沙地云杉ISSR—PCR反應體系的初步優化

鄭舒文+田有亮+白玉娥+何炎紅

摘要：以沙地云杉葉基因組DNA為材料，采用單因素試驗方法對ISSR-PCR體系中的主要成分Mg2+、dNTPs、Taq DNA聚合酶、引物濃度、退火溫度進行篩選，建立并優化沙地ISSR-PCR反應體系。結果表明，UBC835是最適引物，適宜退火溫度為50 ℃。沙地云杉ISSR-PCR分析的最適反應體系（20 μL PCR反應體系）為：2.0 mmol/L Mg2+、1.0 U/μL Taq DNA聚合酶、0.25 mmol/L dNTPs、0.25 μmol/L引物、50 ng/μL模板DNA。PCR擴增程序：94 ℃預變性4 min；94 ℃變性45 s，50 ℃退火45 s，72 ℃延伸2 min，40個循環；72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。

關鍵詞：沙地云杉；葉基因組DNA；ISSR-PCR；優化

中圖分類號：S791.180.1 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2014）08-0048-03

沙地云杉（Picea mongolica）是中國稀有珍貴樹種，集中成片地分布在生態環境惡劣的內蒙古自治區以克什克騰旗的白音敖包自然保護區，形成了罕見的沙地森林。沙地云杉具有耐旱抗寒、防風阻沙、調節氣候等特點，并且生存年代久遠，所以被稱為沙漠上的“綠寶石”和“生物活化石”^[1]。自引種到遼寧、北京、呼和浩特成功之后^[2]，沙地云杉不再是內蒙古草原的特有樹種。目前，沙地云杉的研究仍停滯在生態學水平，對其遺傳多樣性的研究尚未見報道。

簡單重復序列間區標記技術（inter-simple sequence repeat，ISSR）是由加拿大蒙特利爾大學的Zietkiewicz等于1994年發展起來的一種微衛星的分子標記^[3]。ISSR標記呈孟德爾式遺傳，大部分ISSR標記為顯性標記。它結合了SSR和RAPD的優點^[4]，具有模板 DNA用量少、質量要求低，擴增產物特異性強，重復性高，試驗操作簡便，費用較低等特點，又比RFLP、RAPD、SSR能更多地提供遺傳信息，已被廣泛應用于品種鑒定、遺傳多樣性、系統進化關系、遺傳作圖、基因定位、標記輔助選擇^[5]等研究，通過遺傳多樣性手段對沙地云杉作進一步研究。本試驗以沙地云杉葉基因組為模板DNA，分析引物、dNTPs、Mg2+、Taq DNA聚合酶濃度、退火溫度對ISSR-PCR擴增的影響，建立適合沙地云杉ISSR-PCR的反應體系，為研究沙地云杉的系統進化、物種鑒定和種間雜交育種提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料 試驗材料來自內蒙古渾善達克沙地，種子于40 ℃烘箱中烘干后取出，浸于75%甲醇中一段時間，然后放在培養箱中培養。將長出的嫩葉放入-80 ℃保存，以備取用。

1.1.2 試劑 提取基因組DNA：CTAB提取液，β-巰基乙醇，1×TE緩沖液。引物參照哥倫比亞大學（University of British Columbia，UBC）公布的ISSR引物序列，由北京華大基因有限公司合成。本試驗反應體系優化試驗固定引物UBC 835的序列為：AGAGAGAGAGAGAGAGC。用于ISSR-PCR的試劑：dNTPs、Mg2+、Taq DNA聚合酶、10×PCR buffer、DNA Marker（DL2000）購自天根（TIANGEN）生化科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的提取 本試驗采用CTAB法提取沙地云杉基因組DNA。

1.2.2 DNA濃度及純度檢測 用紫外分光光度計測定DNA樣品在260 nm和280 nm處的吸光度，檢測其濃度和純度。用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質量并進行PCR擴增，最后稀釋至50 ng/μL保存在-20 ℃中備用。

1.2.3 PCR單因素試驗 單因素試驗是其他因子保持不變，其中1個因子按照一定濃度梯度變化，從而篩選出各因子適合繼續優化的最適濃度。本試驗是為了篩選出適合于沙地云杉ISSR-PCR反應體系的各因素最佳濃度。不同因素濃度水平見表1。

1.2.4 PCR反應條件 94 ℃預變性4 min，94 ℃變性45 s，UBC 835的退火溫度是50 ℃，退火45 s，72 ℃延伸2 min，40個循環，72 ℃延伸7 min，4 ℃保存備用。

1.2.5 擴增產物檢測 1.2%的瓊脂糖凝膠在0.5 ×TBE緩沖液中電泳檢測，用UVP凝膠成像系統照相保存。

2 結果與分析

2.1 引物濃度的優化

引物濃度是影響PCR結果的重要變量之一。濃度過低阻礙引物與模板DNA的結合，不能產生有效擴增條帶。濃度過高會引起非特異性擴增產物和引物二聚體等的形成^[6]，使目的DNA片段擴增量下降，條帶不清晰。由圖1可見，濃度為0.15 μmol/L時，擴增條帶較弱，不清晰；0.20、0.30 μmol/L 條帶比0.15 μmol/L清晰，但有彌散現象，不是很穩定，所以20 μL反應體積中確定條帶穩定的 0.25 μmol/L 為最適引物濃度。

2.2 Mg2+濃度的優化

Mg2+濃度對PCR擴增的特異性和產物有顯著的影響，Mg2+作為Taq DNA 聚合酶的依賴性因子，不僅影響Taq酶的活性，反應體系中的dNTPs、模板DNA及引物都會與Mg2+結合^[7]。Mg2+濃度過高反應特異性降低，出現非特異擴增；濃度過低會降低Taq DNA聚合酶的活性，使反應產物減少。由圖2可知， 4個Mg2+濃度， 即2.0、1.0、1.5、2.5 mmol/L條件下均有擴增產物，但是Mg2+濃度在1.0、1.5 mmol/L時，條帶較少；濃度在2.5 mmol/L時出現非特異性擴增，濃度在 2.0 mmol/L 時條帶清晰，穩定性高。所以Mg2+用量為 2.0 mmol/L 是最佳濃度。

2.3 Taq DNA聚合酶的優化

Taq DNA聚合酶的用量是影響擴增的重要因素，濃度過低會使酶過早地消耗完造成合成效率下降，濃度過高容易產生非特異性擴增且增加成本。從圖3可見，不同Taq DNA聚合酶濃度從0.5、1.0、1.5、2.0 U/μL均有擴增產物，濃度在0.5 U/μL條帶相對較弱，1.0、1.5、2.0 U/μL時擴增出的條帶無顯著差異，考慮穩定性和成本，而且1.5 U/μL的條帶亮度高和穩定性強。最終確定Taq DNA聚合酶用量為1.0 U/μL。

2.4 dNTPs濃度的優化

dNTPs濃度與PCR擴增效率有密切關系，dNTPs能與Mg2+結合，使游離的Mg2+濃度降低。濃度高會導致片段缺失，而濃度太低又會導致擴增產率下降^[4]。從圖4中可見，dNTPs濃度為0.15、0.20、 0.25、0.30 mmol/L均有擴增條帶，dNTPs濃度為0.15、0.30 mmol/L時，擴增出的條帶較少；在0.20、0.25 mmol/L時擴增條帶較多，但0.25 mmol/L比0.20 mmol/L 條帶清晰。因此確定dNTPs濃度為0.25 mmol/L。

2.5 退火溫度的優化

為了確定引物的最適退火溫度，參照所選引物序列計算理論退火溫度Tm，Tm=4（G+C）+2（A+T）^[8]。溫度低于Tm值，擴增產物特異性降低，擴增出來的條帶較弱；溫度過高不利于引物擴增。在本試驗中所用引物的Tm值為53 ℃， 從

3 結論與討論

試驗結果表明，通過各個因素的綜合對比分析，得出反應體系中4個因子的最佳濃度：0.25 μmol/L引物、2.0 mmol/L Mg2+、1.0 U/μL Taq DNA聚合酶、0.25 mmol/L dNTPs、50 ng/μL 模板DNA。PCR反應條件：94℃預變性4min；94 ℃ 變性 45 s，UBC 835退火溫度是50 ℃，退火45 s，72 ℃延伸2 min，40個循環；72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。

ISSR-PCR具有高重復性的優點，但其擴增仍受多種因素的影響，如Mg2+用量、引物濃度、Taq[KG*3]DNA聚合酶用量、退火溫度、模板DNA等。試驗研究發現，模板DNA對ISSR-PCR擴增的影響不是很大，而Taq DNA聚合酶和Mg2+對其有很大的作用。Mg2+濃度控制Taq DNA聚合酶的活性，Taq DNA聚合酶的活性又是ISSR-PCR擴增的關鍵。而dNTP是PCR反應的原料，濃度過高時容易導致錯配，同時dNTP會對Mg2+產生拮抗作用^[9]，退火溫度高低制約擴增條帶的分辨率。上述因素相互依賴、相互抑制。為獲得重復性好、可靠性高的擴增條帶^[10-11]，本試驗采用單因素試驗方法來確定各因素的最佳濃度。單因素試驗設計可對每個影響因子不同水平進行直觀的判斷。確定了沙地云杉ISSR-PCR各因素的最適濃度，試驗結果對沙地云杉進行遺傳多樣性分析等研究奠定了基礎。

參考文獻：

[1]李銀科，劉世增，康才周，等. 溫度對樟子松和沙地云杉種子萌發特征的影響[J]. 水土保持通報，2011，31（4）：73-77.

[2]劉瑞芬.沙地云杉引種實驗[J]. 內蒙古林業調查設計，2008，31（6）：75-77，80.

[3]羅玥佶，伍賢進，彭 帥，等. 翻白草總DNA的提取與ISSR-PCR體系的建立與優化[J]. 安徽農業科學，2008，36（3）：895-897，901.

[4]桂騰琴，喬愛民，孫 敏，等. 果梅ISSR-PCR反應體系的建立和優化[J]. 西南大學學報：自然科學版，2007，29（10）：124-128.

[5]趙 謙，杜 虹，莊東紅. ISSR分子標記及其在植物研究中的應用[J]. 分子植物育種，2007，6（增刊1）：123-129.

[6]劉 娜，王昌命，普曉蘭. 云南松胚乳DNA提取與ISSR-PCR反應體系的建立[J]. 西南林學院學報，2009，29（2）：27-30.

[7]喬燕春，林順權，楊向暉，等. 均勻設計在枇杷ISSR-PCR反應體系優化中的應用[J]. 基因組學與應用生物學，2009，28（1）：123-126.

[8]盧圣棟. 現代分子生物學實驗技術[M]. 2版.北京：中國協和醫科大學出版社，1999：57-58.

[9]王 亞，郭志強，王宏偉，等. 單雌蓖麻ISSR-PCR反應體系的建立和優化[J]. 山西農業科學，2010，38（1）：15-18.

[10]劉小溪，李枝林，賈文杰，等. 百合ISSR-PCR反應體系的優化[J]. 江蘇農業科學，2012，40（1）：30-33.

[11]張 蕾，嚴 萍，韓正洲，等. 兩面針ISSR-PCR反應體系的建立及優化[J]. 廣州中醫藥大學學報，2012，29（1）：70-74.

2.3 Taq DNA聚合酶的優化

Taq DNA聚合酶的用量是影響擴增的重要因素，濃度過低會使酶過早地消耗完造成合成效率下降，濃度過高容易產生非特異性擴增且增加成本。從圖3可見，不同Taq DNA聚合酶濃度從0.5、1.0、1.5、2.0 U/μL均有擴增產物，濃度在0.5 U/μL條帶相對較弱，1.0、1.5、2.0 U/μL時擴增出的條帶無顯著差異，考慮穩定性和成本，而且1.5 U/μL的條帶亮度高和穩定性強。最終確定Taq DNA聚合酶用量為1.0 U/μL。

2.4 dNTPs濃度的優化

dNTPs濃度與PCR擴增效率有密切關系，dNTPs能與Mg2+結合，使游離的Mg2+濃度降低。濃度高會導致片段缺失，而濃度太低又會導致擴增產率下降^[4]。從圖4中可見，dNTPs濃度為0.15、0.20、 0.25、0.30 mmol/L均有擴增條帶，dNTPs濃度為0.15、0.30 mmol/L時，擴增出的條帶較少；在0.20、0.25 mmol/L時擴增條帶較多，但0.25 mmol/L比0.20 mmol/L 條帶清晰。因此確定dNTPs濃度為0.25 mmol/L。

2.5 退火溫度的優化

為了確定引物的最適退火溫度，參照所選引物序列計算理論退火溫度Tm，Tm=4（G+C）+2（A+T）^[8]。溫度低于Tm值，擴增產物特異性降低，擴增出來的條帶較弱；溫度過高不利于引物擴增。在本試驗中所用引物的Tm值為53 ℃， 從

3 結論與討論

試驗結果表明，通過各個因素的綜合對比分析，得出反應體系中4個因子的最佳濃度：0.25 μmol/L引物、2.0 mmol/L Mg2+、1.0 U/μL Taq DNA聚合酶、0.25 mmol/L dNTPs、50 ng/μL 模板DNA。PCR反應條件：94℃預變性4min；94 ℃ 變性 45 s，UBC 835退火溫度是50 ℃，退火45 s，72 ℃延伸2 min，40個循環；72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。

ISSR-PCR具有高重復性的優點，但其擴增仍受多種因素的影響，如Mg2+用量、引物濃度、Taq[KG*3]DNA聚合酶用量、退火溫度、模板DNA等。試驗研究發現，模板DNA對ISSR-PCR擴增的影響不是很大，而Taq DNA聚合酶和Mg2+對其有很大的作用。Mg2+濃度控制Taq DNA聚合酶的活性，Taq DNA聚合酶的活性又是ISSR-PCR擴增的關鍵。而dNTP是PCR反應的原料，濃度過高時容易導致錯配，同時dNTP會對Mg2+產生拮抗作用^[9]，退火溫度高低制約擴增條帶的分辨率。上述因素相互依賴、相互抑制。為獲得重復性好、可靠性高的擴增條帶^[10-11]，本試驗采用單因素試驗方法來確定各因素的最佳濃度。單因素試驗設計可對每個影響因子不同水平進行直觀的判斷。確定了沙地云杉ISSR-PCR各因素的最適濃度，試驗結果對沙地云杉進行遺傳多樣性分析等研究奠定了基礎。

參考文獻：

[1]李銀科，劉世增，康才周，等. 溫度對樟子松和沙地云杉種子萌發特征的影響[J]. 水土保持通報，2011，31（4）：73-77.

[2]劉瑞芬.沙地云杉引種實驗[J]. 內蒙古林業調查設計，2008，31（6）：75-77，80.

[3]羅玥佶，伍賢進，彭 帥，等. 翻白草總DNA的提取與ISSR-PCR體系的建立與優化[J]. 安徽農業科學，2008，36（3）：895-897，901.

[4]桂騰琴，喬愛民，孫 敏，等. 果梅ISSR-PCR反應體系的建立和優化[J]. 西南大學學報：自然科學版，2007，29（10）：124-128.

[5]趙 謙，杜 虹，莊東紅. ISSR分子標記及其在植物研究中的應用[J]. 分子植物育種，2007，6（增刊1）：123-129.

[6]劉 娜，王昌命，普曉蘭. 云南松胚乳DNA提取與ISSR-PCR反應體系的建立[J]. 西南林學院學報，2009，29（2）：27-30.

[7]喬燕春，林順權，楊向暉，等. 均勻設計在枇杷ISSR-PCR反應體系優化中的應用[J]. 基因組學與應用生物學，2009，28（1）：123-126.

[8]盧圣棟. 現代分子生物學實驗技術[M]. 2版.北京：中國協和醫科大學出版社，1999：57-58.

[9]王 亞，郭志強，王宏偉，等. 單雌蓖麻ISSR-PCR反應體系的建立和優化[J]. 山西農業科學，2010，38（1）：15-18.

[10]劉小溪，李枝林，賈文杰，等. 百合ISSR-PCR反應體系的優化[J]. 江蘇農業科學，2012，40（1）：30-33.

[11]張 蕾，嚴 萍，韓正洲，等. 兩面針ISSR-PCR反應體系的建立及優化[J]. 廣州中醫藥大學學報，2012，29（1）：70-74.

2.3 Taq DNA聚合酶的優化

Taq DNA聚合酶的用量是影響擴增的重要因素，濃度過低會使酶過早地消耗完造成合成效率下降，濃度過高容易產生非特異性擴增且增加成本。從圖3可見，不同Taq DNA聚合酶濃度從0.5、1.0、1.5、2.0 U/μL均有擴增產物，濃度在0.5 U/μL條帶相對較弱，1.0、1.5、2.0 U/μL時擴增出的條帶無顯著差異，考慮穩定性和成本，而且1.5 U/μL的條帶亮度高和穩定性強。最終確定Taq DNA聚合酶用量為1.0 U/μL。

2.4 dNTPs濃度的優化

dNTPs濃度與PCR擴增效率有密切關系，dNTPs能與Mg2+結合，使游離的Mg2+濃度降低。濃度高會導致片段缺失，而濃度太低又會導致擴增產率下降^[4]。從圖4中可見，dNTPs濃度為0.15、0.20、 0.25、0.30 mmol/L均有擴增條帶，dNTPs濃度為0.15、0.30 mmol/L時，擴增出的條帶較少；在0.20、0.25 mmol/L時擴增條帶較多，但0.25 mmol/L比0.20 mmol/L 條帶清晰。因此確定dNTPs濃度為0.25 mmol/L。

2.5 退火溫度的優化

為了確定引物的最適退火溫度，參照所選引物序列計算理論退火溫度Tm，Tm=4（G+C）+2（A+T）^[8]。溫度低于Tm值，擴增產物特異性降低，擴增出來的條帶較弱；溫度過高不利于引物擴增。在本試驗中所用引物的Tm值為53 ℃， 從

3 結論與討論

試驗結果表明，通過各個因素的綜合對比分析，得出反應體系中4個因子的最佳濃度：0.25 μmol/L引物、2.0 mmol/L Mg2+、1.0 U/μL Taq DNA聚合酶、0.25 mmol/L dNTPs、50 ng/μL 模板DNA。PCR反應條件：94℃預變性4min；94 ℃ 變性 45 s，UBC 835退火溫度是50 ℃，退火45 s，72 ℃延伸2 min，40個循環；72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。

ISSR-PCR具有高重復性的優點，但其擴增仍受多種因素的影響，如Mg2+用量、引物濃度、Taq[KG*3]DNA聚合酶用量、退火溫度、模板DNA等。試驗研究發現，模板DNA對ISSR-PCR擴增的影響不是很大，而Taq DNA聚合酶和Mg2+對其有很大的作用。Mg2+濃度控制Taq DNA聚合酶的活性，Taq DNA聚合酶的活性又是ISSR-PCR擴增的關鍵。而dNTP是PCR反應的原料，濃度過高時容易導致錯配，同時dNTP會對Mg2+產生拮抗作用^[9]，退火溫度高低制約擴增條帶的分辨率。上述因素相互依賴、相互抑制。為獲得重復性好、可靠性高的擴增條帶^[10-11]，本試驗采用單因素試驗方法來確定各因素的最佳濃度。單因素試驗設計可對每個影響因子不同水平進行直觀的判斷。確定了沙地云杉ISSR-PCR各因素的最適濃度，試驗結果對沙地云杉進行遺傳多樣性分析等研究奠定了基礎。

參考文獻：

[1]李銀科，劉世增，康才周，等. 溫度對樟子松和沙地云杉種子萌發特征的影響[J]. 水土保持通報，2011，31（4）：73-77.

[2]劉瑞芬.沙地云杉引種實驗[J]. 內蒙古林業調查設計，2008，31（6）：75-77，80.

[3]羅玥佶，伍賢進，彭 帥，等. 翻白草總DNA的提取與ISSR-PCR體系的建立與優化[J]. 安徽農業科學，2008，36（3）：895-897，901.

[4]桂騰琴，喬愛民，孫 敏，等. 果梅ISSR-PCR反應體系的建立和優化[J]. 西南大學學報：自然科學版，2007，29（10）：124-128.

[5]趙 謙，杜 虹，莊東紅. ISSR分子標記及其在植物研究中的應用[J]. 分子植物育種，2007，6（增刊1）：123-129.

[6]劉 娜，王昌命，普曉蘭. 云南松胚乳DNA提取與ISSR-PCR反應體系的建立[J]. 西南林學院學報，2009，29（2）：27-30.

[7]喬燕春，林順權，楊向暉，等. 均勻設計在枇杷ISSR-PCR反應體系優化中的應用[J]. 基因組學與應用生物學，2009，28（1）：123-126.

[8]盧圣棟. 現代分子生物學實驗技術[M]. 2版.北京：中國協和醫科大學出版社，1999：57-58.

[9]王 亞，郭志強，王宏偉，等. 單雌蓖麻ISSR-PCR反應體系的建立和優化[J]. 山西農業科學，2010，38（1）：15-18.

[10]劉小溪，李枝林，賈文杰，等. 百合ISSR-PCR反應體系的優化[J]. 江蘇農業科學，2012，40（1）：30-33.

[11]張 蕾，嚴 萍，韓正洲，等. 兩面針ISSR-PCR反應體系的建立及優化[J]. 廣州中醫藥大學學報，2012，29（1）：70-74.