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高效液相色譜法測定水產(chǎn)品中的斑蝥黃

2014-10-23 11:11:12楊姝麗吳祥慶黎小正吳明媛謝宗升陳靜秦振發(fā)黃鸞玉
江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2014年8期

楊姝麗+吳祥慶+黎小正+吳明媛+謝宗升+陳靜+秦振發(fā)+黃鸞玉

摘要:建立了一種高效液相色譜測定水產(chǎn)品中斑蝥黃的方法。樣品經(jīng)乙腈萃取,用乙腈和水為流動相,用液相色譜-紫外檢測器檢測,采用外標(biāo)法定量。該方法檢出限為10 μg/kg;斑蝥黃質(zhì)量濃度在0.02~10 μg/mL時線性良好,相關(guān)系數(shù)0.999 4;不同濃度的加標(biāo)回收率為90.1%~96.5%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為2.0%~4.2%(n=6)。該方法簡便、準(zhǔn)確,精密度良好,消耗少,適用于水產(chǎn)品中斑蝥黃殘留量的測定。

關(guān)鍵詞:高效液相色譜法;斑蝥黃;水產(chǎn)品

中圖分類號:O657.7+2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

文章編號:1002-1302(2014)08-0308-02

斑蝥黃(astaxanthin)化學(xué)名稱β-胡蘿卜素-4,4′-二酮,亦稱角黃素,分子式為C40H52O2。天然的斑蝥黃具有抗氧化、消除自由基的作用,在生物體內(nèi)的含量甚微。隨著人工合成斑蝥黃的工業(yè)化,其在飼料、食品、化工、醫(yī)藥等行業(yè)得到了廣泛的應(yīng)用[1]。然而,近年來的研究結(jié)果表明,人體吸收斑蝥黃后會積累在視網(wǎng)膜上,從而造成視力減退等眼疾。為此,歐盟于2003年出臺法規(guī)將飼料中的斑蝥黃最高含量從原來的80 mg/kg降低到25 mg/kg[2]。日本于2006年5月29日實施的“肯定列表制度”規(guī)定:禽蛋和豬、牛、水產(chǎn)品等動物源性食品中角黃素最大殘留限量為0.1 mg/kg。2008年我國農(nóng)業(yè)部1126公告即《飼料添加劑品種目錄》中規(guī)定,斑蝥黃被允許添加在家禽養(yǎng)殖飼料中,而不允許在水產(chǎn)飼料中添加。斑蝥黃重要用途之一是作為蛋黃著色劑飼喂產(chǎn)蛋家禽,使蛋黃變成人們喜愛的橙紅色,但不法商販將著色劑超量飼喂家禽現(xiàn)象依然存在。雖然在水產(chǎn)養(yǎng)殖中禁止使用斑蝥黃,但是由于其具有較好的著色效果,喂養(yǎng)后的魚類色澤更好、銷售價格更高,違規(guī)使用的現(xiàn)象較多。給水產(chǎn)品質(zhì)量安全帶來了隱患。目前,斑蝥黃的檢測方法主要有色譜法[3-6]、分光光度法[7]、薄層色譜法[8],但主要是針對飼料或者家禽類產(chǎn)品。由于水產(chǎn)品的特殊性,在檢測技術(shù)上要求更高。本研究設(shè)立了水產(chǎn)品中斑蝥黃的高效液相色譜測定方法,有效消除了脂類及其他雜質(zhì)對待測物的干擾,降低了損耗,減少了有機溶劑用量,提高了回收率、準(zhǔn)確度和精密度。該方法滿足水產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測的需要,對于應(yīng)對日本肯定列表制度,克服技術(shù)性貿(mào)易壁壘,增加出口,保護漁民和消費者權(quán)益具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Thermo Accela PDA液相色譜儀(美國Thermo公司),配紫外檢測器;電子天平(瑞士梅特勒公司),感量0.000 1 g;SK3300LH超聲儀(上??茖?dǎo)儀器公司);TDD-4離心機(長沙平凡儀器儀表有限公司);B-490旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(美國 BUCHI公司)。

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)斑蝥黃,純度≥98%,由德國Dr. Ehrenstorfer公司生產(chǎn)。乙腈為色譜純,購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司。濾膜:0.22 μm。

1.2 斑蝥黃標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)貯備液

準(zhǔn)確稱取斑蝥黃標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)10 mg(精確到0.1 mg),用乙腈溶解,轉(zhuǎn)入容量瓶定容至100 mL,搖勻,配成濃度為100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)貯備液,4 ℃以下避光保存,有效期3個月。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)中間液

準(zhǔn)確吸取斑蝥黃標(biāo)準(zhǔn)貯備液1.0 mL于10 mL容量瓶中,用乙腈稀釋定容,搖勻,配成濃度為10.0 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)中間液。臨用前配制。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液

在室溫下,分別取標(biāo)準(zhǔn)中間液0、10、20、50、100、200、500、1 000 μL,各置10 mL容量瓶中用乙腈稀釋定容,搖勻。該標(biāo)準(zhǔn)系列濃度分別為0、0.01、0.02、0.05、0.10、0.20、0.50、1.00 μg/mL。臨用前配制。

1.3 樣品前處理

稱取5 g均質(zhì)后的水產(chǎn)品樣品于50 mL離心管中,加入10 mL乙腈,超聲提取2 min,勻漿提取30 s,以4 000 r/min離心5 min。另取一支50 mL離心管加10 mL乙腈,洗滌勻漿刀頭10 s,洗滌液移入前一離心管中,渦旋混合30 s,超聲提取 2 min,以4 000 r/min離心5 min;合并上清液,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干,用乙腈定容至10 mL,過0.22 μm濾膜,待上機分析。

1.4 色譜分析條件

色譜柱:Hypersil GOLD C18液相色譜柱(2.1 mm×100 mm,1.9 μm),流動相:A相為乙腈,B相為水,梯度洗脫程序見表1;流速:200 μL/min;柱溫:30 ℃;樣品盤溫度 15 ℃;進(jìn)樣量:20 μL;檢測波長:475 nm。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖

在“1.4”節(jié)規(guī)定的色譜條件下,斑蝥黃標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖如圖1所示,濃度為2.00 μg/mL。

2.7 方法檢出限

以空白水產(chǎn)品為基質(zhì)加標(biāo),按照3倍信噪比(S/N≥3)估算最低檢出限,本方法檢測限為10 μg/kg。

3 結(jié)語

本研究采用乙腈萃取,流動相為乙腈和水,萃取率高,出峰快,峰形良好;該方法簡便,準(zhǔn)確度和精密度好,靈敏度高,檢出限低,滿足水產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測分析的要求。

參考文獻(xiàn):

[1]汪洪濤,徐學(xué)明,金征宇. 角黃素的性質(zhì)與開發(fā)應(yīng)用[J]. 糧食與飼料工業(yè),2003(6):31-32.

[2]EU. Animal Feed-Brighter Eyesight or Brighter Salmon? Commission Decides New Rules on Colouring Feed Additive[EB/OL]. (2002-01-27)[2013-09-03]. http://www.foodlaw.rdg.ac.uk/news/eu-03009.htm.

[3]Del Campo J A,Rodríguez H,Moreno J,et a1.Accumulation of astaxanthin and lutein in Chlorella zofingiensis (Chlorophyta)[J]. Applied Microbiology and Biotechnology,2004,64(6):848-854.

[4]余孔捷,錢 疆,楊 方,等. 高效液相色譜法測定動物源性食品中角黃素、蝦青素的研究[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè),2008,34(3):145-148.

[5]王全林,史萍萍,張書芬,等. 反相高效液相色譜法同時測定咸鴨蛋黃中的斑蝥黃和蘇丹紅[J]. 色譜,2007,25(6):864-866.

[6]張 華,馬 鑫,楊 鶯,等. 固相萃取-反高效液相色譜法同時測定飼料中角黃素和蝦青素[J]. 色譜,2008,26(3):392-394.

[7]劉良忠,彭光華,王海濱,等. 天然紅心鴨蛋中紅色素的化學(xué)及光譜性質(zhì)研究[J]. 食品科學(xué),2004,25(11):265-268.

[8]Tolasa S,Cakli S,Ostermeyer U.Determination of astaxanthin and canthaxanthin in salmonid[J]. European Food Research and Technology,2005,221(6):787-791.endprint

摘要:建立了一種高效液相色譜測定水產(chǎn)品中斑蝥黃的方法。樣品經(jīng)乙腈萃取,用乙腈和水為流動相,用液相色譜-紫外檢測器檢測,采用外標(biāo)法定量。該方法檢出限為10 μg/kg;斑蝥黃質(zhì)量濃度在0.02~10 μg/mL時線性良好,相關(guān)系數(shù)0.999 4;不同濃度的加標(biāo)回收率為90.1%~96.5%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為2.0%~4.2%(n=6)。該方法簡便、準(zhǔn)確,精密度良好,消耗少,適用于水產(chǎn)品中斑蝥黃殘留量的測定。

關(guān)鍵詞:高效液相色譜法;斑蝥黃;水產(chǎn)品

中圖分類號:O657.7+2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

文章編號:1002-1302(2014)08-0308-02

斑蝥黃(astaxanthin)化學(xué)名稱β-胡蘿卜素-4,4′-二酮,亦稱角黃素,分子式為C40H52O2。天然的斑蝥黃具有抗氧化、消除自由基的作用,在生物體內(nèi)的含量甚微。隨著人工合成斑蝥黃的工業(yè)化,其在飼料、食品、化工、醫(yī)藥等行業(yè)得到了廣泛的應(yīng)用[1]。然而,近年來的研究結(jié)果表明,人體吸收斑蝥黃后會積累在視網(wǎng)膜上,從而造成視力減退等眼疾。為此,歐盟于2003年出臺法規(guī)將飼料中的斑蝥黃最高含量從原來的80 mg/kg降低到25 mg/kg[2]。日本于2006年5月29日實施的“肯定列表制度”規(guī)定:禽蛋和豬、牛、水產(chǎn)品等動物源性食品中角黃素最大殘留限量為0.1 mg/kg。2008年我國農(nóng)業(yè)部1126公告即《飼料添加劑品種目錄》中規(guī)定,斑蝥黃被允許添加在家禽養(yǎng)殖飼料中,而不允許在水產(chǎn)飼料中添加。斑蝥黃重要用途之一是作為蛋黃著色劑飼喂產(chǎn)蛋家禽,使蛋黃變成人們喜愛的橙紅色,但不法商販將著色劑超量飼喂家禽現(xiàn)象依然存在。雖然在水產(chǎn)養(yǎng)殖中禁止使用斑蝥黃,但是由于其具有較好的著色效果,喂養(yǎng)后的魚類色澤更好、銷售價格更高,違規(guī)使用的現(xiàn)象較多。給水產(chǎn)品質(zhì)量安全帶來了隱患。目前,斑蝥黃的檢測方法主要有色譜法[3-6]、分光光度法[7]、薄層色譜法[8],但主要是針對飼料或者家禽類產(chǎn)品。由于水產(chǎn)品的特殊性,在檢測技術(shù)上要求更高。本研究設(shè)立了水產(chǎn)品中斑蝥黃的高效液相色譜測定方法,有效消除了脂類及其他雜質(zhì)對待測物的干擾,降低了損耗,減少了有機溶劑用量,提高了回收率、準(zhǔn)確度和精密度。該方法滿足水產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測的需要,對于應(yīng)對日本肯定列表制度,克服技術(shù)性貿(mào)易壁壘,增加出口,保護漁民和消費者權(quán)益具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Thermo Accela PDA液相色譜儀(美國Thermo公司),配紫外檢測器;電子天平(瑞士梅特勒公司),感量0.000 1 g;SK3300LH超聲儀(上海科導(dǎo)儀器公司);TDD-4離心機(長沙平凡儀器儀表有限公司);B-490旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(美國 BUCHI公司)。

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)斑蝥黃,純度≥98%,由德國Dr. Ehrenstorfer公司生產(chǎn)。乙腈為色譜純,購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司。濾膜:0.22 μm。

1.2 斑蝥黃標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)貯備液

準(zhǔn)確稱取斑蝥黃標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)10 mg(精確到0.1 mg),用乙腈溶解,轉(zhuǎn)入容量瓶定容至100 mL,搖勻,配成濃度為100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)貯備液,4 ℃以下避光保存,有效期3個月。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)中間液

準(zhǔn)確吸取斑蝥黃標(biāo)準(zhǔn)貯備液1.0 mL于10 mL容量瓶中,用乙腈稀釋定容,搖勻,配成濃度為10.0 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)中間液。臨用前配制。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液

在室溫下,分別取標(biāo)準(zhǔn)中間液0、10、20、50、100、200、500、1 000 μL,各置10 mL容量瓶中用乙腈稀釋定容,搖勻。該標(biāo)準(zhǔn)系列濃度分別為0、0.01、0.02、0.05、0.10、0.20、0.50、1.00 μg/mL。臨用前配制。

1.3 樣品前處理

稱取5 g均質(zhì)后的水產(chǎn)品樣品于50 mL離心管中,加入10 mL乙腈,超聲提取2 min,勻漿提取30 s,以4 000 r/min離心5 min。另取一支50 mL離心管加10 mL乙腈,洗滌勻漿刀頭10 s,洗滌液移入前一離心管中,渦旋混合30 s,超聲提取 2 min,以4 000 r/min離心5 min;合并上清液,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干,用乙腈定容至10 mL,過0.22 μm濾膜,待上機分析。

1.4 色譜分析條件

色譜柱:Hypersil GOLD C18液相色譜柱(2.1 mm×100 mm,1.9 μm),流動相:A相為乙腈,B相為水,梯度洗脫程序見表1;流速:200 μL/min;柱溫:30 ℃;樣品盤溫度 15 ℃;進(jìn)樣量:20 μL;檢測波長:475 nm。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖

在“1.4”節(jié)規(guī)定的色譜條件下,斑蝥黃標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖如圖1所示,濃度為2.00 μg/mL。

2.7 方法檢出限

以空白水產(chǎn)品為基質(zhì)加標(biāo),按照3倍信噪比(S/N≥3)估算最低檢出限,本方法檢測限為10 μg/kg。

3 結(jié)語

本研究采用乙腈萃取,流動相為乙腈和水,萃取率高,出峰快,峰形良好;該方法簡便,準(zhǔn)確度和精密度好,靈敏度高,檢出限低,滿足水產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測分析的要求。

參考文獻(xiàn):

[1]汪洪濤,徐學(xué)明,金征宇. 角黃素的性質(zhì)與開發(fā)應(yīng)用[J]. 糧食與飼料工業(yè),2003(6):31-32.

[2]EU. Animal Feed-Brighter Eyesight or Brighter Salmon? Commission Decides New Rules on Colouring Feed Additive[EB/OL]. (2002-01-27)[2013-09-03]. http://www.foodlaw.rdg.ac.uk/news/eu-03009.htm.

[3]Del Campo J A,Rodríguez H,Moreno J,et a1.Accumulation of astaxanthin and lutein in Chlorella zofingiensis (Chlorophyta)[J]. Applied Microbiology and Biotechnology,2004,64(6):848-854.

[4]余孔捷,錢 疆,楊 方,等. 高效液相色譜法測定動物源性食品中角黃素、蝦青素的研究[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè),2008,34(3):145-148.

[5]王全林,史萍萍,張書芬,等. 反相高效液相色譜法同時測定咸鴨蛋黃中的斑蝥黃和蘇丹紅[J]. 色譜,2007,25(6):864-866.

[6]張 華,馬 鑫,楊 鶯,等. 固相萃取-反高效液相色譜法同時測定飼料中角黃素和蝦青素[J]. 色譜,2008,26(3):392-394.

[7]劉良忠,彭光華,王海濱,等. 天然紅心鴨蛋中紅色素的化學(xué)及光譜性質(zhì)研究[J]. 食品科學(xué),2004,25(11):265-268.

[8]Tolasa S,Cakli S,Ostermeyer U.Determination of astaxanthin and canthaxanthin in salmonid[J]. European Food Research and Technology,2005,221(6):787-791.endprint

摘要:建立了一種高效液相色譜測定水產(chǎn)品中斑蝥黃的方法。樣品經(jīng)乙腈萃取,用乙腈和水為流動相,用液相色譜-紫外檢測器檢測,采用外標(biāo)法定量。該方法檢出限為10 μg/kg;斑蝥黃質(zhì)量濃度在0.02~10 μg/mL時線性良好,相關(guān)系數(shù)0.999 4;不同濃度的加標(biāo)回收率為90.1%~96.5%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為2.0%~4.2%(n=6)。該方法簡便、準(zhǔn)確,精密度良好,消耗少,適用于水產(chǎn)品中斑蝥黃殘留量的測定。

關(guān)鍵詞:高效液相色譜法;斑蝥黃;水產(chǎn)品

中圖分類號:O657.7+2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

文章編號:1002-1302(2014)08-0308-02

斑蝥黃(astaxanthin)化學(xué)名稱β-胡蘿卜素-4,4′-二酮,亦稱角黃素,分子式為C40H52O2。天然的斑蝥黃具有抗氧化、消除自由基的作用,在生物體內(nèi)的含量甚微。隨著人工合成斑蝥黃的工業(yè)化,其在飼料、食品、化工、醫(yī)藥等行業(yè)得到了廣泛的應(yīng)用[1]。然而,近年來的研究結(jié)果表明,人體吸收斑蝥黃后會積累在視網(wǎng)膜上,從而造成視力減退等眼疾。為此,歐盟于2003年出臺法規(guī)將飼料中的斑蝥黃最高含量從原來的80 mg/kg降低到25 mg/kg[2]。日本于2006年5月29日實施的“肯定列表制度”規(guī)定:禽蛋和豬、牛、水產(chǎn)品等動物源性食品中角黃素最大殘留限量為0.1 mg/kg。2008年我國農(nóng)業(yè)部1126公告即《飼料添加劑品種目錄》中規(guī)定,斑蝥黃被允許添加在家禽養(yǎng)殖飼料中,而不允許在水產(chǎn)飼料中添加。斑蝥黃重要用途之一是作為蛋黃著色劑飼喂產(chǎn)蛋家禽,使蛋黃變成人們喜愛的橙紅色,但不法商販將著色劑超量飼喂家禽現(xiàn)象依然存在。雖然在水產(chǎn)養(yǎng)殖中禁止使用斑蝥黃,但是由于其具有較好的著色效果,喂養(yǎng)后的魚類色澤更好、銷售價格更高,違規(guī)使用的現(xiàn)象較多。給水產(chǎn)品質(zhì)量安全帶來了隱患。目前,斑蝥黃的檢測方法主要有色譜法[3-6]、分光光度法[7]、薄層色譜法[8],但主要是針對飼料或者家禽類產(chǎn)品。由于水產(chǎn)品的特殊性,在檢測技術(shù)上要求更高。本研究設(shè)立了水產(chǎn)品中斑蝥黃的高效液相色譜測定方法,有效消除了脂類及其他雜質(zhì)對待測物的干擾,降低了損耗,減少了有機溶劑用量,提高了回收率、準(zhǔn)確度和精密度。該方法滿足水產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測的需要,對于應(yīng)對日本肯定列表制度,克服技術(shù)性貿(mào)易壁壘,增加出口,保護漁民和消費者權(quán)益具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Thermo Accela PDA液相色譜儀(美國Thermo公司),配紫外檢測器;電子天平(瑞士梅特勒公司),感量0.000 1 g;SK3300LH超聲儀(上海科導(dǎo)儀器公司);TDD-4離心機(長沙平凡儀器儀表有限公司);B-490旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(美國 BUCHI公司)。

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)斑蝥黃,純度≥98%,由德國Dr. Ehrenstorfer公司生產(chǎn)。乙腈為色譜純,購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司。濾膜:0.22 μm。

1.2 斑蝥黃標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)貯備液

準(zhǔn)確稱取斑蝥黃標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)10 mg(精確到0.1 mg),用乙腈溶解,轉(zhuǎn)入容量瓶定容至100 mL,搖勻,配成濃度為100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)貯備液,4 ℃以下避光保存,有效期3個月。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)中間液

準(zhǔn)確吸取斑蝥黃標(biāo)準(zhǔn)貯備液1.0 mL于10 mL容量瓶中,用乙腈稀釋定容,搖勻,配成濃度為10.0 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)中間液。臨用前配制。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液

在室溫下,分別取標(biāo)準(zhǔn)中間液0、10、20、50、100、200、500、1 000 μL,各置10 mL容量瓶中用乙腈稀釋定容,搖勻。該標(biāo)準(zhǔn)系列濃度分別為0、0.01、0.02、0.05、0.10、0.20、0.50、1.00 μg/mL。臨用前配制。

1.3 樣品前處理

稱取5 g均質(zhì)后的水產(chǎn)品樣品于50 mL離心管中,加入10 mL乙腈,超聲提取2 min,勻漿提取30 s,以4 000 r/min離心5 min。另取一支50 mL離心管加10 mL乙腈,洗滌勻漿刀頭10 s,洗滌液移入前一離心管中,渦旋混合30 s,超聲提取 2 min,以4 000 r/min離心5 min;合并上清液,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干,用乙腈定容至10 mL,過0.22 μm濾膜,待上機分析。

1.4 色譜分析條件

色譜柱:Hypersil GOLD C18液相色譜柱(2.1 mm×100 mm,1.9 μm),流動相:A相為乙腈,B相為水,梯度洗脫程序見表1;流速:200 μL/min;柱溫:30 ℃;樣品盤溫度 15 ℃;進(jìn)樣量:20 μL;檢測波長:475 nm。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖

在“1.4”節(jié)規(guī)定的色譜條件下,斑蝥黃標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖如圖1所示,濃度為2.00 μg/mL。

2.7 方法檢出限

以空白水產(chǎn)品為基質(zhì)加標(biāo),按照3倍信噪比(S/N≥3)估算最低檢出限,本方法檢測限為10 μg/kg。

3 結(jié)語

本研究采用乙腈萃取,流動相為乙腈和水,萃取率高,出峰快,峰形良好;該方法簡便,準(zhǔn)確度和精密度好,靈敏度高,檢出限低,滿足水產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測分析的要求。

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