有棱絲瓜與普通絲瓜種間雜種后代的ISSR分析

宋波+陳龍正+徐海+鄭濤+袁希漢

摘要：應用ISSR技術對有棱絲瓜[Luffa acutangula （L.） Roxb.]與普通絲瓜[Luffa cylindrica （L.） Roem.]及其種間雜種F1、F2代的遺傳差異性進行了研究。結果表明：供試材料基因組DNA間具有很高的多態(tài)性，雙親的遺傳相似系數(shù)僅為0.395，F(xiàn)1的條帶主要表現(xiàn)為雙親互補帶型，F(xiàn)1、F2并沒有明顯向雙親任何一方遺傳的傾向，F(xiàn)2的遺傳變異較大。

關鍵詞：有棱絲瓜；普通絲瓜；種間雜種；ISSR

中圖分類號：S642.403.6 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2014）08-0042-03

有棱絲瓜[Luffa acutangula （L.） Roxb.]與普通絲瓜[Luffa cylindrical （L.） Roem.]是我國普遍種植的2個絲瓜栽培種。有棱絲瓜與普通絲瓜在花色、花期以及果實性狀等農(nóng)藝性狀方面存在較大差異，同時二者具有許多互補的優(yōu)良性狀，如普通絲瓜的果皮碰擦后或果肉烹飪后均易變褐，而有棱絲瓜的果肉在烹飪后不變色，保持翠綠，口感清香。有棱絲瓜開花對日照長度要求嚴格，早熟性較差，產(chǎn)量不高，普通絲瓜一般早熟性好，產(chǎn)量高，可通過種間雜交，利用彼此的優(yōu)良性狀對二者進行有目的的改良^[1-2]。 目前國內(nèi)外關于絲瓜種間雜交研究集中在雜交技術、農(nóng)藝性狀等方面^[1-4]，關于分子層面的研究未見報道。本研究對有棱絲瓜與普通絲瓜及其種間雜種F1、F2進行ISSR分析，從DNA分子水平分析親本及雜交后代間的遺傳差異性及相似性，旨在為揭示絲瓜種間雜交后代的遺傳特性提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為有棱絲瓜（P1）、有棱絲瓜×普通絲瓜（F1）、普通絲瓜（P2）、20個F2單株，共23份材料。3葉期取幼苗嫩葉，用CTAB法提取基因組DNA。

1.2 ISSR分析

ISSR反應體系共20 μL。在滅菌的0.2 mL PCR薄壁管中依次加入下列組分：雙蒸水 11.8 μL，10×Buffer溶液 2 μL，25 mmol/L MgCl2溶液 2 μL，2 mmol/L dNTPs 2.5 μL，10 mmol/L 20堿基隨機引物 0.5 μL，TaqDNA聚合酶1 U，20～40 ng 模板DNA 1 μL（以上各反應組分均購于上海生工生物工程技術服務有限公司）。稍加離心混勻后，在PTC-100 PCR儀中擴增。反應程序：預變性94 ℃，5 min；94 ℃，30 s，55.8 ℃，45 s，72 ℃，2 min，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。擴增產(chǎn)物在1.2%瓊脂糖凝膠上電泳分離1.5 h，電壓為5 V/cm，0.5 μg/L溴化乙錠染色，用上海培青凝膠成像系統(tǒng)進行拍照分析。擴增片段的分子大小標記是 GeneRulerTM 100 bp DNA Ladder Plus。從70個引物中篩選出重復性好、適宜于各供試材料的6個引物（ISSR17、ISSR22、ISSR23、ISSR26、ISSR33、ISSR59）進行ISSR分析。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每個樣品的擴增條帶按有或無記錄，有帶賦值為1，無帶賦值為0，按Nei的方法^[5]計算材料間的相似系數(shù)（genetic similarity）：

2.1.1 雙親和雜種F1的ISSR分析

由表1可知，6個引物在有棱絲瓜、普通絲瓜2個親本中分別擴增出30、23條帶，2個親本的特異帶分別為15、8條，各占50.0%、34.8%，因而很容易將有棱絲瓜與普通絲瓜區(qū)別開來。6個引物在F1中共擴增出35條帶，其中與有棱絲瓜特異帶相同的有12條，占34.3%；與普通絲瓜特異帶相同的有8條，占22.9%。F1丟失了3條有棱絲瓜特異帶，未丟失普通絲瓜特異帶。從圖1可看出，F(xiàn)1同時具有ISSR33-1500、ISSR33-1800兩條雙親的互補條帶，說明雜種F1的條帶主要表現(xiàn)為雙親互補帶型。

2.1.2 F2群體的ISSR分析

從表1可知，6個引物在F2群體中共擴增出22～34條帶，F(xiàn)2-14僅擴增出22條帶，其中丟失8條有棱絲瓜特異帶、5條普通絲瓜特異帶、3條父母本共有條帶。F2-2擴增出34條帶，僅丟失3條有棱絲瓜特異帶，并全部繼承普通絲瓜的特異條帶，丟失1條父母本共有條帶。F2與有棱絲瓜特異帶相同的有5～12條，占擴增總帶數(shù)的20.8%～40.0%。F2與普通絲瓜特異帶相同的有3～8條，占擴增總帶數(shù)的12%～26.9%。F2繼承父母本共有條帶有12～14條，說明在繼承父母本共有條帶上具有一定穩(wěn)定性，但在F2群體中并未擴增出新的條帶。

2.2 雙親與種間雜種后代的遺傳相似系數(shù)比較

由表2可知，有棱絲瓜、普通絲瓜的遺傳相似系數(shù)為0.395，表明雙親的遺傳差異較大。有棱絲瓜與F1遺傳相似系數(shù)為0.711，普通絲瓜與F1遺傳相似系數(shù)為0.684，差異不顯著。F2與有棱絲瓜的遺傳相似系數(shù)為0.524～0.737，F(xiàn)2與普通絲瓜的遺傳相似系數(shù)為0.553～0.763，說明F1、F2并沒有明顯向雙親任何一方遺傳的傾向。F2株系間的遺傳相似系數(shù)為0.500～0.895，表明F2的遺傳變異較大。

本研究表明，有棱絲瓜與普通絲瓜之間的遺傳相似系數(shù)較低，很好地解釋了二者農(nóng)藝性狀差異較大的原因。這一結果與夏軍輝對有棱絲瓜、普通絲瓜的RAPD分析結果^[6]相一致。

本研究對絲瓜種間雜交后代進行了初步的ISSR分析，結果表明，雜種F1的條帶主要表現(xiàn)為雙親互補帶型，F(xiàn)2的條帶全部來源于雙親，未出現(xiàn)新的條帶，說明在繼承雙親共有條帶上具有較高穩(wěn)定性。從理論上講，經(jīng)過減數(shù)分裂，F(xiàn)2應該會產(chǎn)生新的條帶，這可能與本試驗采用的引物較少有關。ISSR分子標記技術在絲瓜上具有較高的多態(tài)性，能很好地運用于絲瓜分子標記研究中，這為果肉褐變等分子標記開發(fā)研究奠定了基礎。

參考文獻：

[1]宋 波，蘇小俊，陳 潔，等. 普通絲瓜與有棱絲瓜亞種間雜交的正反交效應分析[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學，2008（5）：139-142.

[2]宋 波. 有棱絲瓜與普通絲瓜種間雜種后代的遺傳分析[D]. 南京：南京農(nóng)業(yè)大學，2008.

[3]袁希漢，蘇小俊，高 軍，等. 低溫貯藏對絲瓜花粉活力和結實的影響[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學，2008（2）：122-124.

[4]謝文軍. 不同類型絲瓜雜種優(yōu)勢及性狀遺傳特性的研究[D]. 泰安：山東農(nóng)業(yè)大學，2003.

[5]Nei M，Li W H. Mathematical model for studying genetic variation in terms of restriction endonucleases[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，1979，76（10）：5269-5273.

[6]夏軍輝. 絲瓜種質(zhì)資源遺傳多樣性研究[D]. 武漢：華中農(nóng)業(yè)大學，2007.

摘要：應用ISSR技術對有棱絲瓜[Luffa acutangula （L.） Roxb.]與普通絲瓜[Luffa cylindrica （L.） Roem.]及其種間雜種F1、F2代的遺傳差異性進行了研究。結果表明：供試材料基因組DNA間具有很高的多態(tài)性，雙親的遺傳相似系數(shù)僅為0.395，F(xiàn)1的條帶主要表現(xiàn)為雙親互補帶型，F(xiàn)1、F2并沒有明顯向雙親任何一方遺傳的傾向，F(xiàn)2的遺傳變異較大。

關鍵詞：有棱絲瓜；普通絲瓜；種間雜種；ISSR

中圖分類號：S642.403.6 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2014）08-0042-03

有棱絲瓜[Luffa acutangula （L.） Roxb.]與普通絲瓜[Luffa cylindrical （L.） Roem.]是我國普遍種植的2個絲瓜栽培種。有棱絲瓜與普通絲瓜在花色、花期以及果實性狀等農(nóng)藝性狀方面存在較大差異，同時二者具有許多互補的優(yōu)良性狀，如普通絲瓜的果皮碰擦后或果肉烹飪后均易變褐，而有棱絲瓜的果肉在烹飪后不變色，保持翠綠，口感清香。有棱絲瓜開花對日照長度要求嚴格，早熟性較差，產(chǎn)量不高，普通絲瓜一般早熟性好，產(chǎn)量高，可通過種間雜交，利用彼此的優(yōu)良性狀對二者進行有目的的改良^[1-2]。 目前國內(nèi)外關于絲瓜種間雜交研究集中在雜交技術、農(nóng)藝性狀等方面^[1-4]，關于分子層面的研究未見報道。本研究對有棱絲瓜與普通絲瓜及其種間雜種F1、F2進行ISSR分析，從DNA分子水平分析親本及雜交后代間的遺傳差異性及相似性，旨在為揭示絲瓜種間雜交后代的遺傳特性提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為有棱絲瓜（P1）、有棱絲瓜×普通絲瓜（F1）、普通絲瓜（P2）、20個F2單株，共23份材料。3葉期取幼苗嫩葉，用CTAB法提取基因組DNA。

1.2 ISSR分析

ISSR反應體系共20 μL。在滅菌的0.2 mL PCR薄壁管中依次加入下列組分：雙蒸水 11.8 μL，10×Buffer溶液 2 μL，25 mmol/L MgCl2溶液 2 μL，2 mmol/L dNTPs 2.5 μL，10 mmol/L 20堿基隨機引物 0.5 μL，TaqDNA聚合酶1 U，20～40 ng 模板DNA 1 μL（以上各反應組分均購于上海生工生物工程技術服務有限公司）。稍加離心混勻后，在PTC-100 PCR儀中擴增。反應程序：預變性94 ℃，5 min；94 ℃，30 s，55.8 ℃，45 s，72 ℃，2 min，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。擴增產(chǎn)物在1.2%瓊脂糖凝膠上電泳分離1.5 h，電壓為5 V/cm，0.5 μg/L溴化乙錠染色，用上海培青凝膠成像系統(tǒng)進行拍照分析。擴增片段的分子大小標記是 GeneRulerTM 100 bp DNA Ladder Plus。從70個引物中篩選出重復性好、適宜于各供試材料的6個引物（ISSR17、ISSR22、ISSR23、ISSR26、ISSR33、ISSR59）進行ISSR分析。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每個樣品的擴增條帶按有或無記錄，有帶賦值為1，無帶賦值為0，按Nei的方法^[5]計算材料間的相似系數(shù)（genetic similarity）：

2.1.1 雙親和雜種F1的ISSR分析

由表1可知，6個引物在有棱絲瓜、普通絲瓜2個親本中分別擴增出30、23條帶，2個親本的特異帶分別為15、8條，各占50.0%、34.8%，因而很容易將有棱絲瓜與普通絲瓜區(qū)別開來。6個引物在F1中共擴增出35條帶，其中與有棱絲瓜特異帶相同的有12條，占34.3%；與普通絲瓜特異帶相同的有8條，占22.9%。F1丟失了3條有棱絲瓜特異帶，未丟失普通絲瓜特異帶。從圖1可看出，F(xiàn)1同時具有ISSR33-1500、ISSR33-1800兩條雙親的互補條帶，說明雜種F1的條帶主要表現(xiàn)為雙親互補帶型。

2.1.2 F2群體的ISSR分析

從表1可知，6個引物在F2群體中共擴增出22～34條帶，F(xiàn)2-14僅擴增出22條帶，其中丟失8條有棱絲瓜特異帶、5條普通絲瓜特異帶、3條父母本共有條帶。F2-2擴增出34條帶，僅丟失3條有棱絲瓜特異帶，并全部繼承普通絲瓜的特異條帶，丟失1條父母本共有條帶。F2與有棱絲瓜特異帶相同的有5～12條，占擴增總帶數(shù)的20.8%～40.0%。F2與普通絲瓜特異帶相同的有3～8條，占擴增總帶數(shù)的12%～26.9%。F2繼承父母本共有條帶有12～14條，說明在繼承父母本共有條帶上具有一定穩(wěn)定性，但在F2群體中并未擴增出新的條帶。

2.2 雙親與種間雜種后代的遺傳相似系數(shù)比較

由表2可知，有棱絲瓜、普通絲瓜的遺傳相似系數(shù)為0.395，表明雙親的遺傳差異較大。有棱絲瓜與F1遺傳相似系數(shù)為0.711，普通絲瓜與F1遺傳相似系數(shù)為0.684，差異不顯著。F2與有棱絲瓜的遺傳相似系數(shù)為0.524～0.737，F(xiàn)2與普通絲瓜的遺傳相似系數(shù)為0.553～0.763，說明F1、F2并沒有明顯向雙親任何一方遺傳的傾向。F2株系間的遺傳相似系數(shù)為0.500～0.895，表明F2的遺傳變異較大。

本研究表明，有棱絲瓜與普通絲瓜之間的遺傳相似系數(shù)較低，很好地解釋了二者農(nóng)藝性狀差異較大的原因。這一結果與夏軍輝對有棱絲瓜、普通絲瓜的RAPD分析結果^[6]相一致。

本研究對絲瓜種間雜交后代進行了初步的ISSR分析，結果表明，雜種F1的條帶主要表現(xiàn)為雙親互補帶型，F(xiàn)2的條帶全部來源于雙親，未出現(xiàn)新的條帶，說明在繼承雙親共有條帶上具有較高穩(wěn)定性。從理論上講，經(jīng)過減數(shù)分裂，F(xiàn)2應該會產(chǎn)生新的條帶，這可能與本試驗采用的引物較少有關。ISSR分子標記技術在絲瓜上具有較高的多態(tài)性，能很好地運用于絲瓜分子標記研究中，這為果肉褐變等分子標記開發(fā)研究奠定了基礎。

參考文獻：

[1]宋 波，蘇小俊，陳 潔，等. 普通絲瓜與有棱絲瓜亞種間雜交的正反交效應分析[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學，2008（5）：139-142.

[2]宋 波. 有棱絲瓜與普通絲瓜種間雜種后代的遺傳分析[D]. 南京：南京農(nóng)業(yè)大學，2008.

[3]袁希漢，蘇小俊，高 軍，等. 低溫貯藏對絲瓜花粉活力和結實的影響[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學，2008（2）：122-124.

[4]謝文軍. 不同類型絲瓜雜種優(yōu)勢及性狀遺傳特性的研究[D]. 泰安：山東農(nóng)業(yè)大學，2003.

[5]Nei M，Li W H. Mathematical model for studying genetic variation in terms of restriction endonucleases[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，1979，76（10）：5269-5273.

[6]夏軍輝. 絲瓜種質(zhì)資源遺傳多樣性研究[D]. 武漢：華中農(nóng)業(yè)大學，2007.

摘要：應用ISSR技術對有棱絲瓜[Luffa acutangula （L.） Roxb.]與普通絲瓜[Luffa cylindrica （L.） Roem.]及其種間雜種F1、F2代的遺傳差異性進行了研究。結果表明：供試材料基因組DNA間具有很高的多態(tài)性，雙親的遺傳相似系數(shù)僅為0.395，F(xiàn)1的條帶主要表現(xiàn)為雙親互補帶型，F(xiàn)1、F2并沒有明顯向雙親任何一方遺傳的傾向，F(xiàn)2的遺傳變異較大。

關鍵詞：有棱絲瓜；普通絲瓜；種間雜種；ISSR

中圖分類號：S642.403.6 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2014）08-0042-03

有棱絲瓜[Luffa acutangula （L.） Roxb.]與普通絲瓜[Luffa cylindrical （L.） Roem.]是我國普遍種植的2個絲瓜栽培種。有棱絲瓜與普通絲瓜在花色、花期以及果實性狀等農(nóng)藝性狀方面存在較大差異，同時二者具有許多互補的優(yōu)良性狀，如普通絲瓜的果皮碰擦后或果肉烹飪后均易變褐，而有棱絲瓜的果肉在烹飪后不變色，保持翠綠，口感清香。有棱絲瓜開花對日照長度要求嚴格，早熟性較差，產(chǎn)量不高，普通絲瓜一般早熟性好，產(chǎn)量高，可通過種間雜交，利用彼此的優(yōu)良性狀對二者進行有目的的改良^[1-2]。 目前國內(nèi)外關于絲瓜種間雜交研究集中在雜交技術、農(nóng)藝性狀等方面^[1-4]，關于分子層面的研究未見報道。本研究對有棱絲瓜與普通絲瓜及其種間雜種F1、F2進行ISSR分析，從DNA分子水平分析親本及雜交后代間的遺傳差異性及相似性，旨在為揭示絲瓜種間雜交后代的遺傳特性提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為有棱絲瓜（P1）、有棱絲瓜×普通絲瓜（F1）、普通絲瓜（P2）、20個F2單株，共23份材料。3葉期取幼苗嫩葉，用CTAB法提取基因組DNA。

1.2 ISSR分析

ISSR反應體系共20 μL。在滅菌的0.2 mL PCR薄壁管中依次加入下列組分：雙蒸水 11.8 μL，10×Buffer溶液 2 μL，25 mmol/L MgCl2溶液 2 μL，2 mmol/L dNTPs 2.5 μL，10 mmol/L 20堿基隨機引物 0.5 μL，TaqDNA聚合酶1 U，20～40 ng 模板DNA 1 μL（以上各反應組分均購于上海生工生物工程技術服務有限公司）。稍加離心混勻后，在PTC-100 PCR儀中擴增。反應程序：預變性94 ℃，5 min；94 ℃，30 s，55.8 ℃，45 s，72 ℃，2 min，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。擴增產(chǎn)物在1.2%瓊脂糖凝膠上電泳分離1.5 h，電壓為5 V/cm，0.5 μg/L溴化乙錠染色，用上海培青凝膠成像系統(tǒng)進行拍照分析。擴增片段的分子大小標記是 GeneRulerTM 100 bp DNA Ladder Plus。從70個引物中篩選出重復性好、適宜于各供試材料的6個引物（ISSR17、ISSR22、ISSR23、ISSR26、ISSR33、ISSR59）進行ISSR分析。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每個樣品的擴增條帶按有或無記錄，有帶賦值為1，無帶賦值為0，按Nei的方法^[5]計算材料間的相似系數(shù)（genetic similarity）：

2.1.1 雙親和雜種F1的ISSR分析

由表1可知，6個引物在有棱絲瓜、普通絲瓜2個親本中分別擴增出30、23條帶，2個親本的特異帶分別為15、8條，各占50.0%、34.8%，因而很容易將有棱絲瓜與普通絲瓜區(qū)別開來。6個引物在F1中共擴增出35條帶，其中與有棱絲瓜特異帶相同的有12條，占34.3%；與普通絲瓜特異帶相同的有8條，占22.9%。F1丟失了3條有棱絲瓜特異帶，未丟失普通絲瓜特異帶。從圖1可看出，F(xiàn)1同時具有ISSR33-1500、ISSR33-1800兩條雙親的互補條帶，說明雜種F1的條帶主要表現(xiàn)為雙親互補帶型。

2.1.2 F2群體的ISSR分析

從表1可知，6個引物在F2群體中共擴增出22～34條帶，F(xiàn)2-14僅擴增出22條帶，其中丟失8條有棱絲瓜特異帶、5條普通絲瓜特異帶、3條父母本共有條帶。F2-2擴增出34條帶，僅丟失3條有棱絲瓜特異帶，并全部繼承普通絲瓜的特異條帶，丟失1條父母本共有條帶。F2與有棱絲瓜特異帶相同的有5～12條，占擴增總帶數(shù)的20.8%～40.0%。F2與普通絲瓜特異帶相同的有3～8條，占擴增總帶數(shù)的12%～26.9%。F2繼承父母本共有條帶有12～14條，說明在繼承父母本共有條帶上具有一定穩(wěn)定性，但在F2群體中并未擴增出新的條帶。

2.2 雙親與種間雜種后代的遺傳相似系數(shù)比較

由表2可知，有棱絲瓜、普通絲瓜的遺傳相似系數(shù)為0.395，表明雙親的遺傳差異較大。有棱絲瓜與F1遺傳相似系數(shù)為0.711，普通絲瓜與F1遺傳相似系數(shù)為0.684，差異不顯著。F2與有棱絲瓜的遺傳相似系數(shù)為0.524～0.737，F(xiàn)2與普通絲瓜的遺傳相似系數(shù)為0.553～0.763，說明F1、F2并沒有明顯向雙親任何一方遺傳的傾向。F2株系間的遺傳相似系數(shù)為0.500～0.895，表明F2的遺傳變異較大。

本研究表明，有棱絲瓜與普通絲瓜之間的遺傳相似系數(shù)較低，很好地解釋了二者農(nóng)藝性狀差異較大的原因。這一結果與夏軍輝對有棱絲瓜、普通絲瓜的RAPD分析結果^[6]相一致。

本研究對絲瓜種間雜交后代進行了初步的ISSR分析，結果表明，雜種F1的條帶主要表現(xiàn)為雙親互補帶型，F(xiàn)2的條帶全部來源于雙親，未出現(xiàn)新的條帶，說明在繼承雙親共有條帶上具有較高穩(wěn)定性。從理論上講，經(jīng)過減數(shù)分裂，F(xiàn)2應該會產(chǎn)生新的條帶，這可能與本試驗采用的引物較少有關。ISSR分子標記技術在絲瓜上具有較高的多態(tài)性，能很好地運用于絲瓜分子標記研究中，這為果肉褐變等分子標記開發(fā)研究奠定了基礎。

參考文獻：

[1]宋 波，蘇小俊，陳 潔，等. 普通絲瓜與有棱絲瓜亞種間雜交的正反交效應分析[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學，2008（5）：139-142.

[2]宋 波. 有棱絲瓜與普通絲瓜種間雜種后代的遺傳分析[D]. 南京：南京農(nóng)業(yè)大學，2008.

[3]袁希漢，蘇小俊，高 軍，等. 低溫貯藏對絲瓜花粉活力和結實的影響[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學，2008（2）：122-124.

[4]謝文軍. 不同類型絲瓜雜種優(yōu)勢及性狀遺傳特性的研究[D]. 泰安：山東農(nóng)業(yè)大學，2003.

[5]Nei M，Li W H. Mathematical model for studying genetic variation in terms of restriction endonucleases[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，1979，76（10）：5269-5273.

[6]夏軍輝. 絲瓜種質(zhì)資源遺傳多樣性研究[D]. 武漢：華中農(nóng)業(yè)大學，2007.