植物內生菌分離時表面消毒條件的比較

王志勇+劉秀娟+易曲

摘要：為了探索植物內生菌分離時表面消毒條件的一般規律，分別用不同消毒劑對水花生的莖處理不同時間，并以最佳組合對植物材料進行消毒處理，放置于分離培養基平板中，在適溫下培養不同時間，觀察各個處理對植物內生菌數量的影響。結果表明，用5%NaClO浸泡4 min、0.1% HgCl2浸泡0.5 min或先用75%乙醇浸泡0.5 min 再用0.1% HgCl2浸泡0.5 min，分離內生菌的效果均較好；0.1% HgCl2浸泡0.5 min后置于分離培養基平板上培養2 d，內生菌數量極顯著增加。

關鍵詞：水花生；內生菌；分離；表面消毒；富集作用

中圖分類號：Q938.1 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2014）08-0366-02

由于植物內生菌具有促生、抗蟲、抗菌、抗重金屬污染等作用，在調節植物生長、促進植物抗病蟲害、抗干旱、固氮等方面有較廣泛的應用，并可作為生物工程菌為植物病蟲害的防治提供新的途徑^[1-3]。植物內生菌在人類多種疾病的防治、環境污染降解等方面也有較為廣泛的應用^[1-4]。目前，這些應用均以得到植物內生菌的純培養物為前提，因此植物內生菌的分離純化是應用研究最關鍵的一個環節。研究人員對近幾年植物內生菌的分離方案進行歸納，發現幾乎沒有一個消毒程序是相同的^[5]。為此，本試驗以莖分節且中空、輸導組織極發達的水花生為材料，探索植物內生菌分離時表面消毒過程的一般規律，以期為其他植物內生菌的分離提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集與預處理

植物樣品水花生全部采自湖北咸寧職業技術學院校園內，樣地土壤為熟化的紅色黏土，主要植被為梔子花、紅花檵木等。采樣時按隨機性原則，采集健康無病蟲害的植株帶回實驗室，切取無受傷、無蟲蛀、無斑點的莖，兩端留節，每份約1.5 g，流水沖洗1 h備用。

1.2 分離培養基

分離培養基為牛肉膏蛋白胨瓊脂培養基。

1.3 表面消毒方案

1.3.1 最適消毒方案的探索 將植物材料按以下方案分別處理：75%乙醇分別浸泡2、4、6、8、10 min（處理1至處理5）；75%乙醇先浸泡2 min，無菌水洗3次，再用5% NaClO分別浸泡2、4、6、8、10 min（處理6至處理10）；5% NaClO分別浸泡2、4、6、8、10 min（處理11至處理15）；0.1%HgCl2分別浸泡0.25、0.50、1.00、1.50、2.00 min（處理16至處理20）；75%乙醇先浸泡0.5 min，再用0.1% HgCl2分別浸泡0.25、0.50、1.00、1.50 min（處理21至處理24）（表1）。消毒后的植物材料用無菌水洗3次，放在分離培養基平板表面至少1 min，用無菌剪刀將其剪細，加入石英砂研磨后稀釋 10～100 倍，取100 μL 涂布。每處理重復3次，37 ℃培養 48 h 后計數^[5]。

3 結論

植物內生菌分離過程中常用的消毒劑主要有乙醇、NaClO 和HgCl2。本研究表明，乙醇不適合單獨用于莖分節且中空植物的表面消毒。由于NaClO溶液易揮發且不易久存（保存期約1年），因此在用于植物內生菌分離時要盡量使用新鮮的NaClO溶液。HgCl2盡管對人體及環境有一定副作用，但因其濃度穩定、消毒效果好且所需時間少，分離得到的內生菌數量較穩定，因此比較適合用于植物內生菌，尤其是莖分節且中空植物內生菌的分離。

由于植物種類、部位、生境、生長時期等存在差異，研究人員在進行植物內生菌分離時采用的消毒方案往往各不相同，其原則是盡可能殺死植物表面微生物的同時，應獲得最大量的內生菌。由于植物體內與體外的環境差別較大，分離得到的大多數植物內生菌在分離培養基中生長較慢，而也會有一些內生菌在分離培養基上生長較快，因此在培養1 d后需要觀察1次，2 d 后再計數，3 d后再復核1次。另外，植物內生菌在分離過程中通常設漂洗對照、印跡對照、環境對照^[5]，而本研究只設置了印跡對照，是因為水花生的莖經消毒后再用無菌水清洗3次，放入培養皿時材料本身黏附了約100 μL左右的漂洗液，因此無需再設漂洗對照。

為了獲得在自然界中數量少或難培養的微生物，通常要進行富集培養，就是用一定的選擇性培養基，使樣品中所含的特殊微生物數量從混雜的微生物類群中經培養后得到提高，便于分離^[6]。微生物的富集培養和分離技術在土壤、水、空氣或生活垃圾微生物的分離純化中有廣泛的應用，但在植物內生菌的分離中卻鮮見報道。本研究將水花生的莖經乙醇與HgCl2配合消毒后，再置于分離培養基平板中在適宜溫度下培養過夜，其實質是為植物內生菌創造了良好的溫、濕度條件，促使這些內生菌數量增加，有利于其分離與純化，可認為是對植物內生菌的一種富集作用，這與Thomas等的研究結果^[7-8]一致。

參考文獻：

[1]肖淑賢，高俊明. 植物內生菌的研究概況及應用進展[J]. 農業技術與裝備，2011，01B（2）：74-77.

[2]盧鎮岳，楊新芳，馮永君. 植物內生細菌的分離、分類、定殖與應用[J]. 生命科學，2006，18（1）：90-94.

[3]王莉莉，戴志聰，祁珊珊，等. 植物內生細菌及其對入侵生態學的啟示[J]. 江蘇農業科學，2013，41（3）：9-12.

[4]Yenn T W，Lee C C，Ibrahim D，et al. Enhancement of anti-candidal activity of endophytic fungus Phomopsis sp .ED2，isolated from Orthosiphon stamineus Benth，by incorporation of host plant extract in culture medium[J]. Journal of Microbiology，2012，50（4）：581-585.

[5]王利娟，賀新生. 植物內生真菌分離培養的研究方法[J]. 微生物學雜志，2006，26（4）：55-60.

[6]祝優珍，仇玉蘭，袁 濤. 環境衛生生物學與監測技術[M]. 北京：化學工業出版社，2007：165.

[7]Thomas P，Soly T A. Endophytic bacteria associated with growing shoot tips of banana （Musa sp.） cv. grand naine and the affinity of endophytes to the host[J]. Microbial Ecology，2009，58（4）：952-964.

[8]Vendan R T，Yu Y J，Lee S H，et al. Diversity of endophytic bacteria in ginseng and their potential for plant growth promotion[J]. Journal of Microbiology，2010，48（5）：559-565.endprint

摘要：為了探索植物內生菌分離時表面消毒條件的一般規律，分別用不同消毒劑對水花生的莖處理不同時間，并以最佳組合對植物材料進行消毒處理，放置于分離培養基平板中，在適溫下培養不同時間，觀察各個處理對植物內生菌數量的影響。結果表明，用5%NaClO浸泡4 min、0.1% HgCl2浸泡0.5 min或先用75%乙醇浸泡0.5 min 再用0.1% HgCl2浸泡0.5 min，分離內生菌的效果均較好；0.1% HgCl2浸泡0.5 min后置于分離培養基平板上培養2 d，內生菌數量極顯著增加。

關鍵詞：水花生；內生菌；分離；表面消毒；富集作用

中圖分類號：Q938.1 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2014）08-0366-02

由于植物內生菌具有促生、抗蟲、抗菌、抗重金屬污染等作用，在調節植物生長、促進植物抗病蟲害、抗干旱、固氮等方面有較廣泛的應用，并可作為生物工程菌為植物病蟲害的防治提供新的途徑^[1-3]。植物內生菌在人類多種疾病的防治、環境污染降解等方面也有較為廣泛的應用^[1-4]。目前，這些應用均以得到植物內生菌的純培養物為前提，因此植物內生菌的分離純化是應用研究最關鍵的一個環節。研究人員對近幾年植物內生菌的分離方案進行歸納，發現幾乎沒有一個消毒程序是相同的^[5]。為此，本試驗以莖分節且中空、輸導組織極發達的水花生為材料，探索植物內生菌分離時表面消毒過程的一般規律，以期為其他植物內生菌的分離提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集與預處理

植物樣品水花生全部采自湖北咸寧職業技術學院校園內，樣地土壤為熟化的紅色黏土，主要植被為梔子花、紅花檵木等。采樣時按隨機性原則，采集健康無病蟲害的植株帶回實驗室，切取無受傷、無蟲蛀、無斑點的莖，兩端留節，每份約1.5 g，流水沖洗1 h備用。

1.2 分離培養基

分離培養基為牛肉膏蛋白胨瓊脂培養基。

1.3 表面消毒方案

1.3.1 最適消毒方案的探索 將植物材料按以下方案分別處理：75%乙醇分別浸泡2、4、6、8、10 min（處理1至處理5）；75%乙醇先浸泡2 min，無菌水洗3次，再用5% NaClO分別浸泡2、4、6、8、10 min（處理6至處理10）；5% NaClO分別浸泡2、4、6、8、10 min（處理11至處理15）；0.1%HgCl2分別浸泡0.25、0.50、1.00、1.50、2.00 min（處理16至處理20）；75%乙醇先浸泡0.5 min，再用0.1% HgCl2分別浸泡0.25、0.50、1.00、1.50 min（處理21至處理24）（表1）。消毒后的植物材料用無菌水洗3次，放在分離培養基平板表面至少1 min，用無菌剪刀將其剪細，加入石英砂研磨后稀釋 10～100 倍，取100 μL 涂布。每處理重復3次，37 ℃培養 48 h 后計數^[5]。

3 結論

植物內生菌分離過程中常用的消毒劑主要有乙醇、NaClO 和HgCl2。本研究表明，乙醇不適合單獨用于莖分節且中空植物的表面消毒。由于NaClO溶液易揮發且不易久存（保存期約1年），因此在用于植物內生菌分離時要盡量使用新鮮的NaClO溶液。HgCl2盡管對人體及環境有一定副作用，但因其濃度穩定、消毒效果好且所需時間少，分離得到的內生菌數量較穩定，因此比較適合用于植物內生菌，尤其是莖分節且中空植物內生菌的分離。

由于植物種類、部位、生境、生長時期等存在差異，研究人員在進行植物內生菌分離時采用的消毒方案往往各不相同，其原則是盡可能殺死植物表面微生物的同時，應獲得最大量的內生菌。由于植物體內與體外的環境差別較大，分離得到的大多數植物內生菌在分離培養基中生長較慢，而也會有一些內生菌在分離培養基上生長較快，因此在培養1 d后需要觀察1次，2 d 后再計數，3 d后再復核1次。另外，植物內生菌在分離過程中通常設漂洗對照、印跡對照、環境對照^[5]，而本研究只設置了印跡對照，是因為水花生的莖經消毒后再用無菌水清洗3次，放入培養皿時材料本身黏附了約100 μL左右的漂洗液，因此無需再設漂洗對照。

為了獲得在自然界中數量少或難培養的微生物，通常要進行富集培養，就是用一定的選擇性培養基，使樣品中所含的特殊微生物數量從混雜的微生物類群中經培養后得到提高，便于分離^[6]。微生物的富集培養和分離技術在土壤、水、空氣或生活垃圾微生物的分離純化中有廣泛的應用，但在植物內生菌的分離中卻鮮見報道。本研究將水花生的莖經乙醇與HgCl2配合消毒后，再置于分離培養基平板中在適宜溫度下培養過夜，其實質是為植物內生菌創造了良好的溫、濕度條件，促使這些內生菌數量增加，有利于其分離與純化，可認為是對植物內生菌的一種富集作用，這與Thomas等的研究結果^[7-8]一致。

參考文獻：

[1]肖淑賢，高俊明. 植物內生菌的研究概況及應用進展[J]. 農業技術與裝備，2011，01B（2）：74-77.

[2]盧鎮岳，楊新芳，馮永君. 植物內生細菌的分離、分類、定殖與應用[J]. 生命科學，2006，18（1）：90-94.

[3]王莉莉，戴志聰，祁珊珊，等. 植物內生細菌及其對入侵生態學的啟示[J]. 江蘇農業科學，2013，41（3）：9-12.

[4]Yenn T W，Lee C C，Ibrahim D，et al. Enhancement of anti-candidal activity of endophytic fungus Phomopsis sp .ED2，isolated from Orthosiphon stamineus Benth，by incorporation of host plant extract in culture medium[J]. Journal of Microbiology，2012，50（4）：581-585.

[5]王利娟，賀新生. 植物內生真菌分離培養的研究方法[J]. 微生物學雜志，2006，26（4）：55-60.

[6]祝優珍，仇玉蘭，袁 濤. 環境衛生生物學與監測技術[M]. 北京：化學工業出版社，2007：165.

[7]Thomas P，Soly T A. Endophytic bacteria associated with growing shoot tips of banana （Musa sp.） cv. grand naine and the affinity of endophytes to the host[J]. Microbial Ecology，2009，58（4）：952-964.

[8]Vendan R T，Yu Y J，Lee S H，et al. Diversity of endophytic bacteria in ginseng and their potential for plant growth promotion[J]. Journal of Microbiology，2010，48（5）：559-565.endprint

摘要：為了探索植物內生菌分離時表面消毒條件的一般規律，分別用不同消毒劑對水花生的莖處理不同時間，并以最佳組合對植物材料進行消毒處理，放置于分離培養基平板中，在適溫下培養不同時間，觀察各個處理對植物內生菌數量的影響。結果表明，用5%NaClO浸泡4 min、0.1% HgCl2浸泡0.5 min或先用75%乙醇浸泡0.5 min 再用0.1% HgCl2浸泡0.5 min，分離內生菌的效果均較好；0.1% HgCl2浸泡0.5 min后置于分離培養基平板上培養2 d，內生菌數量極顯著增加。

關鍵詞：水花生；內生菌；分離；表面消毒；富集作用

中圖分類號：Q938.1 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2014）08-0366-02

由于植物內生菌具有促生、抗蟲、抗菌、抗重金屬污染等作用，在調節植物生長、促進植物抗病蟲害、抗干旱、固氮等方面有較廣泛的應用，并可作為生物工程菌為植物病蟲害的防治提供新的途徑^[1-3]。植物內生菌在人類多種疾病的防治、環境污染降解等方面也有較為廣泛的應用^[1-4]。目前，這些應用均以得到植物內生菌的純培養物為前提，因此植物內生菌的分離純化是應用研究最關鍵的一個環節。研究人員對近幾年植物內生菌的分離方案進行歸納，發現幾乎沒有一個消毒程序是相同的^[5]。為此，本試驗以莖分節且中空、輸導組織極發達的水花生為材料，探索植物內生菌分離時表面消毒過程的一般規律，以期為其他植物內生菌的分離提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集與預處理

植物樣品水花生全部采自湖北咸寧職業技術學院校園內，樣地土壤為熟化的紅色黏土，主要植被為梔子花、紅花檵木等。采樣時按隨機性原則，采集健康無病蟲害的植株帶回實驗室，切取無受傷、無蟲蛀、無斑點的莖，兩端留節，每份約1.5 g，流水沖洗1 h備用。

1.2 分離培養基

分離培養基為牛肉膏蛋白胨瓊脂培養基。

1.3 表面消毒方案

1.3.1 最適消毒方案的探索 將植物材料按以下方案分別處理：75%乙醇分別浸泡2、4、6、8、10 min（處理1至處理5）；75%乙醇先浸泡2 min，無菌水洗3次，再用5% NaClO分別浸泡2、4、6、8、10 min（處理6至處理10）；5% NaClO分別浸泡2、4、6、8、10 min（處理11至處理15）；0.1%HgCl2分別浸泡0.25、0.50、1.00、1.50、2.00 min（處理16至處理20）；75%乙醇先浸泡0.5 min，再用0.1% HgCl2分別浸泡0.25、0.50、1.00、1.50 min（處理21至處理24）（表1）。消毒后的植物材料用無菌水洗3次，放在分離培養基平板表面至少1 min，用無菌剪刀將其剪細，加入石英砂研磨后稀釋 10～100 倍，取100 μL 涂布。每處理重復3次，37 ℃培養 48 h 后計數^[5]。

3 結論

植物內生菌分離過程中常用的消毒劑主要有乙醇、NaClO 和HgCl2。本研究表明，乙醇不適合單獨用于莖分節且中空植物的表面消毒。由于NaClO溶液易揮發且不易久存（保存期約1年），因此在用于植物內生菌分離時要盡量使用新鮮的NaClO溶液。HgCl2盡管對人體及環境有一定副作用，但因其濃度穩定、消毒效果好且所需時間少，分離得到的內生菌數量較穩定，因此比較適合用于植物內生菌，尤其是莖分節且中空植物內生菌的分離。

由于植物種類、部位、生境、生長時期等存在差異，研究人員在進行植物內生菌分離時采用的消毒方案往往各不相同，其原則是盡可能殺死植物表面微生物的同時，應獲得最大量的內生菌。由于植物體內與體外的環境差別較大，分離得到的大多數植物內生菌在分離培養基中生長較慢，而也會有一些內生菌在分離培養基上生長較快，因此在培養1 d后需要觀察1次，2 d 后再計數，3 d后再復核1次。另外，植物內生菌在分離過程中通常設漂洗對照、印跡對照、環境對照^[5]，而本研究只設置了印跡對照，是因為水花生的莖經消毒后再用無菌水清洗3次，放入培養皿時材料本身黏附了約100 μL左右的漂洗液，因此無需再設漂洗對照。

為了獲得在自然界中數量少或難培養的微生物，通常要進行富集培養，就是用一定的選擇性培養基，使樣品中所含的特殊微生物數量從混雜的微生物類群中經培養后得到提高，便于分離^[6]。微生物的富集培養和分離技術在土壤、水、空氣或生活垃圾微生物的分離純化中有廣泛的應用，但在植物內生菌的分離中卻鮮見報道。本研究將水花生的莖經乙醇與HgCl2配合消毒后，再置于分離培養基平板中在適宜溫度下培養過夜，其實質是為植物內生菌創造了良好的溫、濕度條件，促使這些內生菌數量增加，有利于其分離與純化，可認為是對植物內生菌的一種富集作用，這與Thomas等的研究結果^[7-8]一致。

參考文獻：

[1]肖淑賢，高俊明. 植物內生菌的研究概況及應用進展[J]. 農業技術與裝備，2011，01B（2）：74-77.

[2]盧鎮岳，楊新芳，馮永君. 植物內生細菌的分離、分類、定殖與應用[J]. 生命科學，2006，18（1）：90-94.

[3]王莉莉，戴志聰，祁珊珊，等. 植物內生細菌及其對入侵生態學的啟示[J]. 江蘇農業科學，2013，41（3）：9-12.

[4]Yenn T W，Lee C C，Ibrahim D，et al. Enhancement of anti-candidal activity of endophytic fungus Phomopsis sp .ED2，isolated from Orthosiphon stamineus Benth，by incorporation of host plant extract in culture medium[J]. Journal of Microbiology，2012，50（4）：581-585.

[5]王利娟，賀新生. 植物內生真菌分離培養的研究方法[J]. 微生物學雜志，2006，26（4）：55-60.

[6]祝優珍，仇玉蘭，袁 濤. 環境衛生生物學與監測技術[M]. 北京：化學工業出版社，2007：165.

[7]Thomas P，Soly T A. Endophytic bacteria associated with growing shoot tips of banana （Musa sp.） cv. grand naine and the affinity of endophytes to the host[J]. Microbial Ecology，2009，58（4）：952-964.

[8]Vendan R T，Yu Y J，Lee S H，et al. Diversity of endophytic bacteria in ginseng and their potential for plant growth promotion[J]. Journal of Microbiology，2010，48（5）：559-565.endprint