不同方法提取的北細辛精油指紋圖譜分析及殺蟲活性比較

李凡海+張秀省+王桂清+姬蘭柱+劉艷

摘要：采用超臨界CO2萃取法、微波萃取法和水蒸氣蒸餾法提取北細辛精油；以黏蟲2齡幼蟲、小菜蛾3齡幼蟲和淡色庫蚊3齡幼蟲作為供試昆蟲，通過GC-MS指紋圖譜分析，對3種方法提取的精油進行殺蟲活性比較。結(jié)果表明：北細辛精油組成成分復雜（超過27種），超臨界CO2法是細辛精油提取的一種較為理想的方法，其萃取率高達2.27%，且品質(zhì)較好（呈棕黃色），活性較高，對3種試蟲的LC50分別為1216.6、884.0、25.05 mg/L。

關(guān)鍵詞：北細辛；精油；GC-MS；殺蟲活性

中圖分類號：S482.3+9 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2014）08-0124-03

細辛為馬兜鈴科多年生草本植物，屬于重要的中草藥，有北細辛[Asarum heterotropoides Fr. Schmidt var. mandshuricum （Maxim） Kitag.]、漢城細辛（A. sieboldii Miq. var. seoulcnse Nakai）和華細辛（A. sieboldii Miq）。北細辛別稱萬病草、細參、煙袋鍋花、東北細辛，一直供應全國及出口，在國際市場上享有盛名^[1]。細辛的藥用部位為根及根莖，其主要有效成分為揮發(fā)油，即細辛精油^[2]。現(xiàn)代藥理學研究結(jié)果表明，細辛作用廣泛，有抗菌、解熱、催眠、鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、局部麻醉、提高機體新陳代謝等功效^[3]。近年來，細辛在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的價值也逐步顯現(xiàn)出來，很多研究表明，植物精油對昆蟲可以表現(xiàn)出不同程度的引誘、拒食、驅(qū)避、抑制生長發(fā)育及直接的毒殺作用，具有良好的殺蟲抑菌活性^[4-5]。雖然前人對北細辛精油指紋圖譜已經(jīng)有一定的認識，但對不同方法提取的北細辛精油的殺蟲活性未見報道。本研究采用超臨界CO2萃取法、水蒸氣蒸餾法和微波萃取法分別提取北細辛精油，經(jīng)過GC-MS分析，對3種方法提取的精油成分進行鑒定，在此基礎(chǔ)之上選取黏蟲[Mythimna seperata （Walker）]2齡幼蟲、小菜蛾[Plutella xylostella （Linnaeus）]3齡幼蟲和淡色庫蚊（Culex pipiens pallens）3齡幼蟲，作為供試昆蟲，并比較了三者的殺蟲活性，旨在為細辛作為植物源殺蟲劑的開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試植物樣品 試驗樣品為北細辛根，購買于同仁堂藥房，將其進一步陰干、粉碎后過380 μm孔徑篩。

1.1.2 試驗昆蟲 黏蟲2齡幼蟲、小菜蛾3齡幼蟲和淡色庫蚊3齡幼蟲均由沈陽化工研究院新藥生物測定研究室提供。

1.1.3 儀器與其他材料 HP6890/5973型氣-質(zhì)-計算機聯(lián)用機，美國 Hewlett-Packard公司；TC-SFE-42-5-120S設(shè)備，沈陽天誠超臨界萃取有限公司；RE52CS型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠。CO2為食品級，石油醚（60～90 ℃）、正己烷等均為分析純。

1.2 試驗方法

1.2.1 精油提取方法 超臨界CO2萃取法：準確稱取樣品1.85 kg，裝入5 L的萃取罐內(nèi)，超臨界CO2萃取壓力20 MPa，萃取溫度40 ℃，流量20 kg/h；解析釜Ⅰ壓力6～7 MPa，溫度45 ℃；解析釜Ⅱ壓力5～6 MPa，35 ℃，萃取時間為60 min；每20 min收集提取物稱量，計算萃取率，密封后置于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

水蒸氣蒸餾法：將90 g樣品裝入揮發(fā)油提取器中，加水蒸餾6 h，收集精油，稱重并計算萃取率。

微波萃取法：準確稱取樣品5 g，裝入燒瓶中，加入15 mL正己烷，在輻射時間200 s、微波功率600 W的條件下進行微波萃取，每份樣品重復提取3次；用15 mL正己烷洗滌燒瓶的殘渣，將濾液集中于三角瓶中。經(jīng)減壓蒸餾回收正己烷，用無水Na2SO4干燥樣品，24 h后稱重，計算萃取率。

1.2.2 測定條件 氣象色譜條件：石英毛細管柱HP-5MS，50 m×0.25 mm×0.25 μm；程序升溫：在60 s內(nèi)以8 ℃/min速度升至120 ℃，再以2 ℃/min速度升至150 ℃，最后以 10 ℃/min 速度升至280 ℃；載氣：He；柱流量：0.9 mL/min；進樣量：1 μL；進樣口溫度：250 ℃；接口溫度：230 ℃；柱壓：80 kPa；分流比：10 ∶1。

質(zhì)譜條件：離子源為EI；電離電壓：70 eV；離子源溫度：230 ℃；質(zhì)譜范圍：50～500 amu；質(zhì)量范圍：50～500 amu；掃描周期：1 s。

1.2.3 殺蟲活性測定方法 葉碟法：測定北細辛精油對小菜蛾和黏蟲幼蟲的活性。挑選長勢良好、無藥的甘藍（小菜蛾）或玉米嫩葉（黏蟲），用濕布擦干凈，再將甘藍嫩葉用打孔器打成直徑2 cm的葉碟，將玉米嫩葉剪成5 cm長的葉段，放到直徑6 cm、鋪有濾紙的培養(yǎng)皿中，1皿1個葉碟，編號。用噴霧器將細辛精油藥液（濃度分別為3 000、2 500、2 000、1 500、1 000 mg/L）噴在葉碟上，正反面噴均勻，用藥量約0.5 mL，自然涼干。然后各接入10頭供試小菜蛾幼蟲和黏蟲，3次重復，于24 h調(diào)查試蟲的死亡率，計算LC50。以噴含吐溫-80的蒸餾水為對照。

浸漬法：測定北細辛精油對淡色庫蚊幼蟲的殺傷作用。先將24孔培養(yǎng)板編號，分別在孔中加入1.60、1.65、1.70、1.75、1.80 mL帶有20條左右蚊幼蟲的水，再加入0.40、0.35、0.30、0.25、0.20 mL的200 mg/L母液，使終體積為 2 mL，終濃度為40、35、30、25、20 mg/L。在溫度（25±1） ℃、相對濕度60%～80%、光照條件（日/夜=16 h/8 h）下培養(yǎng) 24 h，檢查結(jié)果，計算LC50。振動培養(yǎng)板，并用鑷子輕觸蚊幼蟲身體，以沉入孔底部不動者為死亡。每個樣品重復3次，每次均以2%乙醇浸漬蚊幼蟲作為空白對照。

2 結(jié)果與分析

2.1 北細辛精油的性狀比較

采用超臨界CO2萃取法、微波萃取法和水蒸氣蒸餾法萃取得到的北細辛精油含量和性狀見表1。由表1可以看出，超臨界CO2萃取和水蒸氣蒸餾提取的北細辛精油在外觀性狀上優(yōu)于微波萃取的精油；超臨界CO2萃取率高（2.27%），品質(zhì)較好（棕黃色），適合萃取植物揮發(fā)油。

3 結(jié)論與討論

3.1 不同方法提取的北細辛精油組成成分

采用超臨界CO2萃取、微波萃取和水蒸氣蒸餾3種方法提取北細辛精油，對3種方法比較后發(fā)現(xiàn)，超臨界CO2萃取率高達2.27%，品質(zhì)較好，適合萃取植物揮發(fā)油；從指紋圖譜可以看出，北細辛精油是由多種成分組成的混合物，超臨界CO2萃取法得到的精油成分最多，能夠標定峰值的有35種，水蒸氣蒸餾法得到的精油有28種，微波萃取法得到的精油有27種；如果把次要的小峰也算入的話，北細辛精油的組成成分將超過40種。

近年來，國內(nèi)多位研究者也致力于細辛精油指紋圖譜和成分的研究。杜成智等研究產(chǎn)地對北細辛揮發(fā)油成分的影響發(fā)現(xiàn)，不同產(chǎn)地栽培的北細辛揮發(fā)性成分存在差別，活性成分的積累與環(huán)境有一定的相關(guān)性^[6-7]。陳建偉等研究了提取方法對北細辛揮發(fā)油成分的影響，均發(fā)現(xiàn)提取方法不同，北細辛揮發(fā)油組成成分不同^[8-10]；陳建偉等從北細辛SFE 萃取物中鑒定出7種化學成分，從細辛揮發(fā)油中鑒定出19 種化學成分^[8]。楊厚玲等在超臨界CO2萃取的北細辛揮發(fā)油中共鑒定出69種化合物，在水蒸氣蒸餾法提取的揮發(fā)油中共鑒定出59種化合物^[9]。曾虹燕等通過GC-MS分析可知，水蒸氣蒸餾法鑒定出20種成分，超臨界萃取法鑒定出39種成分，微波萃取法鑒定出38種成分^[10]。與以上研究相比，本研究沒有對北細辛精油具體成分的含量、分子式等進行鑒定，因此還有待于進一步研究。

3.2 不同方法提取的北細辛精油殺蟲活性

3種方法提取的北細辛精油的殺蟲活性不同，其中超臨界CO2萃取的精油生物活性最強，水蒸氣蒸餾得到的精油效果次之，微波萃取的精油殺蟲活性最弱。

學者們也對細辛精油或從細辛中提取到的成分進行了殺蟲活性測定。王桂清等研究結(jié)果證明，北細辛精油對淡色庫蚊幼蟲有較強的毒殺作用，對其成蟲有較好的熏蒸作用^[11]；Perumalsamy等發(fā)現(xiàn)，細辛對淡色庫蚊的成蚊與蚴蚊具有殺滅作用^[12-13]；張靜等的研究證明，細辛醚對家蠅、淡色庫蚊和部分農(nóng)業(yè)害蟲有明顯的殺蟲效果，細辛醚對昆蟲的致毒癥狀與神經(jīng)毒劑類似^[14-15]；劉樹民等研究結(jié)果顯示，北細辛揮發(fā)油對棲北散白蟻具有較好的驅(qū)避作用、熏蒸活性和觸殺效果^[16-17]；韓俊艷等研究結(jié)果表明，北細辛揮發(fā)油在8 μg/mL 時對二斑葉螨的熏蒸毒性最強，24、48 h 的螨死亡率分別為72.6%、100%^[18]。Perumalsamy等研究發(fā)現(xiàn)，北細辛根提取物，尤其是細辛脂素（-）-asarinin和墻草堿值得進一步研究，有望開發(fā)為殺蚊劑，并且這2種化合物對已有抗藥性蚊子種群有控制作用^[13]。本研究結(jié)果也表明，3種方法提取到的北細辛精油均具有一定的殺蟲活性，作為植物源殺蟲劑有一定的研究前景。

本研究結(jié)果證明，超臨界CO2法是細辛精油提取的一種較為理想的方法，其萃取率高，品質(zhì)較好，活性強，同時不存在有機溶劑殘留所帶來的一系列問題。但鑒于細辛精油的組成成分較為復雜，要獲得其中活性較強的化合物，研究其殺蟲活性及作用機理還有待于更深層次的研究。

參考文獻：

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2 結(jié)果與分析

2.1 北細辛精油的性狀比較

采用超臨界CO2萃取法、微波萃取法和水蒸氣蒸餾法萃取得到的北細辛精油含量和性狀見表1。由表1可以看出，超臨界CO2萃取和水蒸氣蒸餾提取的北細辛精油在外觀性狀上優(yōu)于微波萃取的精油；超臨界CO2萃取率高（2.27%），品質(zhì)較好（棕黃色），適合萃取植物揮發(fā)油。

3 結(jié)論與討論

3.1 不同方法提取的北細辛精油組成成分

采用超臨界CO2萃取、微波萃取和水蒸氣蒸餾3種方法提取北細辛精油，對3種方法比較后發(fā)現(xiàn)，超臨界CO2萃取率高達2.27%，品質(zhì)較好，適合萃取植物揮發(fā)油；從指紋圖譜可以看出，北細辛精油是由多種成分組成的混合物，超臨界CO2萃取法得到的精油成分最多，能夠標定峰值的有35種，水蒸氣蒸餾法得到的精油有28種，微波萃取法得到的精油有27種；如果把次要的小峰也算入的話，北細辛精油的組成成分將超過40種。

近年來，國內(nèi)多位研究者也致力于細辛精油指紋圖譜和成分的研究。杜成智等研究產(chǎn)地對北細辛揮發(fā)油成分的影響發(fā)現(xiàn)，不同產(chǎn)地栽培的北細辛揮發(fā)性成分存在差別，活性成分的積累與環(huán)境有一定的相關(guān)性^[6-7]。陳建偉等研究了提取方法對北細辛揮發(fā)油成分的影響，均發(fā)現(xiàn)提取方法不同，北細辛揮發(fā)油組成成分不同^[8-10]；陳建偉等從北細辛SFE 萃取物中鑒定出7種化學成分，從細辛揮發(fā)油中鑒定出19 種化學成分^[8]。楊厚玲等在超臨界CO2萃取的北細辛揮發(fā)油中共鑒定出69種化合物，在水蒸氣蒸餾法提取的揮發(fā)油中共鑒定出59種化合物^[9]。曾虹燕等通過GC-MS分析可知，水蒸氣蒸餾法鑒定出20種成分，超臨界萃取法鑒定出39種成分，微波萃取法鑒定出38種成分^[10]。與以上研究相比，本研究沒有對北細辛精油具體成分的含量、分子式等進行鑒定，因此還有待于進一步研究。

3.2 不同方法提取的北細辛精油殺蟲活性

3種方法提取的北細辛精油的殺蟲活性不同，其中超臨界CO2萃取的精油生物活性最強，水蒸氣蒸餾得到的精油效果次之，微波萃取的精油殺蟲活性最弱。

學者們也對細辛精油或從細辛中提取到的成分進行了殺蟲活性測定。王桂清等研究結(jié)果證明，北細辛精油對淡色庫蚊幼蟲有較強的毒殺作用，對其成蟲有較好的熏蒸作用^[11]；Perumalsamy等發(fā)現(xiàn)，細辛對淡色庫蚊的成蚊與蚴蚊具有殺滅作用^[12-13]；張靜等的研究證明，細辛醚對家蠅、淡色庫蚊和部分農(nóng)業(yè)害蟲有明顯的殺蟲效果，細辛醚對昆蟲的致毒癥狀與神經(jīng)毒劑類似^[14-15]；劉樹民等研究結(jié)果顯示，北細辛揮發(fā)油對棲北散白蟻具有較好的驅(qū)避作用、熏蒸活性和觸殺效果^[16-17]；韓俊艷等研究結(jié)果表明，北細辛揮發(fā)油在8 μg/mL 時對二斑葉螨的熏蒸毒性最強，24、48 h 的螨死亡率分別為72.6%、100%^[18]。Perumalsamy等研究發(fā)現(xiàn)，北細辛根提取物，尤其是細辛脂素（-）-asarinin和墻草堿值得進一步研究，有望開發(fā)為殺蚊劑，并且這2種化合物對已有抗藥性蚊子種群有控制作用^[13]。本研究結(jié)果也表明，3種方法提取到的北細辛精油均具有一定的殺蟲活性，作為植物源殺蟲劑有一定的研究前景。

本研究結(jié)果證明，超臨界CO2法是細辛精油提取的一種較為理想的方法，其萃取率高，品質(zhì)較好，活性強，同時不存在有機溶劑殘留所帶來的一系列問題。但鑒于細辛精油的組成成分較為復雜，要獲得其中活性較強的化合物，研究其殺蟲活性及作用機理還有待于更深層次的研究。

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[11]王桂清，姬蘭柱，張 弘. 遼細辛精油對淡色庫蚊的殺傷作用[J]. 中國生物防治，2008，24（2）：112-115.

[12]Perumalsamy H，Kim N J，Ahn Y J. Larvicidal activity of compounds isolated from Asarum heterotropoides against Culex pipiens pallens，Aedes aegypti，and Ochlerotatus togoi （Diptera：culicidae）[J]. Journal of Medical Entomology，2009，46（6）：1420-1423.

[13]Perumalsamy H，Chang K S，Park C，et al. Larvicidal activity of Asarum heterotropoides root constituents against insecticide-susceptible and-resistant Culex pipiens pallens and Aedes aegypti and Ochlerotatus togoi[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry，2010，58（18）：10001-10006.

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[17]尹 紅，杜心懿，劉樹民，等. 細辛醇提物對棲北散白蟻的毒效及含量測定研究[J]. 中華衛(wèi)生殺蟲藥械，2007，13（4）：263-266.

[18]韓俊艷，王 軍，韓 雪，等. 北細辛揮發(fā)油對二斑葉螨的毒性及其酶的影響[J]. 天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2012，24（4）：525-528.

2 結(jié)果與分析

2.1 北細辛精油的性狀比較

采用超臨界CO2萃取法、微波萃取法和水蒸氣蒸餾法萃取得到的北細辛精油含量和性狀見表1。由表1可以看出，超臨界CO2萃取和水蒸氣蒸餾提取的北細辛精油在外觀性狀上優(yōu)于微波萃取的精油；超臨界CO2萃取率高（2.27%），品質(zhì)較好（棕黃色），適合萃取植物揮發(fā)油。

3 結(jié)論與討論

3.1 不同方法提取的北細辛精油組成成分

采用超臨界CO2萃取、微波萃取和水蒸氣蒸餾3種方法提取北細辛精油，對3種方法比較后發(fā)現(xiàn)，超臨界CO2萃取率高達2.27%，品質(zhì)較好，適合萃取植物揮發(fā)油；從指紋圖譜可以看出，北細辛精油是由多種成分組成的混合物，超臨界CO2萃取法得到的精油成分最多，能夠標定峰值的有35種，水蒸氣蒸餾法得到的精油有28種，微波萃取法得到的精油有27種；如果把次要的小峰也算入的話，北細辛精油的組成成分將超過40種。

近年來，國內(nèi)多位研究者也致力于細辛精油指紋圖譜和成分的研究。杜成智等研究產(chǎn)地對北細辛揮發(fā)油成分的影響發(fā)現(xiàn)，不同產(chǎn)地栽培的北細辛揮發(fā)性成分存在差別，活性成分的積累與環(huán)境有一定的相關(guān)性^[6-7]。陳建偉等研究了提取方法對北細辛揮發(fā)油成分的影響，均發(fā)現(xiàn)提取方法不同，北細辛揮發(fā)油組成成分不同^[8-10]；陳建偉等從北細辛SFE 萃取物中鑒定出7種化學成分，從細辛揮發(fā)油中鑒定出19 種化學成分^[8]。楊厚玲等在超臨界CO2萃取的北細辛揮發(fā)油中共鑒定出69種化合物，在水蒸氣蒸餾法提取的揮發(fā)油中共鑒定出59種化合物^[9]。曾虹燕等通過GC-MS分析可知，水蒸氣蒸餾法鑒定出20種成分，超臨界萃取法鑒定出39種成分，微波萃取法鑒定出38種成分^[10]。與以上研究相比，本研究沒有對北細辛精油具體成分的含量、分子式等進行鑒定，因此還有待于進一步研究。

3.2 不同方法提取的北細辛精油殺蟲活性

3種方法提取的北細辛精油的殺蟲活性不同，其中超臨界CO2萃取的精油生物活性最強，水蒸氣蒸餾得到的精油效果次之，微波萃取的精油殺蟲活性最弱。

學者們也對細辛精油或從細辛中提取到的成分進行了殺蟲活性測定。王桂清等研究結(jié)果證明，北細辛精油對淡色庫蚊幼蟲有較強的毒殺作用，對其成蟲有較好的熏蒸作用^[11]；Perumalsamy等發(fā)現(xiàn)，細辛對淡色庫蚊的成蚊與蚴蚊具有殺滅作用^[12-13]；張靜等的研究證明，細辛醚對家蠅、淡色庫蚊和部分農(nóng)業(yè)害蟲有明顯的殺蟲效果，細辛醚對昆蟲的致毒癥狀與神經(jīng)毒劑類似^[14-15]；劉樹民等研究結(jié)果顯示，北細辛揮發(fā)油對棲北散白蟻具有較好的驅(qū)避作用、熏蒸活性和觸殺效果^[16-17]；韓俊艷等研究結(jié)果表明，北細辛揮發(fā)油在8 μg/mL 時對二斑葉螨的熏蒸毒性最強，24、48 h 的螨死亡率分別為72.6%、100%^[18]。Perumalsamy等研究發(fā)現(xiàn)，北細辛根提取物，尤其是細辛脂素（-）-asarinin和墻草堿值得進一步研究，有望開發(fā)為殺蚊劑，并且這2種化合物對已有抗藥性蚊子種群有控制作用^[13]。本研究結(jié)果也表明，3種方法提取到的北細辛精油均具有一定的殺蟲活性，作為植物源殺蟲劑有一定的研究前景。

本研究結(jié)果證明，超臨界CO2法是細辛精油提取的一種較為理想的方法，其萃取率高，品質(zhì)較好，活性強，同時不存在有機溶劑殘留所帶來的一系列問題。但鑒于細辛精油的組成成分較為復雜，要獲得其中活性較強的化合物，研究其殺蟲活性及作用機理還有待于更深層次的研究。

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