測(cè)儀測(cè)定RNA純度及濃度，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2，各項(xiàng)指標(biāo)均符合要求。凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖1，泳道自左至右以此為：額葉、顳葉、頂葉、枕葉、小腦及海馬，18S及28S條帶清晰，并無(wú)降解現(xiàn)象出現(xiàn)。

2.4 高原習(xí)服黃牛腦組織內(nèi)SLC25A6基因mRNA表達(dá)量

通過(guò)反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄時(shí)，20 μL的反轉(zhuǎn)錄體系中共加入了1 μg的總RNA，而進(jìn)行Real-time PCR時(shí)，反應(yīng)體系中加入了2 μL反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線中CT值與基因拷貝數(shù)的關(guān)系，換算出SLC25A6基因在總RNA/μg中的絕對(duì)表達(dá)量。高原習(xí)服黃牛腦組織內(nèi)SLC25A6基因mRNA表達(dá)量見(jiàn)表3、圖5。高原習(xí)服黃牛腦組織中小腦SLC25A6基因表達(dá)量最高，拷貝數(shù)均值為3.683×107拷貝數(shù)/μg，顯著高于其他各組織；頂葉表達(dá)量最低，小腦表達(dá)量為頂葉表達(dá)量的2.79倍；顳葉與枕葉、海馬表達(dá)量均值之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；頂葉與枕葉、海馬表達(dá)量均值之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；額葉、顳葉、頂葉均值之間差異，枕葉與海馬之間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

度地利用氧，并產(chǎn)生盡可能多的能量；腦組織的缺氧適應(yīng)能夠使損壞腦細(xì)胞的不良因素得到抑制或調(diào)整，使腦組織在不良環(huán)境下度過(guò)危險(xiǎn)期^[10]。ANT在能量代謝中發(fā)揮著重要作用，本試驗(yàn)通過(guò)測(cè)定SLC25A6基因在高原習(xí)服黃牛腦組織中的表達(dá)情況，間接反映腦組織不同部位在高原低氧習(xí)服情況下對(duì)能量的利用情況。

由于反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA為單鏈，而標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒為雙鏈，所以進(jìn)行Real-time PCR時(shí)，先將cDNA進(jìn)行1個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增，使其變?yōu)殡p鏈，后與標(biāo)準(zhǔn)品一同進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，以避免單鏈與雙鏈之間的差異^[11]。試驗(yàn)結(jié)果表明，標(biāo)準(zhǔn)曲線的擴(kuò)增效率為E=104.9%，回歸系數(shù)r=-0.996，斜率為-3.210，溶解曲線峰值單一。從這些參數(shù)可以看出標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系良好，引物特異性較強(qiáng)。結(jié)果能夠真實(shí)反映出SLC25A6基因在高原習(xí)服黃牛腦組織中的實(shí)際拷貝數(shù)。

本研究結(jié)果表明，在高原習(xí)服黃牛腦組織中SLC25A6基因的表達(dá)量從高到低依次為小腦、海馬、枕葉、額葉、顳葉、頂葉，小腦表達(dá)量顯著高于其組織，小腦SLC25A6基因表達(dá)量為額葉表達(dá)量的2.79倍。頂葉消耗能量強(qiáng)度較低，細(xì)胞能量代謝較弱，小腦消耗能量強(qiáng)度較大，細(xì)胞能量代謝較強(qiáng)。可以推斷頂葉為低氧環(huán)境敏感區(qū)域，小腦抗低氧能力較強(qiáng)。

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1.3.3.3 質(zhì)粒DNA抽提、酶切及純化 利用質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒對(duì)鑒定正確的陽(yáng)性菌液進(jìn)行質(zhì)粒提取。通過(guò)EcoRⅠ對(duì)抽提的質(zhì)粒進(jìn)行酶切37 ℃孵育1 h后，65 ℃ 20 min 使酶失活。將酶切好的質(zhì)粒DNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并利用solarbio 瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒對(duì)目標(biāo)DNA條帶進(jìn)行回收純化，從而去除酶切不完全的環(huán)狀質(zhì)粒。

1.3.3.4 質(zhì)粒DNA濃度測(cè)定及梯度稀釋 利用核酸蛋白檢測(cè)儀對(duì)純化后的線性質(zhì)粒進(jìn)行濃度測(cè)定。根據(jù)公式：質(zhì)粒拷貝數(shù)（拷貝數(shù)/μL）=6.02×1023（拷貝數(shù)/mol） ×質(zhì)粒濃度（g/μL）/質(zhì)粒分子量（g/mol），得出質(zhì)粒拷貝數(shù)，然后將質(zhì)粒進(jìn)行10倍梯度稀釋，分別稀釋成1×108～1×102拷貝數(shù)/μL的7個(gè)梯度，作為標(biāo)準(zhǔn)品。

1.3.4 real-time PCR反應(yīng) real-time PCR擴(kuò)增反應(yīng)的加樣體系如下：模板2 μL，濃度為10 μmol/L的上、下游引物各1 μL，ddH2O2 8.5 μL，SYBR Premix Ex Taq Ⅱ12.5 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s。首先將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA上機(jī)后進(jìn)行1個(gè)循環(huán)，使cDNA由單鏈變?yōu)殡p鏈，后與標(biāo)準(zhǔn)品一同進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。待測(cè)樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 總RNA檢測(cè)結(jié)果

利用BIO-RAD核酸蛋白檢測(cè)儀測(cè)定RNA純度及濃度，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2，各項(xiàng)指標(biāo)均符合要求。凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖1，泳道自左至右以此為：額葉、顳葉、頂葉、枕葉、小腦及海馬，18S及28S條帶清晰，并無(wú)降解現(xiàn)象出現(xiàn)。

2.4 高原習(xí)服黃牛腦組織內(nèi)SLC25A6基因mRNA表達(dá)量

通過(guò)反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄時(shí)，20 μL的反轉(zhuǎn)錄體系中共加入了1 μg的總RNA，而進(jìn)行Real-time PCR時(shí)，反應(yīng)體系中加入了2 μL反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線中CT值與基因拷貝數(shù)的關(guān)系，換算出SLC25A6基因在總RNA/μg中的絕對(duì)表達(dá)量。高原習(xí)服黃牛腦組織內(nèi)SLC25A6基因mRNA表達(dá)量見(jiàn)表3、圖5。高原習(xí)服黃牛腦組織中小腦SLC25A6基因表達(dá)量最高，拷貝數(shù)均值為3.683×107拷貝數(shù)/μg，顯著高于其他各組織；頂葉表達(dá)量最低，小腦表達(dá)量為頂葉表達(dá)量的2.79倍；顳葉與枕葉、海馬表達(dá)量均值之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；頂葉與枕葉、海馬表達(dá)量均值之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；額葉、顳葉、頂葉均值之間差異，枕葉與海馬之間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

度地利用氧，并產(chǎn)生盡可能多的能量；腦組織的缺氧適應(yīng)能夠使損壞腦細(xì)胞的不良因素得到抑制或調(diào)整，使腦組織在不良環(huán)境下度過(guò)危險(xiǎn)期^[10]。ANT在能量代謝中發(fā)揮著重要作用，本試驗(yàn)通過(guò)測(cè)定SLC25A6基因在高原習(xí)服黃牛腦組織中的表達(dá)情況，間接反映腦組織不同部位在高原低氧習(xí)服情況下對(duì)能量的利用情況。

由于反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA為單鏈，而標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒為雙鏈，所以進(jìn)行Real-time PCR時(shí)，先將cDNA進(jìn)行1個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增，使其變?yōu)殡p鏈，后與標(biāo)準(zhǔn)品一同進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，以避免單鏈與雙鏈之間的差異^[11]。試驗(yàn)結(jié)果表明，標(biāo)準(zhǔn)曲線的擴(kuò)增效率為E=104.9%，回歸系數(shù)r=-0.996，斜率為-3.210，溶解曲線峰值單一。從這些參數(shù)可以看出標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系良好，引物特異性較強(qiáng)。結(jié)果能夠真實(shí)反映出SLC25A6基因在高原習(xí)服黃牛腦組織中的實(shí)際拷貝數(shù)。

本研究結(jié)果表明，在高原習(xí)服黃牛腦組織中SLC25A6基因的表達(dá)量從高到低依次為小腦、海馬、枕葉、額葉、顳葉、頂葉，小腦表達(dá)量顯著高于其組織，小腦SLC25A6基因表達(dá)量為額葉表達(dá)量的2.79倍。頂葉消耗能量強(qiáng)度較低，細(xì)胞能量代謝較弱，小腦消耗能量強(qiáng)度較大，細(xì)胞能量代謝較強(qiáng)。可以推斷頂葉為低氧環(huán)境敏感區(qū)域，小腦抗低氧能力較強(qiáng)。

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