5種常見食用菌液體發酵產物對黃瓜褐斑菌的抑制作用

徐艷+王東華+紀明山

摘要：研究5種食用菌香菇、杏鮑菇、金針菇、猴頭菇、雞腿菇液體發酵產物對黃瓜褐斑菌的抑制作用。通過母種試管活化培養、搖瓶種子培養、搖瓶發酵培養等一系列操作收集發酵產物，最后采用平板法研究各產物對黃瓜褐斑菌的抑制作用。結果表明，各菌種發酵液的抑菌活性明顯高于菌絲提取物。其中，以香菇、猴頭菇發酵液抑菌活性最好，抑制率達50%以上。猴頭菇發酵液的分離純化結果表明，乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物的抑菌活性均好于原發酵液，其中乙酸乙酯萃取物的抑菌活性最好。

關鍵詞：食用菌；液體發酵產物；平板法；黃瓜褐斑菌；抑菌作用

中圖分類號：S436.421.1+9 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2014）08-0114-02

黃瓜是日常生活的主要蔬菜，隨著保護地黃瓜種植的發展，黃瓜褐斑病逐年加重，已成為保護地黃瓜生產中亟待解決的葉部病害。黃瓜褐斑病是由多主棒孢菌引起的世界性分布的病害。1994年房德純等報道了該病在遼寧省的發生情況，此后，黃瓜褐斑病在華北、西北的露地和保護地相繼發生^[1]。近年來，隨著黃瓜保護地種植規模的不斷擴大，該病害蔓延趨勢明顯，尤其在2008年，全國各地黃瓜產區普遍有黃瓜褐斑病發生，發病嚴重地塊經濟損失在20%以上。在黃瓜褐斑病的防治上，多以百菌清、甲基硫菌靈、福美雙等藥劑為主，這些常見藥劑作為預防藥劑，有病無病都在使用，致使褐斑病菌對其不再敏感，病害一旦在田間流行就很難控制，而且化學農藥也會造成一定的環境污染，給人類生活和生存帶來不利的影響^[2]。目前，許多學者從天然植物中篩選農藥取得了一定的進展^[3-8]，但天然植物受資源限制嚴重，對生態環境有一定的破壞，而且開發成本較高。我國藥食用真菌資源豐富，無毒副作用，從中尋找抑制植物病原菌的活性物質，研制新型殺菌劑以防治植物病害，對栽種符合健康標準的蔬菜具有重要意義。一方面，從藥食用真菌中不斷發現結構新穎和具有顯著生物活性的化合物，這種結構多樣性對于新農藥的發現有重要意義；另一方面，大型藥食用真菌可以較方便地通過菌絲體或孢子發酵培養，實現生產的工業化、規?；a量高、發酵周期短、生產效益高。這為今后可能產業化生產提供了資源保證，相對于受資源限制的植物源農藥而言，這是一個潛在的優勢^[9]。本研究通過平板法，以香菇（Lentinula edodes）、杏鮑菇（Pleurotus eryngii）、金針菇（Flammulina velutipes）、猴頭菇（Hericium erinaceus）、雞腿菇（Coprinus comaus）等幾種常見食用真菌發酵產物為研究對象，分別對黃瓜褐斑菌進行抑菌試驗，進而通過生長速率法分別計算各個菌種發酵產物對黃瓜褐斑病菌的抑菌率。結果表明，發酵液的抑菌活性明顯高于菌絲提取物。其中，以香菇、猴頭菇發酵液抑菌活性最好，抑制率達50%以上。猴頭菇發酵液的分離純化結果表明，乙酸乙酯萃取物抑菌活性最好。

1 材料與方法

1.1 試驗菌株

香菇、杏鮑、金針菇、猴頭菇和雞腿菇等供試菌株均由遼寧省農業科學院提供；黃瓜褐斑菌由沈陽農業大學植物保護學院生物農藥實驗室提供。

1.2 主要試驗儀器

恒溫電熱水浴鍋、高壓蒸汽滅菌鍋、電熱恒溫鼓風干燥箱、電子分析天平、恒溫振蕩箱、超凈工作臺、電動粉碎機、電冰箱。

1.3 方法

1.3.1 培養基的配制

PDA固體培養基含馬鈴薯 200 g/L，葡萄糖20 g/L，瓊脂20 g/L，水1 000 mL。不同菌種的種子培養基與發酵培養基如下。

1.3.1.1 香菇

種子培養基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，酵母膏20 g，KH2PO4 1 g，MgSO4 1.5 g。發酵培養基：玉米粉 40 g，酵母膏3 g，蔗糖25 g，KH2PO4 1 g，MgSO4 1 g，維生素B1 0.05 g，pH值5.25。

1.3.1.2 杏鮑菇

種子培養基：馬鈴薯200 g，麥麩40 g，葡萄糖20 g，KH2PO4 3 g，MgSO4 1.5 g。發酵培養基：玉米粉 30 g，麥麩20 g，酵母膏3 g，葡萄糖20 g，KH2PO4 1 g，MgSO4 0.5 g。

1.3.1.3 金針菇

種子培養基：玉米粉50 g，麥麩30 g，酵母膏10 g，蔗糖4 g，KH2PO4 1 g，MgSO4 0.5 g，維生素B1 0.1 g。發酵培養基：玉米粉30 g，可溶性淀粉20 g，麥麩30 g，蛋白胨10 g，KH2PO4 1 g，MgSO4 0.5 g，維生素B1 0.1 g。

1.3.1.4 猴頭菇

種子培養基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，酵母膏1 g，KH2PO4 2 g，MgSO4 1 g，維生素B1 0.1 g，pH值6.5。發酵培養基：可溶性淀粉25 g，酵母膏25 g，KH2PO4 1 g，MgSO4 1 g，維生素B1 0.1 g，pH值5.0。

1.3.1.5 雞腿菇

種子培養基：蔗糖20 g，酵母粉5 g，KH2PO4 1 g，MgSO4 0.05 g，維生素B1 0.01 g。發酵培養基：蔗糖20 g，酵母粉5 g，麥麩40 g，玉米粉30 g，KH2PO4 3 g，MgSO4 1 g。培養基每瓶100 mL分裝于三角瓶中進行高壓滅菌，121 ℃滅菌20 min后置于超凈臺冷卻備用。

1.3.2 菌種的發酵培養

將培養好的種子液按10%的接種量接入發酵培養基中，在27 ℃搖床中培養，待菌絲生長成熟后結束發酵。

1.3.3 各菌種代謝產物對黃瓜褐斑菌的抑制作用

1.3.3.1 菌絲活性成分的提取

收集菌絲，水洗后低溫干燥。菌絲加水后超聲提取，收集提取液。

1.3.3.2 培養基平板的制備

采用平板法測定各發酵產物的抑菌活性。將滅菌的9 cm直徑平皿分為2組，一組為空白對照，一組為加樣組。各組均加入10 mL PDA培養基，隨后加樣組中加入5 mL 發酵液混勻，空白對照組中則加入5 mL 無菌水混勻，靜置數分鐘待培養基冷凝備用。

1.3.3.3 黃瓜褐斑菌的接種與培養

用已滅菌的打孔器（直徑為10 mm）取已活化好的黃瓜褐斑菌餅，小心放入所有制備好的培養基平板中心（確保褐斑菌能均勻的向四周生長）。接種完成后用封口膜將平皿密封好，放入電熱恒溫鼓風干燥箱中，28 ℃培養 7 d后觀察結果。以上操作均在無菌條件下完成。

1.3.4 生長速率法測定抑菌率

待菌落生長一定時間后用十字交叉法測量黃瓜褐斑菌菌落的直徑，菌落生長直徑（mm）采用3次測量菌落直徑平均值，并用下述公式計算抑菌率：

1.3.5 猴頭菇發酵液的分離純化

將猴頭菇發酵液放入分液漏斗中，依次用乙酸乙酯、正丁醇分別對發酵液樣品進行萃取，每種萃取液重復萃取2 次，分別合并萃取液，將其濃縮，放置在4 ℃冰箱中保存備用。

2 結果與分析

2.1 各菌種發酵產物抑菌試驗結果

試驗結果表明，菌絲提取物幾乎沒有抑制作用，幾種真菌發酵液對黃瓜褐斑菌都有不同程度的抑制作用，培養數天后菌落的菌斑大小各有不同，表1結果表明，香菇、杏鮑菇、金針菇、猴頭菇、雞腿菇這5種常見的食用真菌發酵液均具有不同程度的抑菌效果。其中，香菇和猴頭菇的抑菌率最高，分別為58.8%和60.0%；杏鮑菇和金針菇次之，分別為45.9%和38.8%；雞腿菇的抑菌率最低，僅為29.4%。

3 結論

本研究所選用的5種真菌均為常見的食用真菌，其發酵方法已較成熟，但其對植物病原生長的抑制活性鮮有報道。本研究結果證明了這5種食用真菌發酵液有一定的抑制黃瓜褐斑菌的活性，由于發酵液只進行了初步純化，有必要繼續對發酵液的活性物質進行研究。研究中所提取的各種活性物質對人、動物和環境沒有任何影響，是理想的生物農藥前導物，有較大的開發前景。

參考文獻：

[1]房德純，傅俊范. 黃瓜褐斑病病原與發病情況調查研究初報[J]. 植物保護，1994，20（3）：23-24.

[2]許 遠，張子君，鄒慶道，等. 黃瓜褐斑病的藥劑防治研究[J]. 遼寧農業科學，2000，31（6）：47-48.

[3]Eduardo O，Mariano F，Daniel H，et al.Biological efficiency of polyphenolic extracts from pecan nuts shell（Carya illinoensis），pomegranate husk（Punica granatum） and creosote bush leaves（Larrea tridentata Cov.） against plant pathogenic fungi[J]. Industrial Crops and Products，2010，31（1）：153-157.

[4]朱巧萍，高雪平，程 璐，等. 微波輔助提取香榧假種皮揮發油及其對植物病原真菌的抑制活性[J]. 江蘇農業科學，2013，41（5）：309-311.

[5]Mahlo S M，Mcgaw L J，Eloff J N. Antifungal activity of leaf extracts from South African trees against plant pathogens[J]. Crop Protection，2010，29（12）：1529-1533.

[6]劉紹雄，王金華，熊 智，等. 青蒿乙醇提取物對5齡思茅松毛蟲腸道細菌的抑制作用[J]. 江蘇農業科學，2012，40（4）：141-142.

[7]de Rodríguez D J，Hernández-Castillo D，Rodríguez-García R，et al. Antifungal activity in vitro of aloe vera pulp and liquid fraction against plant pathogenic fungi[J]. Industrial Crops and Products，2005，21（1）：81-87.

[8]吳雪平，田雪亮，項志鋒. 蓖麻籽水提物對黃瓜褐斑病菌的生物活性研究[J]. 西北農業學報，2006，15（6）：215-216.

[9]楊民寶. 銹革孔菌科三種真菌對植物病原菌抑制作用的研究[D]. 哈爾濱：東北林業大學，2009：1.

1.3.3 各菌種代謝產物對黃瓜褐斑菌的抑制作用

1.3.3.1 菌絲活性成分的提取

收集菌絲，水洗后低溫干燥。菌絲加水后超聲提取，收集提取液。

1.3.3.2 培養基平板的制備

采用平板法測定各發酵產物的抑菌活性。將滅菌的9 cm直徑平皿分為2組，一組為空白對照，一組為加樣組。各組均加入10 mL PDA培養基，隨后加樣組中加入5 mL 發酵液混勻，空白對照組中則加入5 mL 無菌水混勻，靜置數分鐘待培養基冷凝備用。

1.3.3.3 黃瓜褐斑菌的接種與培養

用已滅菌的打孔器（直徑為10 mm）取已活化好的黃瓜褐斑菌餅，小心放入所有制備好的培養基平板中心（確保褐斑菌能均勻的向四周生長）。接種完成后用封口膜將平皿密封好，放入電熱恒溫鼓風干燥箱中，28 ℃培養 7 d后觀察結果。以上操作均在無菌條件下完成。

1.3.4 生長速率法測定抑菌率

待菌落生長一定時間后用十字交叉法測量黃瓜褐斑菌菌落的直徑，菌落生長直徑（mm）采用3次測量菌落直徑平均值，并用下述公式計算抑菌率：

1.3.5 猴頭菇發酵液的分離純化

將猴頭菇發酵液放入分液漏斗中，依次用乙酸乙酯、正丁醇分別對發酵液樣品進行萃取，每種萃取液重復萃取2 次，分別合并萃取液，將其濃縮，放置在4 ℃冰箱中保存備用。

2 結果與分析

2.1 各菌種發酵產物抑菌試驗結果

試驗結果表明，菌絲提取物幾乎沒有抑制作用，幾種真菌發酵液對黃瓜褐斑菌都有不同程度的抑制作用，培養數天后菌落的菌斑大小各有不同，表1結果表明，香菇、杏鮑菇、金針菇、猴頭菇、雞腿菇這5種常見的食用真菌發酵液均具有不同程度的抑菌效果。其中，香菇和猴頭菇的抑菌率最高，分別為58.8%和60.0%；杏鮑菇和金針菇次之，分別為45.9%和38.8%；雞腿菇的抑菌率最低，僅為29.4%。

3 結論

本研究所選用的5種真菌均為常見的食用真菌，其發酵方法已較成熟，但其對植物病原生長的抑制活性鮮有報道。本研究結果證明了這5種食用真菌發酵液有一定的抑制黃瓜褐斑菌的活性，由于發酵液只進行了初步純化，有必要繼續對發酵液的活性物質進行研究。研究中所提取的各種活性物質對人、動物和環境沒有任何影響，是理想的生物農藥前導物，有較大的開發前景。

參考文獻：

[1]房德純，傅俊范. 黃瓜褐斑病病原與發病情況調查研究初報[J]. 植物保護，1994，20（3）：23-24.

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[3]Eduardo O，Mariano F，Daniel H，et al.Biological efficiency of polyphenolic extracts from pecan nuts shell（Carya illinoensis），pomegranate husk（Punica granatum） and creosote bush leaves（Larrea tridentata Cov.） against plant pathogenic fungi[J]. Industrial Crops and Products，2010，31（1）：153-157.

[4]朱巧萍，高雪平，程 璐，等. 微波輔助提取香榧假種皮揮發油及其對植物病原真菌的抑制活性[J]. 江蘇農業科學，2013，41（5）：309-311.

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[6]劉紹雄，王金華，熊 智，等. 青蒿乙醇提取物對5齡思茅松毛蟲腸道細菌的抑制作用[J]. 江蘇農業科學，2012，40（4）：141-142.

[7]de Rodríguez D J，Hernández-Castillo D，Rodríguez-García R，et al. Antifungal activity in vitro of aloe vera pulp and liquid fraction against plant pathogenic fungi[J]. Industrial Crops and Products，2005，21（1）：81-87.

[8]吳雪平，田雪亮，項志鋒. 蓖麻籽水提物對黃瓜褐斑病菌的生物活性研究[J]. 西北農業學報，2006，15（6）：215-216.

[9]楊民寶. 銹革孔菌科三種真菌對植物病原菌抑制作用的研究[D]. 哈爾濱：東北林業大學，2009：1.

1.3.3 各菌種代謝產物對黃瓜褐斑菌的抑制作用

1.3.3.1 菌絲活性成分的提取

收集菌絲，水洗后低溫干燥。菌絲加水后超聲提取，收集提取液。

1.3.3.2 培養基平板的制備

采用平板法測定各發酵產物的抑菌活性。將滅菌的9 cm直徑平皿分為2組，一組為空白對照，一組為加樣組。各組均加入10 mL PDA培養基，隨后加樣組中加入5 mL 發酵液混勻，空白對照組中則加入5 mL 無菌水混勻，靜置數分鐘待培養基冷凝備用。

1.3.3.3 黃瓜褐斑菌的接種與培養

用已滅菌的打孔器（直徑為10 mm）取已活化好的黃瓜褐斑菌餅，小心放入所有制備好的培養基平板中心（確保褐斑菌能均勻的向四周生長）。接種完成后用封口膜將平皿密封好，放入電熱恒溫鼓風干燥箱中，28 ℃培養 7 d后觀察結果。以上操作均在無菌條件下完成。

1.3.4 生長速率法測定抑菌率

待菌落生長一定時間后用十字交叉法測量黃瓜褐斑菌菌落的直徑，菌落生長直徑（mm）采用3次測量菌落直徑平均值，并用下述公式計算抑菌率：

1.3.5 猴頭菇發酵液的分離純化

將猴頭菇發酵液放入分液漏斗中，依次用乙酸乙酯、正丁醇分別對發酵液樣品進行萃取，每種萃取液重復萃取2 次，分別合并萃取液，將其濃縮，放置在4 ℃冰箱中保存備用。

2 結果與分析

2.1 各菌種發酵產物抑菌試驗結果

試驗結果表明，菌絲提取物幾乎沒有抑制作用，幾種真菌發酵液對黃瓜褐斑菌都有不同程度的抑制作用，培養數天后菌落的菌斑大小各有不同，表1結果表明，香菇、杏鮑菇、金針菇、猴頭菇、雞腿菇這5種常見的食用真菌發酵液均具有不同程度的抑菌效果。其中，香菇和猴頭菇的抑菌率最高，分別為58.8%和60.0%；杏鮑菇和金針菇次之，分別為45.9%和38.8%；雞腿菇的抑菌率最低，僅為29.4%。

3 結論

本研究所選用的5種真菌均為常見的食用真菌，其發酵方法已較成熟，但其對植物病原生長的抑制活性鮮有報道。本研究結果證明了這5種食用真菌發酵液有一定的抑制黃瓜褐斑菌的活性，由于發酵液只進行了初步純化，有必要繼續對發酵液的活性物質進行研究。研究中所提取的各種活性物質對人、動物和環境沒有任何影響，是理想的生物農藥前導物，有較大的開發前景。

參考文獻：

[1]房德純，傅俊范. 黃瓜褐斑病病原與發病情況調查研究初報[J]. 植物保護，1994，20（3）：23-24.

[2]許 遠，張子君，鄒慶道，等. 黃瓜褐斑病的藥劑防治研究[J]. 遼寧農業科學，2000，31（6）：47-48.

[3]Eduardo O，Mariano F，Daniel H，et al.Biological efficiency of polyphenolic extracts from pecan nuts shell（Carya illinoensis），pomegranate husk（Punica granatum） and creosote bush leaves（Larrea tridentata Cov.） against plant pathogenic fungi[J]. Industrial Crops and Products，2010，31（1）：153-157.

[4]朱巧萍，高雪平，程 璐，等. 微波輔助提取香榧假種皮揮發油及其對植物病原真菌的抑制活性[J]. 江蘇農業科學，2013，41（5）：309-311.

[5]Mahlo S M，Mcgaw L J，Eloff J N. Antifungal activity of leaf extracts from South African trees against plant pathogens[J]. Crop Protection，2010，29（12）：1529-1533.

[6]劉紹雄，王金華，熊 智，等. 青蒿乙醇提取物對5齡思茅松毛蟲腸道細菌的抑制作用[J]. 江蘇農業科學，2012，40（4）：141-142.

[7]de Rodríguez D J，Hernández-Castillo D，Rodríguez-García R，et al. Antifungal activity in vitro of aloe vera pulp and liquid fraction against plant pathogenic fungi[J]. Industrial Crops and Products，2005，21（1）：81-87.

[8]吳雪平，田雪亮，項志鋒. 蓖麻籽水提物對黃瓜褐斑病菌的生物活性研究[J]. 西北農業學報，2006，15（6）：215-216.

[9]楊民寶. 銹革孔菌科三種真菌對植物病原菌抑制作用的研究[D]. 哈爾濱：東北林業大學，2009：1.