大豆根際解磷菌的鑒定

李麗麗+郎敬+楊洪一+邰飛飛+來永才

摘要：利用PVK平板，從大豆根際土壤中分離出8株解磷菌。培養分析結果顯示，這8株解磷菌的溶磷圈均較大。其中，海倫Ⅲ號為革蘭氏陰性菌，其余均為革蘭氏陽性菌。形態學觀察結果顯示，北安Ⅰ號為鏈球菌，海倫Ⅱ號、海倫Ⅲ號為球菌，海倫Ⅳ號、北安Ⅲ號為桿菌。基于細菌核糖體16S rDNA序列對北安Ⅲ號菌株進行鑒定，結合形態特征確認該菌株為巨大芽孢桿菌，經研究發現該菌株是一種重要的微生物資源，可進一步開發為生物磷肥。

關鍵詞：解磷菌；溶磷圈；16S rDNA；大豆；生物磷肥

中圖分類號：S154.3 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2014）08-0363-03

土壤中存在一些特定的微生物，能夠將植物難以吸收利用的磷轉化為可吸收利用的形態，這些微生物被稱為解磷菌，以細菌為主^[1]。將解磷菌作為肥料施入土壤，通過其生長代謝可以在作物根際形成一個磷供應較充分的微區，從而改善作物磷元素的供應，增加作物磷素吸收量，提高作物產量，同時還可以增進土壤肥力、增強植物抗病和抗旱能力^[2]。因此，解磷菌的篩選及鑒定是當前微生物學研究的熱點。土壤中解磷微生物種類豐富、數量較多^[2]，目前報道的具有解磷作用的細菌有芽孢桿菌屬（Bacillus）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、土壤桿菌屬（Agrobacterium）、固氮菌屬（Azotobacte）、根瘤菌屬（Bradxrkizobium）、硫桿菌屬（Thiobacillus）、腸細菌屬（Enterbacter）、微球菌屬（Microeoccus）、沙門氏菌屬（Salmonella）、色桿菌屬（Clromobacterium）、產堿菌屬（Alcaligenes）、節細菌屬（Arthrobacte）、大腸桿菌屬（Escherichia）等^[3]。解磷微生物在我國應用較早，有較好的應用前景，但發展不快，應用還不普遍。篩選高效微生物肥料菌株手段單一、菌種種類少是影響微生物肥料發展的重要因素，因而有必要對土壤中的解磷菌進行大規模篩選，并進行系統鑒定，豐富菌種資源，但土壤中的細菌種類極為豐富，通過常規的形態學和生理生化方法難以進行有效的鑒定。筆者所在的實驗室在前期研究中獲得了8株解磷菌，本研究對這些分離到的解磷菌進行了形態觀察及分子鑒定，為豐富解磷微生物菌種資源打下基礎。

1 材料與方法

1.1 染色及顯微觀察

利用革蘭氏染色法^[4]對篩選到的高效解磷菌進行染色，將菌液涂布于載玻片上，干燥，固定，結晶紫初染1 min，水洗至無色；碘液媒染1 min，水洗至無色；95%乙醇脫色30 s，水洗至無色；最后沙黃復染1 min，水洗至無色，干燥，鏡檢。

1.2 細菌總DNA的提取

接種菌株置于LB液體培養基中，于130 r/min下振蕩，37 ℃過夜培養。取1.5 mL新鮮菌液于EP管中，于 4 000 r/min 下離心30 s，棄上清，收集菌體；加100 μg/mL 溶菌酶50 μL，于37 ℃下處理1 h輔助裂解；加入預熱的CTAB溶液500 μL，充分混合，于65 ℃水浴30 min，混勻；冷卻后，加入等體積的三氯甲烷/異戊醇（24 ∶1）抽提，顛倒充分混合，10 000 r/min離心10 min；取上清液，加入等體積三氯甲烷/異戊醇（24 ∶1），輕輕顛倒混勻，10 000 r/min離心5 min；取上清，加入2倍體積的無水乙醇，沉淀30 min，8 000 r/min離心10 min；棄上清，用70%乙醇洗滌沉淀2次；在超凈工作臺上風干DNA，溶于20 μL去離子水中。

1.3 PCR擴增

利用細菌核糖體16S rDNA通用引物27F/1492R^[5]進行PCR反應，其反應體系20 μL，包括10×PCR Buffer 2.0 μL、dNTP mix 1.6 μL、25 μmol/mL引物27F/1492R各0.4 μL、Taq DNA 聚合酶 1 U、模板DNA 1 μL，去離子水補足至 20 μL。PCR 反應條件為：94 ℃ 4 min；94 ℃ 30 s，52 ℃30 s，72 ℃ 1.5 min，30 次循環；72 ℃ 7 min；4 ℃保溫。

1.4 回收及測序

利用瓊脂糖凝膠回收試劑盒對PCR產物進行回收純化，將純化產物送至大連寶生物公司進行測序。利用BLAST工具在GenBank中對獲得的序列進行分析^[6]。經過NCBI比對后下載相關菌株的細菌核糖體16S rDNA序列，所得序列用Clustal X 1.81程序進行多序列比對，并經手工校正；然后用軟件MEGA 3.1構建系統發育樹。

2 結果與分析

利用PVK平板，從大豆根際土壤中篩選出8株解磷菌，并將這8株解磷菌接種在固體LB培養基上，37 ℃恒溫培養條件下菌株的溶磷圈均較大，菌落邊緣呈規則的圓形，表面光滑，中心突起，分別編號為北安Ⅰ、北安Ⅱ、北安Ⅲ、北安Ⅳ、海倫Ⅰ、海倫Ⅱ、海倫Ⅲ、海倫Ⅳ（部分菌株菌落形態見圖1至圖4）。由于培養基中加入了溴酚藍，菌落吸附了染料呈藍色，但一些菌株具有降解溴酚藍的能力，如菌株海倫Ⅱ號（圖4），藍色較淡。

革蘭氏染色結果顯示，海倫Ⅲ號為革蘭氏陰性菌，其余均為革蘭氏陽性菌。在光學顯微鏡下可有效觀察到菌株的形態（部分菌株形態見圖5至圖10），其中北安Ⅰ號為鏈球菌，海倫Ⅱ號、海倫Ⅲ號為球菌，海倫Ⅳ號、北安Ⅲ號為桿菌。

3 結論

利用PVK平板對解磷菌進行分離是一種簡單有效的手段^[7]，一些菌株（如芽孢桿菌屬）在其生長過程中可產酸，將培養基中的磷酸鈣溶解產生溶磷圈，通過分析溶磷圈的大小可對微生物的溶磷能力進行初步估測。本研究中的菌株皆產生了較大的溶磷圈，說明它們可能具有較強的溶磷潛力。本研究獲得的解磷菌既有球菌，又有桿菌，但已有研究中分離及初步應用的解磷菌主要是桿菌，因而本研究重點選擇了一種桿菌——北安Ⅲ號進行細菌核糖體16S rDNA序列鑒定。結合形態學特點及細菌核糖體16S rDNA序列，確定該菌為巨大芽孢桿菌。該菌是土壤中的重要菌群，對農作物無害，且可能具有一些有益生物學作用，因而該菌株是一種重要的微生物資源，可進一步開發為生物磷肥。

參考文獻：

[1]李曉婷. 解磷細菌K3的GFP標記與在土壤中定殖及對玉米生長效應研究[D]. 南京：南京農業大學，2009：1-5.

[2]Gyaneshwar P，Naresh K G，Parekh L J，et al. Role of soil microorganisms in improving P nutrition of plants[J]. Plant and Soil，2002，245：83-93.

[3]Rodríguez H，Fraga R. Phosphate solubilizing bacteria and their role in plant growth promotion[J]. Biotechnology Advances，1999，17：319-339.

[4]萬翠番，章昭琳，王報貴，等. 高黏附力雙歧桿菌的篩選與鑒定[J]. 中國乳品工業，2012（5）：13-15.

[5]Moreno C，Romero J，Romilio T E. Polymorphism in repeated 16S rRNA genes is a common property of type strains and environmental isolates of the genus Vibrio[J]. Microbiology，2002，148：1233-1239.

[6]Altschul S F，Madden TL，Chffer A A，et al. Gapped BLAST and PSI-BLAST：a new generation of protein database search programs[J]. Nucleic Acids Res，1997，25（17）：3389-3402.

[7]Kucey R M N，Janzen H H，Legett M E. Microbially mediated increases in plant available phosphorus[J]. Advances in Agronomy，1989，42：199-228.endprint

摘要：利用PVK平板，從大豆根際土壤中分離出8株解磷菌。培養分析結果顯示，這8株解磷菌的溶磷圈均較大。其中，海倫Ⅲ號為革蘭氏陰性菌，其余均為革蘭氏陽性菌。形態學觀察結果顯示，北安Ⅰ號為鏈球菌，海倫Ⅱ號、海倫Ⅲ號為球菌，海倫Ⅳ號、北安Ⅲ號為桿菌。基于細菌核糖體16S rDNA序列對北安Ⅲ號菌株進行鑒定，結合形態特征確認該菌株為巨大芽孢桿菌，經研究發現該菌株是一種重要的微生物資源，可進一步開發為生物磷肥。

關鍵詞：解磷菌；溶磷圈；16S rDNA；大豆；生物磷肥

中圖分類號：S154.3 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2014）08-0363-03

土壤中存在一些特定的微生物，能夠將植物難以吸收利用的磷轉化為可吸收利用的形態，這些微生物被稱為解磷菌，以細菌為主^[1]。將解磷菌作為肥料施入土壤，通過其生長代謝可以在作物根際形成一個磷供應較充分的微區，從而改善作物磷元素的供應，增加作物磷素吸收量，提高作物產量，同時還可以增進土壤肥力、增強植物抗病和抗旱能力^[2]。因此，解磷菌的篩選及鑒定是當前微生物學研究的熱點。土壤中解磷微生物種類豐富、數量較多^[2]，目前報道的具有解磷作用的細菌有芽孢桿菌屬（Bacillus）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、土壤桿菌屬（Agrobacterium）、固氮菌屬（Azotobacte）、根瘤菌屬（Bradxrkizobium）、硫桿菌屬（Thiobacillus）、腸細菌屬（Enterbacter）、微球菌屬（Microeoccus）、沙門氏菌屬（Salmonella）、色桿菌屬（Clromobacterium）、產堿菌屬（Alcaligenes）、節細菌屬（Arthrobacte）、大腸桿菌屬（Escherichia）等^[3]。解磷微生物在我國應用較早，有較好的應用前景，但發展不快，應用還不普遍。篩選高效微生物肥料菌株手段單一、菌種種類少是影響微生物肥料發展的重要因素，因而有必要對土壤中的解磷菌進行大規模篩選，并進行系統鑒定，豐富菌種資源，但土壤中的細菌種類極為豐富，通過常規的形態學和生理生化方法難以進行有效的鑒定。筆者所在的實驗室在前期研究中獲得了8株解磷菌，本研究對這些分離到的解磷菌進行了形態觀察及分子鑒定，為豐富解磷微生物菌種資源打下基礎。

1 材料與方法

1.1 染色及顯微觀察

利用革蘭氏染色法^[4]對篩選到的高效解磷菌進行染色，將菌液涂布于載玻片上，干燥，固定，結晶紫初染1 min，水洗至無色；碘液媒染1 min，水洗至無色；95%乙醇脫色30 s，水洗至無色；最后沙黃復染1 min，水洗至無色，干燥，鏡檢。

1.2 細菌總DNA的提取

接種菌株置于LB液體培養基中，于130 r/min下振蕩，37 ℃過夜培養。取1.5 mL新鮮菌液于EP管中，于 4 000 r/min 下離心30 s，棄上清，收集菌體；加100 μg/mL 溶菌酶50 μL，于37 ℃下處理1 h輔助裂解；加入預熱的CTAB溶液500 μL，充分混合，于65 ℃水浴30 min，混勻；冷卻后，加入等體積的三氯甲烷/異戊醇（24 ∶1）抽提，顛倒充分混合，10 000 r/min離心10 min；取上清液，加入等體積三氯甲烷/異戊醇（24 ∶1），輕輕顛倒混勻，10 000 r/min離心5 min；取上清，加入2倍體積的無水乙醇，沉淀30 min，8 000 r/min離心10 min；棄上清，用70%乙醇洗滌沉淀2次；在超凈工作臺上風干DNA，溶于20 μL去離子水中。

1.3 PCR擴增

利用細菌核糖體16S rDNA通用引物27F/1492R^[5]進行PCR反應，其反應體系20 μL，包括10×PCR Buffer 2.0 μL、dNTP mix 1.6 μL、25 μmol/mL引物27F/1492R各0.4 μL、Taq DNA 聚合酶 1 U、模板DNA 1 μL，去離子水補足至 20 μL。PCR 反應條件為：94 ℃ 4 min；94 ℃ 30 s，52 ℃30 s，72 ℃ 1.5 min，30 次循環；72 ℃ 7 min；4 ℃保溫。

1.4 回收及測序

利用瓊脂糖凝膠回收試劑盒對PCR產物進行回收純化，將純化產物送至大連寶生物公司進行測序。利用BLAST工具在GenBank中對獲得的序列進行分析^[6]。經過NCBI比對后下載相關菌株的細菌核糖體16S rDNA序列，所得序列用Clustal X 1.81程序進行多序列比對，并經手工校正；然后用軟件MEGA 3.1構建系統發育樹。

2 結果與分析

利用PVK平板，從大豆根際土壤中篩選出8株解磷菌，并將這8株解磷菌接種在固體LB培養基上，37 ℃恒溫培養條件下菌株的溶磷圈均較大，菌落邊緣呈規則的圓形，表面光滑，中心突起，分別編號為北安Ⅰ、北安Ⅱ、北安Ⅲ、北安Ⅳ、海倫Ⅰ、海倫Ⅱ、海倫Ⅲ、海倫Ⅳ（部分菌株菌落形態見圖1至圖4）。由于培養基中加入了溴酚藍，菌落吸附了染料呈藍色，但一些菌株具有降解溴酚藍的能力，如菌株海倫Ⅱ號（圖4），藍色較淡。

革蘭氏染色結果顯示，海倫Ⅲ號為革蘭氏陰性菌，其余均為革蘭氏陽性菌。在光學顯微鏡下可有效觀察到菌株的形態（部分菌株形態見圖5至圖10），其中北安Ⅰ號為鏈球菌，海倫Ⅱ號、海倫Ⅲ號為球菌，海倫Ⅳ號、北安Ⅲ號為桿菌。

3 結論

利用PVK平板對解磷菌進行分離是一種簡單有效的手段^[7]，一些菌株（如芽孢桿菌屬）在其生長過程中可產酸，將培養基中的磷酸鈣溶解產生溶磷圈，通過分析溶磷圈的大小可對微生物的溶磷能力進行初步估測。本研究中的菌株皆產生了較大的溶磷圈，說明它們可能具有較強的溶磷潛力。本研究獲得的解磷菌既有球菌，又有桿菌，但已有研究中分離及初步應用的解磷菌主要是桿菌，因而本研究重點選擇了一種桿菌——北安Ⅲ號進行細菌核糖體16S rDNA序列鑒定。結合形態學特點及細菌核糖體16S rDNA序列，確定該菌為巨大芽孢桿菌。該菌是土壤中的重要菌群，對農作物無害，且可能具有一些有益生物學作用，因而該菌株是一種重要的微生物資源，可進一步開發為生物磷肥。

參考文獻：

[1]李曉婷. 解磷細菌K3的GFP標記與在土壤中定殖及對玉米生長效應研究[D]. 南京：南京農業大學，2009：1-5.

[2]Gyaneshwar P，Naresh K G，Parekh L J，et al. Role of soil microorganisms in improving P nutrition of plants[J]. Plant and Soil，2002，245：83-93.

[3]Rodríguez H，Fraga R. Phosphate solubilizing bacteria and their role in plant growth promotion[J]. Biotechnology Advances，1999，17：319-339.

[4]萬翠番，章昭琳，王報貴，等. 高黏附力雙歧桿菌的篩選與鑒定[J]. 中國乳品工業，2012（5）：13-15.

[5]Moreno C，Romero J，Romilio T E. Polymorphism in repeated 16S rRNA genes is a common property of type strains and environmental isolates of the genus Vibrio[J]. Microbiology，2002，148：1233-1239.

[6]Altschul S F，Madden TL，Chffer A A，et al. Gapped BLAST and PSI-BLAST：a new generation of protein database search programs[J]. Nucleic Acids Res，1997，25（17）：3389-3402.

[7]Kucey R M N，Janzen H H，Legett M E. Microbially mediated increases in plant available phosphorus[J]. Advances in Agronomy，1989，42：199-228.endprint

摘要：利用PVK平板，從大豆根際土壤中分離出8株解磷菌。培養分析結果顯示，這8株解磷菌的溶磷圈均較大。其中，海倫Ⅲ號為革蘭氏陰性菌，其余均為革蘭氏陽性菌。形態學觀察結果顯示，北安Ⅰ號為鏈球菌，海倫Ⅱ號、海倫Ⅲ號為球菌，海倫Ⅳ號、北安Ⅲ號為桿菌。基于細菌核糖體16S rDNA序列對北安Ⅲ號菌株進行鑒定，結合形態特征確認該菌株為巨大芽孢桿菌，經研究發現該菌株是一種重要的微生物資源，可進一步開發為生物磷肥。

關鍵詞：解磷菌；溶磷圈；16S rDNA；大豆；生物磷肥

中圖分類號：S154.3 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2014）08-0363-03

土壤中存在一些特定的微生物，能夠將植物難以吸收利用的磷轉化為可吸收利用的形態，這些微生物被稱為解磷菌，以細菌為主^[1]。將解磷菌作為肥料施入土壤，通過其生長代謝可以在作物根際形成一個磷供應較充分的微區，從而改善作物磷元素的供應，增加作物磷素吸收量，提高作物產量，同時還可以增進土壤肥力、增強植物抗病和抗旱能力^[2]。因此，解磷菌的篩選及鑒定是當前微生物學研究的熱點。土壤中解磷微生物種類豐富、數量較多^[2]，目前報道的具有解磷作用的細菌有芽孢桿菌屬（Bacillus）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、土壤桿菌屬（Agrobacterium）、固氮菌屬（Azotobacte）、根瘤菌屬（Bradxrkizobium）、硫桿菌屬（Thiobacillus）、腸細菌屬（Enterbacter）、微球菌屬（Microeoccus）、沙門氏菌屬（Salmonella）、色桿菌屬（Clromobacterium）、產堿菌屬（Alcaligenes）、節細菌屬（Arthrobacte）、大腸桿菌屬（Escherichia）等^[3]。解磷微生物在我國應用較早，有較好的應用前景，但發展不快，應用還不普遍。篩選高效微生物肥料菌株手段單一、菌種種類少是影響微生物肥料發展的重要因素，因而有必要對土壤中的解磷菌進行大規模篩選，并進行系統鑒定，豐富菌種資源，但土壤中的細菌種類極為豐富，通過常規的形態學和生理生化方法難以進行有效的鑒定。筆者所在的實驗室在前期研究中獲得了8株解磷菌，本研究對這些分離到的解磷菌進行了形態觀察及分子鑒定，為豐富解磷微生物菌種資源打下基礎。

1 材料與方法

1.1 染色及顯微觀察

利用革蘭氏染色法^[4]對篩選到的高效解磷菌進行染色，將菌液涂布于載玻片上，干燥，固定，結晶紫初染1 min，水洗至無色；碘液媒染1 min，水洗至無色；95%乙醇脫色30 s，水洗至無色；最后沙黃復染1 min，水洗至無色，干燥，鏡檢。

1.2 細菌總DNA的提取

接種菌株置于LB液體培養基中，于130 r/min下振蕩，37 ℃過夜培養。取1.5 mL新鮮菌液于EP管中，于 4 000 r/min 下離心30 s，棄上清，收集菌體；加100 μg/mL 溶菌酶50 μL，于37 ℃下處理1 h輔助裂解；加入預熱的CTAB溶液500 μL，充分混合，于65 ℃水浴30 min，混勻；冷卻后，加入等體積的三氯甲烷/異戊醇（24 ∶1）抽提，顛倒充分混合，10 000 r/min離心10 min；取上清液，加入等體積三氯甲烷/異戊醇（24 ∶1），輕輕顛倒混勻，10 000 r/min離心5 min；取上清，加入2倍體積的無水乙醇，沉淀30 min，8 000 r/min離心10 min；棄上清，用70%乙醇洗滌沉淀2次；在超凈工作臺上風干DNA，溶于20 μL去離子水中。

1.3 PCR擴增

利用細菌核糖體16S rDNA通用引物27F/1492R^[5]進行PCR反應，其反應體系20 μL，包括10×PCR Buffer 2.0 μL、dNTP mix 1.6 μL、25 μmol/mL引物27F/1492R各0.4 μL、Taq DNA 聚合酶 1 U、模板DNA 1 μL，去離子水補足至 20 μL。PCR 反應條件為：94 ℃ 4 min；94 ℃ 30 s，52 ℃30 s，72 ℃ 1.5 min，30 次循環；72 ℃ 7 min；4 ℃保溫。

1.4 回收及測序

利用瓊脂糖凝膠回收試劑盒對PCR產物進行回收純化，將純化產物送至大連寶生物公司進行測序。利用BLAST工具在GenBank中對獲得的序列進行分析^[6]。經過NCBI比對后下載相關菌株的細菌核糖體16S rDNA序列，所得序列用Clustal X 1.81程序進行多序列比對，并經手工校正；然后用軟件MEGA 3.1構建系統發育樹。

2 結果與分析

利用PVK平板，從大豆根際土壤中篩選出8株解磷菌，并將這8株解磷菌接種在固體LB培養基上，37 ℃恒溫培養條件下菌株的溶磷圈均較大，菌落邊緣呈規則的圓形，表面光滑，中心突起，分別編號為北安Ⅰ、北安Ⅱ、北安Ⅲ、北安Ⅳ、海倫Ⅰ、海倫Ⅱ、海倫Ⅲ、海倫Ⅳ（部分菌株菌落形態見圖1至圖4）。由于培養基中加入了溴酚藍，菌落吸附了染料呈藍色，但一些菌株具有降解溴酚藍的能力，如菌株海倫Ⅱ號（圖4），藍色較淡。

革蘭氏染色結果顯示，海倫Ⅲ號為革蘭氏陰性菌，其余均為革蘭氏陽性菌。在光學顯微鏡下可有效觀察到菌株的形態（部分菌株形態見圖5至圖10），其中北安Ⅰ號為鏈球菌，海倫Ⅱ號、海倫Ⅲ號為球菌，海倫Ⅳ號、北安Ⅲ號為桿菌。

3 結論

利用PVK平板對解磷菌進行分離是一種簡單有效的手段^[7]，一些菌株（如芽孢桿菌屬）在其生長過程中可產酸，將培養基中的磷酸鈣溶解產生溶磷圈，通過分析溶磷圈的大小可對微生物的溶磷能力進行初步估測。本研究中的菌株皆產生了較大的溶磷圈，說明它們可能具有較強的溶磷潛力。本研究獲得的解磷菌既有球菌，又有桿菌，但已有研究中分離及初步應用的解磷菌主要是桿菌，因而本研究重點選擇了一種桿菌——北安Ⅲ號進行細菌核糖體16S rDNA序列鑒定。結合形態學特點及細菌核糖體16S rDNA序列，確定該菌為巨大芽孢桿菌。該菌是土壤中的重要菌群，對農作物無害，且可能具有一些有益生物學作用，因而該菌株是一種重要的微生物資源，可進一步開發為生物磷肥。

參考文獻：

[1]李曉婷. 解磷細菌K3的GFP標記與在土壤中定殖及對玉米生長效應研究[D]. 南京：南京農業大學，2009：1-5.

[2]Gyaneshwar P，Naresh K G，Parekh L J，et al. Role of soil microorganisms in improving P nutrition of plants[J]. Plant and Soil，2002，245：83-93.

[3]Rodríguez H，Fraga R. Phosphate solubilizing bacteria and their role in plant growth promotion[J]. Biotechnology Advances，1999，17：319-339.

[4]萬翠番，章昭琳，王報貴，等. 高黏附力雙歧桿菌的篩選與鑒定[J]. 中國乳品工業，2012（5）：13-15.

[5]Moreno C，Romero J，Romilio T E. Polymorphism in repeated 16S rRNA genes is a common property of type strains and environmental isolates of the genus Vibrio[J]. Microbiology，2002，148：1233-1239.

[6]Altschul S F，Madden TL，Chffer A A，et al. Gapped BLAST and PSI-BLAST：a new generation of protein database search programs[J]. Nucleic Acids Res，1997，25（17）：3389-3402.

[7]Kucey R M N，Janzen H H，Legett M E. Microbially mediated increases in plant available phosphorus[J]. Advances in Agronomy，1989，42：199-228.endprint