高原地區捕食線蟲性真菌的分離與鑒定

張洪波+張春霞+孫亞麗+多杰才旦+康明

摘要：采用玉米瓊脂粉培養基對祁連縣、共和縣和澤庫縣4個地區的不同土壤樣品進行捕食線蟲性真菌的分離，并利用藏綿羊馬歇爾線蟲第3期幼蟲誘導真菌捕食器官的產生。結果表明，從祁連縣土壤樣品中分離到1株捕食線蟲性真菌，根據菌絲及捕食器官的形態特征，鑒定為少孢節叢孢菌（Arthrobotrys oligospora）。

關鍵詞：高原地區；捕食線蟲性真菌；分離鑒定

中圖分類號：S853.32 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2014）08-0222-02

真菌是一類具有真正細胞核、能產生孢子的微小生物，一般都進行有性繁殖和無性繁殖。捕食線蟲性真菌是自然界的寶貴資源，廣泛分布于土壤、動物糞便、動植物殘體、苔蘚及植物根中，營腐生或寄生生活。捕食線蟲性真菌在土壤中處于低代謝狀態，初期營腐生生長，后期由于營養競爭進入捕食階段，把線蟲作為主要營養來源或作為腐生生活的補充。目前，已發現殺線蟲性真菌200多種，可分為3種類型：第1類是捕食線蟲性真菌，這類真菌能產生捕食線蟲性結構（器官）如黏性菌環（收縮或不收縮）、黏性菌絲、黏性菌網、黏性菌結等^[1]，通過捕食性器官捕獲并殺死線蟲幼蟲^[2-3]，其最大優點是對人和動物安全無害^[4-5]；第2類是內寄生性真菌，這類真菌借助分生孢子來感染線蟲，在線蟲體內生長形成菌體，消化吸收掉線蟲；第3類是包囊體和根瘤線蟲寄生性真菌，主要利用營養菌絲來進攻線蟲蟲卵或雌蟲。捕食線蟲性真菌在自然界中分布最廣泛，其特有的捕食線蟲性結構特征明顯，較其他2種類型易于在培養基上進行觀察、分離和培養。

寄生蟲病嚴重危害著畜牧業的發展，而胃腸道線蟲病又是其中一種主要的寄生蟲病，分布廣、危害大，造成的畜牧業經濟損失巨大。目前，對線蟲病的防治主要依賴于化學藥物。反復使用同一種化學藥物易產生抗藥性蟲株，還會造成動物性食品的藥物殘留，對人身體健康帶來危害，另外，藥物代謝的某些有害成分排出家畜體外，也會對環境造成污染。生物防治因其節能、環保、低毒的特點而被人們廣泛研究，國內外普遍重視利用殺線蟲性真菌對寄生蟲性線蟲病的防治^[6-8]，其中，利用線蟲天敵——捕食線蟲性真菌^[9]進行生物防制研究是最多的。近年來，我國在動物寄生蟲病的生物防治領域研究取得一定的進展，楊曉野等對捕食線蟲性真菌的分離、鑒定及生物防治等進行了大量研究^[2-4]。但是，對于高原地區捕食線蟲性真菌的研究及生物防治尚未見報道。現對青海省祁連縣、共和縣和澤庫縣3個高原地區的不同土壤樣品，開展捕食線蟲性真菌的分離和鑒定，為青海省牛羊線蟲病的防制提供基礎數據，達到生物控制牛羊寄生蟲病的目的。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 設備及藥品 隔水式恒溫培養箱；普通顯微鏡；搪瓷盤；直徑90 mm、高60 mm的玻璃培養皿。瓊脂粉（北京奧博星生物技術責任有限公司，批號：20121308）；青霉素（華北制藥股份有限公司，批號：s1110609）；鹽酸（白銀良友化學試劑有限公司，批號：050315）；氫氧化鈉（天津市化學試劑三廠，批號：850629）；氯化鈉（北京化工廠，批號：821212）；新鮮玉米粉（超市購買）。

1.1.2 玉米粉瓊脂培養基（CMA） 稱取新鮮玉米粉40 g，加蒸餾水1 000 mL，微火煮沸1 h，補蒸餾水至1 000 mL，多層紗布過濾；取濾液5 mL，加蒸餾水495 mL，調pH值至6.0～6.2，加瓊脂粉20 g，經0.68 MPa高壓滅菌20 min后傾注于滅菌玻璃培養皿。

1.1.3 玉米粉瓊脂單抗培養基（SACMA） 配制方法同玉米粉瓊脂培養基，經0.68 MPa高壓滅菌20 min后，冷卻至50～60 ℃，每1 mL玉米粉培養基中加入青霉素200 IU，混勻后再傾注于滅菌玻璃培養皿中，備用。

1.1.4 土壤樣品及綿羊糞便的采集 土壤采于青海省祁連縣、共和縣、湟源縣和澤庫縣4個地區，共40份土樣。其中，祁連縣采集10份土樣，土質濕潤；湟源縣采集3份土樣，土質較濕潤；日月山采集4份土樣，土質干燥；青海大學農牧學院動物房依次在樹根、圈口、墻根采集3份土樣，墻根土質干燥，其他2份土質較濕潤；共和縣采集10份土樣，土質較濕潤；澤庫縣采集10份土樣，土質較濕潤。線蟲幼蟲培養物質使用采自青海大學農牧學院試驗動物房飼養的綿羊糞便，利用線蟲幼蟲培養法得到第3期幼蟲備用。

1.1.5 分生孢子洗脫液 取蒸餾水500 mL，加入4.5 g NaCl配成生理鹽水，分裝于250 mL鹽水瓶中，經0.68 MPa高壓滅菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 第3期線蟲幼蟲的培養 取新鮮羊糞，捏碎后加入少量蒸餾水混勻，捏成山丘狀，放在大平皿中將平皿蓋壓緊，加蒸餾水至平皿2/3處，于25～27 ℃通風溫箱中培養5～7 d。從綿羊真胃中挑取馬歇爾屬或奧斯特屬線蟲雌蟲，從子宮中擠出蟲卵，置于每平皿加2～4粒鹽的蒸餾水中，于 25～27 ℃ 通風溫箱中培養7～10 d，每隔2～4 h攪動1次蟲卵。

1.2.2 捕食線蟲性真菌的分離鑒定 土壤樣品以“十”字形撒在玉米粉瓊脂平板培養基中，每份土樣接種3皿，并在每個玉米粉瓊脂平板培養基內加入約50條線蟲第3期幼蟲；將培養皿置于搪瓷盤內，保持一定濕度，在（20±1） ℃溫箱內培養，每周用普通顯微鏡觀察1次，并加1次幼蟲，誘導真菌捕食器官；在3～5 d后若出現捕蟲現象，利用顯微鏡（10×、40×）觀察并拍攝照片，根據出現捕食線蟲的特征性結構菌環及菌網，參照李天飛等資料^[10]進行分類鑒定。

1.2.3 菌株的純化 對具有捕蟲現象的分離菌株，在顯微鏡下用接種環鉤取，接種到玉米粉瓊脂培養基上，27 ℃通風溫箱培養3～5 d，觀察真菌生長情況。endprint

2 結果與分析

2.1 菌株形態學特征

分離菌株的菌絲發達，呈較密集的絲狀體，菌絲無色有隔；線蟲幼蟲存在時，菌絲上形成菌環；分離菌株分生孢子梗細長、無色、直立、不分枝，分生孢子圍繞著分生孢子梗輪狀排列生長，一般在2輪以上，分生孢子在孢子梗頂部密集成簇狀；分生孢子呈倒卵形，形態豐滿，無色雙胞，雙胞分隔處向內收縮，遠端（上端）細胞較大，孢子基部（下部）較尖（圖1）。

參考文獻：

[1]Nansen P，Grnvold J，Henriksen S A，et al. Interactions between the predacious fungus Arthrobotrys oligospora and third-stage larvae of a series of animal-parasitic nematodes[J]. Veterinary Parasitology，1988，26（3/4）：329-337.

[2]楊曉野，楊蓮茹，劉珍蓮，等. 捕食線蟲性真菌——少孢節叢孢菌CIMH1株捕食特性研究[J]. 中國獸醫寄生蟲病，1999，7（2）：16-19.

[3]楊玉琴，楊曉野，楊蓮茹，等. 少孢節叢孢菌的生長特性研究[J]. 中國獸醫科技，1998，28（10）：24-25.

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[8]Waller P J，Larsen M. The role of nematophagous fungi in the biological control of nematode parasites of livestock[J]. International Journal for Parasitology，1993，23（4）：539-546.

[9]Cooke R C，Godfrey B . A key to the nematode-destroying fungi[J]. Transactions of the British Mycological Society，1964，47（1）：61-74.

[10]李天飛，張克勤，劉杏忠.食線蟲菌物分類學[M]. 北京：中國科學技術出版社，2000.endprint

2 結果與分析

2.1 菌株形態學特征

分離菌株的菌絲發達，呈較密集的絲狀體，菌絲無色有隔；線蟲幼蟲存在時，菌絲上形成菌環；分離菌株分生孢子梗細長、無色、直立、不分枝，分生孢子圍繞著分生孢子梗輪狀排列生長，一般在2輪以上，分生孢子在孢子梗頂部密集成簇狀；分生孢子呈倒卵形，形態豐滿，無色雙胞，雙胞分隔處向內收縮，遠端（上端）細胞較大，孢子基部（下部）較尖（圖1）。

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2 結果與分析

2.1 菌株形態學特征

分離菌株的菌絲發達，呈較密集的絲狀體，菌絲無色有隔；線蟲幼蟲存在時，菌絲上形成菌環；分離菌株分生孢子梗細長、無色、直立、不分枝，分生孢子圍繞著分生孢子梗輪狀排列生長，一般在2輪以上，分生孢子在孢子梗頂部密集成簇狀；分生孢子呈倒卵形，形態豐滿，無色雙胞，雙胞分隔處向內收縮，遠端（上端）細胞較大，孢子基部（下部）較尖（圖1）。

參考文獻：

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[10]李天飛，張克勤，劉杏忠.食線蟲菌物分類學[M]. 北京：中國科學技術出版社，2000.endprint