土壤中抗生素殘留對土壤微生物活性與功能的影響

袁德梽

摘要：通過研究抗生素殘留對土壤呼吸以及氨化的作用，以探討抗生素對土壤微生物活性與功能的影響。結(jié)果表明，3種抗生素殘留對土壤呼吸有不同程度的抑制作用，最大抑制率為15%，并且隨著時間延長和濃度升高，呼吸抑制效果更加明顯。抗生素殘留對土壤氨化起抑制作用，土壤銨態(tài)氮含量呈先增加后降低再增加的趨勢，處理3 d后土壤銨態(tài)氮含量最高，抑制率在90%～99%。由此可見，土壤抗生素殘留對土壤微生物活性功能有很大影響，對土壤抗生素的生態(tài)毒理性研究很有必要。

關(guān)鍵詞：抗生素；土壤；微生物活性；呼吸；氨化

中圖分類號：S154.3 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2014）08-0319-03

抗生素是世界上用量最大、使用最廣泛的藥物之一。全球抗生素年均使用總量為10萬～20萬t，我國每年有成千上萬噸的抗生素類藥物被用于畜禽養(yǎng)殖。含有殘留獸藥的糞便作為有機肥施入農(nóng)田，造成土壤污染，對人類健康和生態(tài)系統(tǒng)產(chǎn)生潛在危害。養(yǎng)殖業(yè)使用的主要獸藥種類為抗生素類藥物，且用量逐年增加，目前土壤中獸藥殘留濃度范圍為 μg/kg 級到g/kg級。本試驗在總結(jié)國內(nèi)外相關(guān)研究的基礎(chǔ)上，重點研究抗生素殘留對土壤微生物群落功能和結(jié)構(gòu)的影響^[1]。

1 材料與方法

1.1 抗生素標準樣品

本試驗主要針對4種抗生素進行研究，分別是四環(huán)素類四環(huán)素（tetracycline，純度為98%）、金霉素（CTC，純度為95%），喹諾酮類諾氟沙星（BR，純度為99%），以上均產(chǎn)自上海卒瑞生物科技有限公司；喹諾酮類環(huán)丙沙星（Ciprofloxacin hydrochloride，98%），產(chǎn)自阿拉丁試劑有限公司。

1.2 抗生素標準溶液配制

2 000 μg/mL標準溶液：取100 mg抗生素加入蒸餾水中，并定容至50 mL。取1.25 mL標準溶液定容至25 mL，配制濃度為1 μg/g；量取6.25 mL標準溶液定容至25 mL，配制濃度為5 μg/g；取12.5 mL標準溶液定容至25mL，配制濃度為10 μg/g。

1.3 氨化培養(yǎng)基的配制

（1）液體培養(yǎng)基：取磷酸氫二鉀0.5 g，氯化鈉1 g，七水合硫酸鎂0.25 g，硫酸亞鐵0.2 g，葡萄糖2.5 g，硫酸銨1.0 g，加入水中，并定容至500 mL，調(diào)節(jié)pH值至7.2～7.4，在滅菌鍋中120 ℃滅菌30 min。

（2）0.2%蛋白胨：將1 g蛋白胨粉末加入水中，并定容至500 mL，在滅菌鍋中120 ℃滅菌30 min。

1.4 抗生素污染土壤配制與模擬

1.4.1 供試土壤及前處理

試驗土壤采集于重慶三峽職業(yè)學(xué)院校園內(nèi)，將采集后的土壤過20目篩，去除雜質(zhì)，并風(fēng)干 1 d，常溫保存。

1.4.2 土壤含水率的選擇與確定

經(jīng)測定原土壤含水率約為10%，取土樣80 g即含8 g水、72 g干土。在80 g土壤中分別加入10、15、21、29 mL水，使其含水率分別為15%、20%、30%、40%。

1.5 土壤呼吸作用的測定

測定土壤微生物呼吸最常用的方法是直接吸收法，具體的試驗步驟為：稱50 g的供試土壤放在100 mL的廣口瓶中，共20份，然后向土壤中添加4種抗生素，分別是四環(huán)素、金霉素、諾氟沙星和環(huán)丙沙星，并且保證4種抗生素的濃度均為0、1、5、25、50 mg/kg等5個處理，其中0 mg/kg處理作為對照，同時5個處理均設(shè)1個重復(fù)。同時將盛放有5 mL的0.1 mol/L氫氧化鈉溶液的小玻璃瓶放在一個密閉容器的底部，然后將廣口玻璃瓶進行密封。將密封好的廣口玻璃瓶放入恒溫為 25 ℃ 的人工培養(yǎng)箱中1、3、5、7、9、11 d，在盛有氫氧化鈉的高型燒杯中加入1 mL的1 mol/L氯化鋇溶液，另外加入2～3滴酚酞試劑，以起到指示劑的作用，運用0.05 mol/L鹽酸滴定來觀察酚酞的變化，并記錄鹽酸的消耗量，同時換盛有新鮮氫氧化鈉溶液的小玻璃瓶^[2]。

1.6 土壤氨化作用的測定

測定土壤氨化作用的具體步驟為：先取5支500 mL的三角瓶，稱取100 g的供試土壤分別放入每支三角瓶中，然后加入5 mL用于滅菌的濃度為0.2%蛋白胨以及2 mL的氨化菌液體培養(yǎng)基，并分別加入四環(huán)素、金霉素、諾氟沙星，使其終濃度分別為0（CK）、1、5、10、20 μg/g土，最終土 ∶水=3 ∶1。把上述5支三角瓶均塞上棉塞后放入恒溫為28 ℃的培養(yǎng)箱。然后進行康維皿擴散試驗：首先從三角瓶中稱取土壤20 g，向土壤中加入80 mL的1 mol/L氯化鉀溶液，將加入溶液的土壤振蕩浸提1 h后進行過濾，過濾后吸取濾液4 mL放在康維皿外室，在中心小室加入0.1 mol/L硫酸 2 mL。蓋上皿蓋，留1個小孔，然后快速用滴管從小孔中加入40%氫氧化鈉溶液1 mL。蓋緊瓶蓋后，將康維皿進行搖動，然后放入溫度為 40 ℃ 的恒溫箱4 h，將10 mL的蒸餾水滴入中心小室，然后分4次將溶液轉(zhuǎn)移到50 mL的容量瓶中。鈉氏試劑顯色的方法與銨態(tài)氮標準曲線的繪制有異曲同工之妙，對照標準曲線每3 d測定1次，一共需要測定6次^[3]。

1.7 銨態(tài)氮標準曲線的繪制方法

取6支25 mL的容量瓶，分別放入0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL的銨態(tài)氮標準溶液，然后以蒸餾水進行稀釋，稀釋到10 mL，在溶液中再分別加入0.8 mL的鈉氏試劑并將溶液搖勻。向每個容量瓶中緩慢加入4 mL的1 mol/L氫氧化鈉溶液，待鈉氏試劑顯色后稀釋至刻度。10 min過后，在分光光度計上波長460 nm的地方測定其吸光度。在繪制曲線時以銨態(tài)氮濃度為縱坐標，以吸光度為橫坐標。endprint

2 結(jié)果與分析

2.1 抗生素殘留對土壤呼吸作用的影響

由圖1可知，4種不同濃度的四環(huán)素殘留對土壤呼吸均表現(xiàn)為抑制作用，并且抗生素殘留濃度越大，抑制水平相對越高。同時，四環(huán)素殘留在土壤中總體表現(xiàn)前9 d抑制能力較弱，9 d后抑制能力較強，11 d后對土壤呼吸作用的抑制作用最強，抑制率在5%～15%。

3 結(jié)論

4種不同濃度的抗生素殘留對土壤呼吸作用基本表現(xiàn)出抑制作用，并且抗生素殘留濃度越大，抑制水平相對越高。同時，抗生素殘留在土壤中總體表現(xiàn)前 7 d抑制能力較弱， 7 d后土壤呼吸抑制能力較強。并且土壤中抗生素添加濃度越大，其對土壤呼吸抑制作用就越強，抑制效果越明顯。其中，四環(huán)素對土壤呼吸主要起到抑制的作用；金霉素在處理后的處理1、7 d表現(xiàn)為激活作用，但是其他時間對土壤呼吸作用均起抑制作用；諾氟沙星在濃度較低時對土壤呼吸作用起到抑制作用，但在濃度較高時對土壤呼吸作用起到激活作用，在進行處理15 d后，所有經(jīng)過處理的微生物呼吸作用都基本上恢復(fù)到了對照水平，表明微生物對其能夠產(chǎn)生適應(yīng)性^[4]。

抗生素殘留對土壤氨化在1～3 d內(nèi)促進作用明顯，3 d以后銨態(tài)氮含量逐漸減少。四環(huán)素和金霉素殘留對土壤氨化有刺激作用，而諾氟沙星殘留則會對其起抑制作用。6 d后四環(huán)素和諾氟沙星殘留對土壤氨化有一定的刺激作用，金霉素殘留會抑制土壤的氨化作用。四環(huán)素殘留對土壤氨化作用有刺激作用，而諾氟沙星和金霉素殘留則會對其起抑制作用。土壤氨化作用強度與土壤的供氮能力在一定程度上有很大關(guān)系。因此，如果土壤中抗生素殘留一直保持較高濃度，會大大影響土壤的供氮能力^[5]。

參考文獻：

[1]王金花，朱魯生，王 軍，等. 4種典型抗生素對土壤微生物呼吸的影響[J]. 農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報，2011，30（11）：2232-2236.

[2]Beyer L. Intersite characterization and variability of soil respiration in different arable and forest soils[J]. Biology and Fertility of Soils，1991，12：122-126.

[3]Buyanovsky G A，Wagner G H，Gantzer C J. Soil respiration in a winter wheat ecosystem[J]. Soil Science Society of America Journal，1986，50：338-344.

[4]Zelles L，Bahig M E. Measurement of bioactivity based on CO2-released and ATP content in soil after different treatments[J]. Chemosphere，1984，13（8）：899-913.

[5]Zhu L S，Zhang Y F，F(xiàn)an D F，et al. Study on the effects of phoxim，fenpropathrin and its mixture on respiration of soil microbe[J]. A Groenvironmental Protection，1999，18（1）：25-27.endprint

2 結(jié)果與分析

2.1 抗生素殘留對土壤呼吸作用的影響

由圖1可知，4種不同濃度的四環(huán)素殘留對土壤呼吸均表現(xiàn)為抑制作用，并且抗生素殘留濃度越大，抑制水平相對越高。同時，四環(huán)素殘留在土壤中總體表現(xiàn)前9 d抑制能力較弱，9 d后抑制能力較強，11 d后對土壤呼吸作用的抑制作用最強，抑制率在5%～15%。

3 結(jié)論

4種不同濃度的抗生素殘留對土壤呼吸作用基本表現(xiàn)出抑制作用，并且抗生素殘留濃度越大，抑制水平相對越高。同時，抗生素殘留在土壤中總體表現(xiàn)前 7 d抑制能力較弱， 7 d后土壤呼吸抑制能力較強。并且土壤中抗生素添加濃度越大，其對土壤呼吸抑制作用就越強，抑制效果越明顯。其中，四環(huán)素對土壤呼吸主要起到抑制的作用；金霉素在處理后的處理1、7 d表現(xiàn)為激活作用，但是其他時間對土壤呼吸作用均起抑制作用；諾氟沙星在濃度較低時對土壤呼吸作用起到抑制作用，但在濃度較高時對土壤呼吸作用起到激活作用，在進行處理15 d后，所有經(jīng)過處理的微生物呼吸作用都基本上恢復(fù)到了對照水平，表明微生物對其能夠產(chǎn)生適應(yīng)性^[4]。

抗生素殘留對土壤氨化在1～3 d內(nèi)促進作用明顯，3 d以后銨態(tài)氮含量逐漸減少。四環(huán)素和金霉素殘留對土壤氨化有刺激作用，而諾氟沙星殘留則會對其起抑制作用。6 d后四環(huán)素和諾氟沙星殘留對土壤氨化有一定的刺激作用，金霉素殘留會抑制土壤的氨化作用。四環(huán)素殘留對土壤氨化作用有刺激作用，而諾氟沙星和金霉素殘留則會對其起抑制作用。土壤氨化作用強度與土壤的供氮能力在一定程度上有很大關(guān)系。因此，如果土壤中抗生素殘留一直保持較高濃度，會大大影響土壤的供氮能力^[5]。

參考文獻：

[1]王金花，朱魯生，王 軍，等. 4種典型抗生素對土壤微生物呼吸的影響[J]. 農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報，2011，30（11）：2232-2236.

[2]Beyer L. Intersite characterization and variability of soil respiration in different arable and forest soils[J]. Biology and Fertility of Soils，1991，12：122-126.

[3]Buyanovsky G A，Wagner G H，Gantzer C J. Soil respiration in a winter wheat ecosystem[J]. Soil Science Society of America Journal，1986，50：338-344.

[4]Zelles L，Bahig M E. Measurement of bioactivity based on CO2-released and ATP content in soil after different treatments[J]. Chemosphere，1984，13（8）：899-913.

[5]Zhu L S，Zhang Y F，F(xiàn)an D F，et al. Study on the effects of phoxim，fenpropathrin and its mixture on respiration of soil microbe[J]. A Groenvironmental Protection，1999，18（1）：25-27.endprint

2 結(jié)果與分析

2.1 抗生素殘留對土壤呼吸作用的影響

由圖1可知，4種不同濃度的四環(huán)素殘留對土壤呼吸均表現(xiàn)為抑制作用，并且抗生素殘留濃度越大，抑制水平相對越高。同時，四環(huán)素殘留在土壤中總體表現(xiàn)前9 d抑制能力較弱，9 d后抑制能力較強，11 d后對土壤呼吸作用的抑制作用最強，抑制率在5%～15%。

3 結(jié)論

4種不同濃度的抗生素殘留對土壤呼吸作用基本表現(xiàn)出抑制作用，并且抗生素殘留濃度越大，抑制水平相對越高。同時，抗生素殘留在土壤中總體表現(xiàn)前 7 d抑制能力較弱， 7 d后土壤呼吸抑制能力較強。并且土壤中抗生素添加濃度越大，其對土壤呼吸抑制作用就越強，抑制效果越明顯。其中，四環(huán)素對土壤呼吸主要起到抑制的作用；金霉素在處理后的處理1、7 d表現(xiàn)為激活作用，但是其他時間對土壤呼吸作用均起抑制作用；諾氟沙星在濃度較低時對土壤呼吸作用起到抑制作用，但在濃度較高時對土壤呼吸作用起到激活作用，在進行處理15 d后，所有經(jīng)過處理的微生物呼吸作用都基本上恢復(fù)到了對照水平，表明微生物對其能夠產(chǎn)生適應(yīng)性^[4]。

抗生素殘留對土壤氨化在1～3 d內(nèi)促進作用明顯，3 d以后銨態(tài)氮含量逐漸減少。四環(huán)素和金霉素殘留對土壤氨化有刺激作用，而諾氟沙星殘留則會對其起抑制作用。6 d后四環(huán)素和諾氟沙星殘留對土壤氨化有一定的刺激作用，金霉素殘留會抑制土壤的氨化作用。四環(huán)素殘留對土壤氨化作用有刺激作用，而諾氟沙星和金霉素殘留則會對其起抑制作用。土壤氨化作用強度與土壤的供氮能力在一定程度上有很大關(guān)系。因此，如果土壤中抗生素殘留一直保持較高濃度，會大大影響土壤的供氮能力^[5]。

參考文獻：

[1]王金花，朱魯生，王 軍，等. 4種典型抗生素對土壤微生物呼吸的影響[J]. 農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報，2011，30（11）：2232-2236.

[2]Beyer L. Intersite characterization and variability of soil respiration in different arable and forest soils[J]. Biology and Fertility of Soils，1991，12：122-126.

[3]Buyanovsky G A，Wagner G H，Gantzer C J. Soil respiration in a winter wheat ecosystem[J]. Soil Science Society of America Journal，1986，50：338-344.

[4]Zelles L，Bahig M E. Measurement of bioactivity based on CO2-released and ATP content in soil after different treatments[J]. Chemosphere，1984，13（8）：899-913.

[5]Zhu L S，Zhang Y F，F(xiàn)an D F，et al. Study on the effects of phoxim，fenpropathrin and its mixture on respiration of soil microbe[J]. A Groenvironmental Protection，1999，18（1）：25-27.endprint