篩選和利用海洋細菌防治玉米紋枯病試驗

李德全+談蓉+周鳴鳴+鄧自發(fā)

摘要：從江蘇省南通市沿海灘涂、近海海水、海藻體內(nèi)分離到了862株海洋細菌，以玉米紋枯菌為指示菌對其抑菌活性進行檢測，經(jīng)初篩、復(fù)篩、定量復(fù)篩，獲得7株抑菌效果較好的拮抗細菌，并對篩選出的高效拮抗菌株進行室內(nèi)抑菌及田間防病測定試驗。結(jié)果表明， NH-8菌株的拮抗活性和防效最強，通過形態(tài)特征、生理生化及16S rDNA同源性序列分析，初步鑒定該菌株為芽孢桿菌。

關(guān)鍵詞：海洋細菌；玉米紋枯病；芽孢桿菌

中圖分類號：S435.131.4+9 文獻標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-1302（2014）08-0118-03

玉米紋枯病是由立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）侵染所致的土傳病害。在我國，玉米紋枯病最早于1966年僅吉林省有發(fā)生記載，繼吉林省之后，遼寧省、湖北省、廣西壯族自治區(qū)、河南省、山西省、浙江省、陜西省、河北省、四川省、山東省、江蘇省等省（區(qū)）均陸續(xù)有玉米紋枯病發(fā)生的報道^[1]。近年來，隨著玉米感病品種的種植與推廣，玉米紋枯病發(fā)生與危害日趨嚴(yán)重，已成為玉米高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)的主要限制因子之一^[2]。由于紋枯病菌腐生能力強、寄主范圍很廣，國內(nèi)外至今尚未發(fā)現(xiàn)該病的高抗玉米品種，生產(chǎn)中主要采用化學(xué)殺菌劑進行防治^[3-4]。長期連續(xù)使用化學(xué)農(nóng)藥，容易導(dǎo)致病菌產(chǎn)生抗藥性。生物防治用生態(tài)學(xué)方法控制有害生物，避免使用化學(xué)農(nóng)藥帶來的一系列環(huán)境、能源問題，促進農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展^[5-8]。隨著研究的深入，從陸生資源中分離篩選出新的有效生防資源菌變得越來越困難，探索新的生防資源迫在眉睫。海洋微生物由于其生長環(huán)境很特殊而受到學(xué)者們的關(guān)注，已有從海洋中分離篩選出植物病害生防微生物的報道^[9-11]。但篩選利用海洋細菌用于玉米紋枯病的生物防治目前尚未見報道。本研究從江蘇省南通市沿海灘涂近海海水及海藻中分離篩選到多株對玉米紋枯病菌具有較強拮抗性能的海洋生防細菌，旨在為防治植物病害提供新的生防資源。

1 材料與方法

1.1 樣品采集與處理

樣品采集點為南通市沿海灘涂、近海海水、海藻體內(nèi)。沿海灘涂取植物根際土壤，近海海水取樣地點距海岸1～2 km，選取多點采樣。將樣品密封于滅菌的容器，帶回實驗室4 ℃保存^[12]。

1.2 供試病原菌

玉米紋枯病菌（Rhizoctonia solani）、油菜菌核病菌（Sclerotinia sclerotiorum）、小麥赤霉病菌（Fusarium graminearum）、小麥全蝕病菌（Gaetanannomyces graminis）、棉花枯萎病菌（Fusarium oxysporum f. sp.vasinfectum）、小麥根腐病菌（Helminthosporium sorokianum）由筆者所在實驗室提供。花椰菜根腫病菌（Plasmodiophora brassicae）、白菜黑斑病菌（Alternaria brassicicola）菌株由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所提供。玉米品系YQ7-96 由廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院吳子愷教授提供。

1.3 供試培養(yǎng)基

海水PYS培養(yǎng)基：蛋白胨5 g、酵母膏5 g、MgCl2·2H2O 2 g、葡萄糖5 g、NaCl 16 g、陳海水1 000 mL，用于拮抗細菌的分離、純化、培養(yǎng)^[13-14] 。PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、蔗糖20 g、瓊脂20 g、水1 000 mL，用于植物病原真菌培養(yǎng)。培養(yǎng)基pH值均為7.0～7.2。

1.4 拮抗細菌的篩選

1.4.1 細菌分離 用稀釋法分離海洋細菌，將分離物平板置于26 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，挑取單菌落純化，移植斜面保存于PYS培養(yǎng)基中。

1.4.2 初篩 以玉米紋枯病菌為指示菌，采用平板對峙法^[15]篩選拮抗菌株。將紋枯菌移植到PDA平板上，26 ℃培養(yǎng)48 h，用打孔器在帶菌PDA平板上打孔，在不帶菌的PDA平板上呈對角點接海洋細菌，24 h后在平板中央移入紋枯菌菌盤，26 ℃下培養(yǎng)48 h，測量拮抗帶寬度。每處理重復(fù)3次，對抑菌作用快且強的海洋細菌進行定量復(fù)篩。

1.4.3 復(fù)篩 將初篩菌株移植到海水PYS培養(yǎng)基中，培養(yǎng)液在26 ℃、140 r/min條件下振蕩培養(yǎng)48 h，用移液槍移取 10 μL 菌液，滴在PDA平板上直徑約6 cm的滅菌濾紙片上，進行定量復(fù)篩。測量抑菌圈半徑，抑菌率計算公式如下：

抑菌率=（2×抑菌圈半徑）/45×100%。

1.5 拮抗菌株鑒定

1.5.1 生理生化鑒定、形態(tài)學(xué)觀察 對復(fù)篩得到的1株抑菌率為87.1%的拮抗菌株NH-8進行革蘭氏染色、接觸酶反應(yīng)、淀粉水解、好氧性試驗、明膠液化、耐鹽性試驗、50 ℃生長等生理生化試驗 ^[16-17]。

1.5.2 16S rDNA序列分析鑒定 以拮抗菌株BH-01總DNA為模板，利用細菌16S rDNA通用引物F27 （5′-AGAGTITGATCATGGCTCAG-3′） 和R1492（5′-GCTACCTTGTTACGACTT-3′） 進行PCR擴增，反應(yīng)條件：95 ℃ 3 min；94 ℃ 40 s，55 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，30個循環(huán)；72 ℃ 10 min。將PCR產(chǎn)物檢測、回收、連接、轉(zhuǎn)化、陽性克隆，由生工生物工程（上海）股份有限公司測序。將菌株的16S rDNA序列與GenBank核酸序列數(shù)據(jù)庫中的序列進行比對，回收、純化擴增產(chǎn)物后進行測序，利用NCBI數(shù)據(jù)庫的BLAST程序?qū)y序結(jié)果進行同源性檢索，與GenBank數(shù)據(jù)進行比對分析。