發酵液中L—赤蘚酮糖的紫外法測定

劉宇鵬+潘龍+鄭小娟+靳魁奇+安珊珊

摘要：采用紫外法測定發酵液中的L-赤蘚酮糖。以謝里瓦諾夫（Seliwanoff）試劑為顯色劑，考察了顯色劑用量、反應溫度、反應時間和顯色穩定時間等因素，確定了優化后的試驗條件。紫外法的線性范圍為0～1.2 g/L，樣品回收率為101.5%～101.9%，測定結果不受發酵液中底物及菌體自溶物影響，具有快速準確的優點。

關鍵詞：L-赤蘚酮糖；Seliwanoff試劑；分光光度法；紫外法測定

中圖分類號：TQ920.1；O657.32 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2014）08-0281-03

L-赤蘚酮糖（L-erythrulose）^[1]是一種自然存在的四碳酮醣，是一種黏稠狀液體，可溶于水，其醛糖形式是L-赤蘚糖，L-赤蘚酮糖可以與皮膚外部或者老死表層中的角蛋白氨基酸（即表皮的角質層）發生反應，在化妝品工業中作為二羥基丙酮^[2]的替代品，解決了大多數人群對二羥基丙酮過敏的問題，同時是多種抗感染藥物的前體化合物^[3]。傳統生產L-赤蘚酮糖的方法是以赤蘚糖醇（meso-erythritol）^[4]為前體的化學合成法，但此法比較繁瑣，且產物為消旋體手性化合物，拆分困難。微生物轉化法通過發酵過程中的酶促反應，可選擇性生成L型產物，且該法操作簡便，綠色環保，能夠解決化學合成法帶來的一系列問題^[5]。因此以赤蘚糖醇作為底物，通過微生物發酵轉化生產L-赤蘚酮糖逐漸引起人們的關注。據報道，發酵液中L-赤蘚酮糖的檢測方法有HPLC法^[6]、薄層色譜法^[7]和容量分析法^[8]等，其中薄層色譜法只能定性分析，無法精確定量；容量分析法的測定受發酵液中其他物質的影響，無法精確測定L-赤蘚酮糖；HPLC法則較為耗時。據報道，在酸性條件下發酵液中酮糖脫水生成糠醛，后者與謝里瓦諾夫（Seliwanoff）試劑反應生成紅色復合物^[3]。本研究表明，L-赤蘚酮糖在酸性條件下也能與Seliwanoff試劑生成棕紅色復合物，該復合物在400 nm處的吸光度與L-赤蘚酮糖濃度的線性關系良好；而底物赤蘚糖醇在此條件下不干擾測定。本研究根據這一原理，建立了紫外法測定發酵液中的L-赤蘚酮糖，方法準確、簡便、靈敏。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

UV-1750型紫外-可見光分光光度計，日本Shimadzu公司；752N型紫外可見分光光度計，上海儀電分析儀器有限公司；1515型高效液相色譜儀，美國Waters公司。

L-赤蘚酮糖（美國Sigma公司）；間苯二酚、濃鹽酸、蛋白胨和磷酸二氫鉀均為分析純；酵母粉為生化試劑；水為蒸餾水。

試驗菌種為氧化葡萄糖酸桿菌（Gluconobacter oxydans 1.637），購自中國普通微生物菌種保藏管理中心。

發酵培養基配方為：赤蘚糖醇5%，蛋白胨0.5%，酵母粉1%，無水磷酸二氫鉀0.1%，碳酸鈣0.3%，pH值6.8。

1.2 試驗方法

1.2.1 溶液配制 L-赤蘚酮糖溶液：精確稱取2g L-赤蘚酮糖置于1 000 mL量瓶中，用水定容，制成2g/L的母液，再分別用水稀釋成0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 g/L的梯度濃度溶液。

Seliwanoff試劑：稱取2 g間苯二酚溶于330mL濃鹽酸中，加水定容至1 000 mL，完全溶解后密封保存。

1.2.2 紫外法測定L-赤蘚酮糖 分別量取0.5mL L-赤蘚酮糖系列濃度溶液和4 mL Seliwanoff試劑于比色管中，沸水浴加熱20 min，流水冷卻；以不含L-赤蘚酮糖的溶液為空白參比，測定樣品的吸光度D400 nm。

發酵液中L-赤蘚酮糖的測定：取對數期種子液，按5%接種量接入250 mL搖瓶中，裝液量30 mL，調節pH值為6.8，于30 ℃振蕩（220 r/min）培養28 h，取1.5 mL發酵液，離心（3 500 r/min）15 min；取0.5 mL上清液，用水稀釋100倍，取0.5 mL稀釋液，再加入4 mL Seliwanoff試劑，沸水浴加熱 20 min，流水冷卻；以未接種發酵液為空白參照，于400 nm處測吸光度D400 nm，根據標準曲線計算發酵液中L-赤蘚酮糖的含量。

1.2.3 HPLC法測定L-赤蘚酮糖條件^[6]色譜柱 Agilent Lichrospher5-NH2柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；檢測波長 277 nm；流動相 乙腈-水（90 ∶10）；柱溫 30 ℃；流速 1 mL/min；進樣量 20 μL。

1.2.4 赤蘚糖醇濃度的測定 用HPLC法^[6]測定發酵液中的赤蘚糖醇。

2 結果與分析

2.1 試驗條件的確定

2.1.1 波長的測定 按照“1.2.2”中的方法，以水為空白對照，掃描不同濃度L-赤蘚酮糖在370～700 nm的吸收光譜。每個樣品重復測定3次。保持Seliwanoff試劑濃度不變，僅改變L-赤蘚酮糖的濃度（0.1～1.2 g/L），所得系列吸收光譜見圖1。由圖1可以看出，在400 nm波長處反應溶液有最大吸收，且吸光度的增加與L-赤蘚酮糖溶液濃度的增加成正比。最終選擇測定波長為400 nm。

3 結論

本研究建立了紫外法測定以赤蘚糖醇為底物的發酵液中的L-赤蘚酮糖。結果顯示，L-赤蘚酮糖濃度超過1.2 g/L后D400 nm大于0.6，因此擬定本法的線性范圍為0.1～1.2 g/L。配制Seliwanoff試劑的溶劑為濃鹽酸與間苯二酚，易揮發，加熱過程中要注意保持密封。經對比試驗，HPLC法和紫外法的測量誤差在2%以內，且本法不受發酵液中赤蘚糖醇和可溶性蛋白的影響，顯色穩定，測量快速準確，適合用于微生物發酵法制備L-赤蘚酮糖工藝中的產物測定。

參考文獻：

[1]Bongs J，Hahn D，Schrken U，et al. Continuous production of erythrulose using transketolase in a membrane reactor[J]. Biotechnology Letters，1997，19（3）：213-216.

[2]Douschan K. Process for the biotechnological preparation of L-erythrulose：WO，01/42483 A1[P].2011-06-14.

[3]張惟杰. 糖復合物生化研究技術[M]. 杭州：浙江大學出版社，1999：540.

[4]張永勤，薛長湖，湯浩源，等. 還原糖的可見分光光度法研究進展[J]. 食品與發酵工業，2007，33（5）：97-99，104.

[5]Sprenger G A，Schrken U，Sprenger G，et al.Transketolase a of Escherichia coli K12[J]. European Journal of Biochemistry，1995，230（2）：525-532.

[6]葛馳宇，張君麗，陳建華. 高效液相色譜法同時測定發酵液中赤蘚糖醇和L-赤蘚酮糖的含量[J]. 色譜，2012，30（8）：843-846.

[7]張永勤，王哲平，宋雨梅，等. 還原糖測定方法的比較研究[J]. 食品工業科技，2010，31（6）：321-323，326.

[8]魏 群. 基礎生物化學實驗[M]. 3版.北京：高等教育出版社，2009：81-82.

[9]劉宇鵬，李 華，孫 楊，等. 發酵液中1，3-二羥基丙酮的分光光度法測定[J]. 中國醫藥工業雜志，2011，42（11）：834-837.endprint

摘要：采用紫外法測定發酵液中的L-赤蘚酮糖。以謝里瓦諾夫（Seliwanoff）試劑為顯色劑，考察了顯色劑用量、反應溫度、反應時間和顯色穩定時間等因素，確定了優化后的試驗條件。紫外法的線性范圍為0～1.2 g/L，樣品回收率為101.5%～101.9%，測定結果不受發酵液中底物及菌體自溶物影響，具有快速準確的優點。

關鍵詞：L-赤蘚酮糖；Seliwanoff試劑；分光光度法；紫外法測定

中圖分類號：TQ920.1；O657.32 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2014）08-0281-03

L-赤蘚酮糖（L-erythrulose）^[1]是一種自然存在的四碳酮醣，是一種黏稠狀液體，可溶于水，其醛糖形式是L-赤蘚糖，L-赤蘚酮糖可以與皮膚外部或者老死表層中的角蛋白氨基酸（即表皮的角質層）發生反應，在化妝品工業中作為二羥基丙酮^[2]的替代品，解決了大多數人群對二羥基丙酮過敏的問題，同時是多種抗感染藥物的前體化合物^[3]。傳統生產L-赤蘚酮糖的方法是以赤蘚糖醇（meso-erythritol）^[4]為前體的化學合成法，但此法比較繁瑣，且產物為消旋體手性化合物，拆分困難。微生物轉化法通過發酵過程中的酶促反應，可選擇性生成L型產物，且該法操作簡便，綠色環保，能夠解決化學合成法帶來的一系列問題^[5]。因此以赤蘚糖醇作為底物，通過微生物發酵轉化生產L-赤蘚酮糖逐漸引起人們的關注。據報道，發酵液中L-赤蘚酮糖的檢測方法有HPLC法^[6]、薄層色譜法^[7]和容量分析法^[8]等，其中薄層色譜法只能定性分析，無法精確定量；容量分析法的測定受發酵液中其他物質的影響，無法精確測定L-赤蘚酮糖；HPLC法則較為耗時。據報道，在酸性條件下發酵液中酮糖脫水生成糠醛，后者與謝里瓦諾夫（Seliwanoff）試劑反應生成紅色復合物^[3]。本研究表明，L-赤蘚酮糖在酸性條件下也能與Seliwanoff試劑生成棕紅色復合物，該復合物在400 nm處的吸光度與L-赤蘚酮糖濃度的線性關系良好；而底物赤蘚糖醇在此條件下不干擾測定。本研究根據這一原理，建立了紫外法測定發酵液中的L-赤蘚酮糖，方法準確、簡便、靈敏。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

UV-1750型紫外-可見光分光光度計，日本Shimadzu公司；752N型紫外可見分光光度計，上海儀電分析儀器有限公司；1515型高效液相色譜儀，美國Waters公司。

L-赤蘚酮糖（美國Sigma公司）；間苯二酚、濃鹽酸、蛋白胨和磷酸二氫鉀均為分析純；酵母粉為生化試劑；水為蒸餾水。

試驗菌種為氧化葡萄糖酸桿菌（Gluconobacter oxydans 1.637），購自中國普通微生物菌種保藏管理中心。

發酵培養基配方為：赤蘚糖醇5%，蛋白胨0.5%，酵母粉1%，無水磷酸二氫鉀0.1%，碳酸鈣0.3%，pH值6.8。

1.2 試驗方法

1.2.1 溶液配制 L-赤蘚酮糖溶液：精確稱取2g L-赤蘚酮糖置于1 000 mL量瓶中，用水定容，制成2g/L的母液，再分別用水稀釋成0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 g/L的梯度濃度溶液。

Seliwanoff試劑：稱取2 g間苯二酚溶于330mL濃鹽酸中，加水定容至1 000 mL，完全溶解后密封保存。

1.2.2 紫外法測定L-赤蘚酮糖 分別量取0.5mL L-赤蘚酮糖系列濃度溶液和4 mL Seliwanoff試劑于比色管中，沸水浴加熱20 min，流水冷卻；以不含L-赤蘚酮糖的溶液為空白參比，測定樣品的吸光度D400 nm。

發酵液中L-赤蘚酮糖的測定：取對數期種子液，按5%接種量接入250 mL搖瓶中，裝液量30 mL，調節pH值為6.8，于30 ℃振蕩（220 r/min）培養28 h，取1.5 mL發酵液，離心（3 500 r/min）15 min；取0.5 mL上清液，用水稀釋100倍，取0.5 mL稀釋液，再加入4 mL Seliwanoff試劑，沸水浴加熱 20 min，流水冷卻；以未接種發酵液為空白參照，于400 nm處測吸光度D400 nm，根據標準曲線計算發酵液中L-赤蘚酮糖的含量。

1.2.3 HPLC法測定L-赤蘚酮糖條件^[6]色譜柱 Agilent Lichrospher5-NH2柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；檢測波長 277 nm；流動相 乙腈-水（90 ∶10）；柱溫 30 ℃；流速 1 mL/min；進樣量 20 μL。

1.2.4 赤蘚糖醇濃度的測定 用HPLC法^[6]測定發酵液中的赤蘚糖醇。

2 結果與分析

2.1 試驗條件的確定

2.1.1 波長的測定 按照“1.2.2”中的方法，以水為空白對照，掃描不同濃度L-赤蘚酮糖在370～700 nm的吸收光譜。每個樣品重復測定3次。保持Seliwanoff試劑濃度不變，僅改變L-赤蘚酮糖的濃度（0.1～1.2 g/L），所得系列吸收光譜見圖1。由圖1可以看出，在400 nm波長處反應溶液有最大吸收，且吸光度的增加與L-赤蘚酮糖溶液濃度的增加成正比。最終選擇測定波長為400 nm。

3 結論

本研究建立了紫外法測定以赤蘚糖醇為底物的發酵液中的L-赤蘚酮糖。結果顯示，L-赤蘚酮糖濃度超過1.2 g/L后D400 nm大于0.6，因此擬定本法的線性范圍為0.1～1.2 g/L。配制Seliwanoff試劑的溶劑為濃鹽酸與間苯二酚，易揮發，加熱過程中要注意保持密封。經對比試驗，HPLC法和紫外法的測量誤差在2%以內，且本法不受發酵液中赤蘚糖醇和可溶性蛋白的影響，顯色穩定，測量快速準確，適合用于微生物發酵法制備L-赤蘚酮糖工藝中的產物測定。

參考文獻：

[1]Bongs J，Hahn D，Schrken U，et al. Continuous production of erythrulose using transketolase in a membrane reactor[J]. Biotechnology Letters，1997，19（3）：213-216.

[2]Douschan K. Process for the biotechnological preparation of L-erythrulose：WO，01/42483 A1[P].2011-06-14.

[3]張惟杰. 糖復合物生化研究技術[M]. 杭州：浙江大學出版社，1999：540.

[4]張永勤，薛長湖，湯浩源，等. 還原糖的可見分光光度法研究進展[J]. 食品與發酵工業，2007，33（5）：97-99，104.

[5]Sprenger G A，Schrken U，Sprenger G，et al.Transketolase a of Escherichia coli K12[J]. European Journal of Biochemistry，1995，230（2）：525-532.

[6]葛馳宇，張君麗，陳建華. 高效液相色譜法同時測定發酵液中赤蘚糖醇和L-赤蘚酮糖的含量[J]. 色譜，2012，30（8）：843-846.

[7]張永勤，王哲平，宋雨梅，等. 還原糖測定方法的比較研究[J]. 食品工業科技，2010，31（6）：321-323，326.

[8]魏 群. 基礎生物化學實驗[M]. 3版.北京：高等教育出版社，2009：81-82.

[9]劉宇鵬，李 華，孫 楊，等. 發酵液中1，3-二羥基丙酮的分光光度法測定[J]. 中國醫藥工業雜志，2011，42（11）：834-837.endprint

摘要：采用紫外法測定發酵液中的L-赤蘚酮糖。以謝里瓦諾夫（Seliwanoff）試劑為顯色劑，考察了顯色劑用量、反應溫度、反應時間和顯色穩定時間等因素，確定了優化后的試驗條件。紫外法的線性范圍為0～1.2 g/L，樣品回收率為101.5%～101.9%，測定結果不受發酵液中底物及菌體自溶物影響，具有快速準確的優點。

關鍵詞：L-赤蘚酮糖；Seliwanoff試劑；分光光度法；紫外法測定

中圖分類號：TQ920.1；O657.32 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2014）08-0281-03

L-赤蘚酮糖（L-erythrulose）^[1]是一種自然存在的四碳酮醣，是一種黏稠狀液體，可溶于水，其醛糖形式是L-赤蘚糖，L-赤蘚酮糖可以與皮膚外部或者老死表層中的角蛋白氨基酸（即表皮的角質層）發生反應，在化妝品工業中作為二羥基丙酮^[2]的替代品，解決了大多數人群對二羥基丙酮過敏的問題，同時是多種抗感染藥物的前體化合物^[3]。傳統生產L-赤蘚酮糖的方法是以赤蘚糖醇（meso-erythritol）^[4]為前體的化學合成法，但此法比較繁瑣，且產物為消旋體手性化合物，拆分困難。微生物轉化法通過發酵過程中的酶促反應，可選擇性生成L型產物，且該法操作簡便，綠色環保，能夠解決化學合成法帶來的一系列問題^[5]。因此以赤蘚糖醇作為底物，通過微生物發酵轉化生產L-赤蘚酮糖逐漸引起人們的關注。據報道，發酵液中L-赤蘚酮糖的檢測方法有HPLC法^[6]、薄層色譜法^[7]和容量分析法^[8]等，其中薄層色譜法只能定性分析，無法精確定量；容量分析法的測定受發酵液中其他物質的影響，無法精確測定L-赤蘚酮糖；HPLC法則較為耗時。據報道，在酸性條件下發酵液中酮糖脫水生成糠醛，后者與謝里瓦諾夫（Seliwanoff）試劑反應生成紅色復合物^[3]。本研究表明，L-赤蘚酮糖在酸性條件下也能與Seliwanoff試劑生成棕紅色復合物，該復合物在400 nm處的吸光度與L-赤蘚酮糖濃度的線性關系良好；而底物赤蘚糖醇在此條件下不干擾測定。本研究根據這一原理，建立了紫外法測定發酵液中的L-赤蘚酮糖，方法準確、簡便、靈敏。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

UV-1750型紫外-可見光分光光度計，日本Shimadzu公司；752N型紫外可見分光光度計，上海儀電分析儀器有限公司；1515型高效液相色譜儀，美國Waters公司。

L-赤蘚酮糖（美國Sigma公司）；間苯二酚、濃鹽酸、蛋白胨和磷酸二氫鉀均為分析純；酵母粉為生化試劑；水為蒸餾水。

試驗菌種為氧化葡萄糖酸桿菌（Gluconobacter oxydans 1.637），購自中國普通微生物菌種保藏管理中心。

發酵培養基配方為：赤蘚糖醇5%，蛋白胨0.5%，酵母粉1%，無水磷酸二氫鉀0.1%，碳酸鈣0.3%，pH值6.8。

1.2 試驗方法

1.2.1 溶液配制 L-赤蘚酮糖溶液：精確稱取2g L-赤蘚酮糖置于1 000 mL量瓶中，用水定容，制成2g/L的母液，再分別用水稀釋成0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 g/L的梯度濃度溶液。

Seliwanoff試劑：稱取2 g間苯二酚溶于330mL濃鹽酸中，加水定容至1 000 mL，完全溶解后密封保存。

1.2.2 紫外法測定L-赤蘚酮糖 分別量取0.5mL L-赤蘚酮糖系列濃度溶液和4 mL Seliwanoff試劑于比色管中，沸水浴加熱20 min，流水冷卻；以不含L-赤蘚酮糖的溶液為空白參比，測定樣品的吸光度D400 nm。

發酵液中L-赤蘚酮糖的測定：取對數期種子液，按5%接種量接入250 mL搖瓶中，裝液量30 mL，調節pH值為6.8，于30 ℃振蕩（220 r/min）培養28 h，取1.5 mL發酵液，離心（3 500 r/min）15 min；取0.5 mL上清液，用水稀釋100倍，取0.5 mL稀釋液，再加入4 mL Seliwanoff試劑，沸水浴加熱 20 min，流水冷卻；以未接種發酵液為空白參照，于400 nm處測吸光度D400 nm，根據標準曲線計算發酵液中L-赤蘚酮糖的含量。

1.2.3 HPLC法測定L-赤蘚酮糖條件^[6]色譜柱 Agilent Lichrospher5-NH2柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；檢測波長 277 nm；流動相 乙腈-水（90 ∶10）；柱溫 30 ℃；流速 1 mL/min；進樣量 20 μL。

1.2.4 赤蘚糖醇濃度的測定 用HPLC法^[6]測定發酵液中的赤蘚糖醇。

2 結果與分析

2.1 試驗條件的確定

2.1.1 波長的測定 按照“1.2.2”中的方法，以水為空白對照，掃描不同濃度L-赤蘚酮糖在370～700 nm的吸收光譜。每個樣品重復測定3次。保持Seliwanoff試劑濃度不變，僅改變L-赤蘚酮糖的濃度（0.1～1.2 g/L），所得系列吸收光譜見圖1。由圖1可以看出，在400 nm波長處反應溶液有最大吸收，且吸光度的增加與L-赤蘚酮糖溶液濃度的增加成正比。最終選擇測定波長為400 nm。

3 結論

本研究建立了紫外法測定以赤蘚糖醇為底物的發酵液中的L-赤蘚酮糖。結果顯示，L-赤蘚酮糖濃度超過1.2 g/L后D400 nm大于0.6，因此擬定本法的線性范圍為0.1～1.2 g/L。配制Seliwanoff試劑的溶劑為濃鹽酸與間苯二酚，易揮發，加熱過程中要注意保持密封。經對比試驗，HPLC法和紫外法的測量誤差在2%以內，且本法不受發酵液中赤蘚糖醇和可溶性蛋白的影響，顯色穩定，測量快速準確，適合用于微生物發酵法制備L-赤蘚酮糖工藝中的產物測定。

參考文獻：

[1]Bongs J，Hahn D，Schrken U，et al. Continuous production of erythrulose using transketolase in a membrane reactor[J]. Biotechnology Letters，1997，19（3）：213-216.

[2]Douschan K. Process for the biotechnological preparation of L-erythrulose：WO，01/42483 A1[P].2011-06-14.

[3]張惟杰. 糖復合物生化研究技術[M]. 杭州：浙江大學出版社，1999：540.

[4]張永勤，薛長湖，湯浩源，等. 還原糖的可見分光光度法研究進展[J]. 食品與發酵工業，2007，33（5）：97-99，104.

[5]Sprenger G A，Schrken U，Sprenger G，et al.Transketolase a of Escherichia coli K12[J]. European Journal of Biochemistry，1995，230（2）：525-532.

[6]葛馳宇，張君麗，陳建華. 高效液相色譜法同時測定發酵液中赤蘚糖醇和L-赤蘚酮糖的含量[J]. 色譜，2012，30（8）：843-846.

[7]張永勤，王哲平，宋雨梅，等. 還原糖測定方法的比較研究[J]. 食品工業科技，2010，31（6）：321-323，326.

[8]魏 群. 基礎生物化學實驗[M]. 3版.北京：高等教育出版社，2009：81-82.

[9]劉宇鵬，李 華，孫 楊，等. 發酵液中1，3-二羥基丙酮的分光光度法測定[J]. 中國醫藥工業雜志，2011，42（11）：834-837.endprint