電子順磁共振對(duì)五種中草藥抗氧化活性的研究

周麗芳，朱 翔，趙紅莉，藍(lán)閩波，*，史新梅

1華東理工大學(xué)上海市功能性材料化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;2華東理工大學(xué)分析測(cè)試中心，上海 200237

通常情況下，生物體在代謝的過(guò)程中不斷地產(chǎn)生自由基，也有許多自由基中間體的參與，體內(nèi)自由基的產(chǎn)生和消除在正常情況下始終保持著一種動(dòng)態(tài)的平衡狀態(tài)［1］。當(dāng)環(huán)境有害因素誘導(dǎo)生物體體內(nèi)活性氧自由基大量釋放，大大超出了正常水平，就導(dǎo)致了機(jī)體的氧化應(yīng)激狀態(tài)，引起機(jī)體的氧化應(yīng)激損傷［2］。而一些抗氧化劑能有效地清除生物體體內(nèi)產(chǎn)生的過(guò)量的自由基，提高機(jī)體的抗氧化能力，降低氧化應(yīng)激引起的脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，有效地起到防止氧化損傷［3］。中草藥是天然抗氧化劑，其抗氧化能力和中草藥清除自由基的能力有關(guān)。本文主要利用電子順磁共振技術(shù)研究比較了大黃等5種中草藥對(duì)DPPH、·OH和的清除能力的大小，得到了抗氧化活性能力較強(qiáng)的中草藥，為中草藥用于生物體的抗氧化應(yīng)激研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實(shí)驗(yàn)材料:大黃、香青蘭、香茅草、懈寄生和駱駝蓬子，購(gòu)自上海雷允上藥品連鎖凌云店。

實(shí)驗(yàn)試劑:5，5-二甲基-1-吡咯啉-N-氧化物(DMPO)、二乙三胺五乙酸(DETAPAC)、1，1-二苯基-2-苦基肼自由基(DPPH)、黃嘌呤(X)和黃嘌呤氧化酶(XOD)均購(gòu)自于Sigma公司;硫酸亞鐵(Fe-SO4)購(gòu)置于中國(guó)醫(yī)藥(集團(tuán))上?；瘜W(xué)試劑公司;30%過(guò)氧化氫(H2O2)購(gòu)置于金鹿化工有限公司;超純水。

實(shí)驗(yàn)儀器:EMX-8/2.7電子順磁共振波譜儀(德國(guó)Bruker公司);R201旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海申勝生物技術(shù)有限公司);SHZ-D(Ⅲ)循環(huán)水式真空泵(鞏義市英峪予華儀器廠);Hitech-Sciencetool高端型超純水機(jī)(上海和泰儀器有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 中草藥的提取

稱(chēng)量5 g中藥，放置于250 mL的圓底燒瓶中，加入100 mL雙蒸水，浸泡2 h，回流0.5 h，減壓抽濾，再加入100 mL雙蒸水，回流0.5 h，減壓抽濾，第三次加入100 mL雙蒸水，回流0.5 h，減壓抽濾。合并3次濾液，減壓旋蒸濃縮，定容于50 mL容量瓶中得到0.1 g/mL原藥放置于4℃冰箱中待用。

1.2.2 中草藥的抗氧化活性實(shí)驗(yàn)

1.2.2.1 中草藥對(duì)DPPH的清除作用

量取不同濃度(8、6、4、2、1、0.5 mg/mL)的中藥樣品 50 μL，加入到100 μL 0.5 mmol/L 的 DPPH 溶液中，混合均勻后室溫避光反應(yīng)30 min，用微量注射器取上清液注入Teflon毛細(xì)管(直徑1 mm，管壁0.1 mm厚，長(zhǎng)度大約6 cm)中，將毛細(xì)管對(duì)折，插入順磁石英樣品管底部，將樣品管插入諧振腔中心位置進(jìn)行EPR常溫檢測(cè)。

實(shí)驗(yàn)參數(shù):中心磁場(chǎng):3513G;掃場(chǎng)寬度:150G;調(diào)制頻率:100 KHz;調(diào)制幅度:1.5G;放大倍數(shù):2.00e+004;掃描次數(shù):1;微波功率:2.010 mW;時(shí)間常數(shù):163.84 ms;掃場(chǎng)時(shí)間:41.943 s。

1.2.2.2 中草藥對(duì)羥基自由基的清除作用

量取不同濃度(8、4、2、1、0.5 mg/mL)的中藥樣品 50 μL，加入 40 μL 0.2 mmol/L FeSO4的水溶液、40 μL 的雙蒸水和 40 μL 0.1 mol/L DMPO 的水溶液，混合均勻后加入40 μL 0.1%H2O2，混合后立即取樣，用微量注射器取上清液注入Teflon毛細(xì)管中，將毛細(xì)管對(duì)折，插入順磁石英樣品管底部，將樣品管插入諧振腔中心位置進(jìn)行EPR檢測(cè)，整個(gè)過(guò)程控制在3 min內(nèi)完成。

實(shí)驗(yàn)參數(shù):中心磁場(chǎng):3510 G;掃場(chǎng)寬度:100 G;調(diào)制頻率:100 KHz;調(diào)制幅度:1.0 G;放大倍數(shù):2.00e+004;掃描次數(shù):1;微波功率:2.017 mW;時(shí)間常數(shù):163.84 ms;掃場(chǎng)時(shí)間:41.943 s。

1.2.2.3 中草藥對(duì)超氧陰離子自由基的清除作用

量取不同濃度(8、4、2、1、0.5 mg/mL)的中藥樣品50 μL，加入40 μL 0.5 mmol/L DETAPAC 的 PBS(pH7.8)溶液、40 μL 25 mmol/L X 的 PBS 溶液、80 μL 0.1 mol/L DMPO的水溶液，混合均勻后加入40 μL 0.25 u/mL XOD的PBS溶液，混合后立即取樣，用微量注射器取上清液注入Teflon毛細(xì)管中，將毛細(xì)管對(duì)折，插入順磁石英樣品管底部，將樣品管插入諧振腔中心位置進(jìn)行EPR檢測(cè)，整個(gè)過(guò)程控制在3min內(nèi)完成。

實(shí)驗(yàn)參數(shù):中心磁場(chǎng):3513 G;掃場(chǎng)寬度:100 G;調(diào)制頻率:100 KHz;調(diào)制幅度:1.0 G;放大倍數(shù):5.64e+004;掃描次數(shù):1;微波功率:20.12 mW;時(shí)間常數(shù):163.84 ms;掃場(chǎng)時(shí)間:41.943 s。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理

所有EPR實(shí)驗(yàn)均重復(fù)三次，以平均值表示，數(shù)據(jù)處理使用Origin 8.0，自由基清除率(radical scavenging activity)的計(jì)算公式為RSA=(H0-H)/H0×100%［4］，其中RSA為中藥對(duì)自由基的清除率，H0為空白對(duì)照樣特征峰的峰高，H為樣品特征峰的峰高。

2 結(jié)果與討論

2.1 中草藥對(duì)DPPH的清除作用

DPPH自由基是一種穩(wěn)定的自由基，可以直接在室溫檢測(cè)得到EPR信號(hào)，并且在短時(shí)間內(nèi)不會(huì)發(fā)生衰減。利用電子順磁共振法研究了不同濃度的大黃等五種中草藥對(duì)DPPH自由基的清除能力。DPPH的EPR信號(hào)為五重峰，隨著中草藥濃度的升高而變小，DPPH峰形基本不變，只是高度發(fā)生了變化(圖1以香茅草為例)。

圖1 不同濃度的香茅草對(duì)DPPH的清除作用的EPR譜圖Fig.1 EPR spectra of DPPH after adding different concentrations of lemongrass

根據(jù)DPPH清除率的計(jì)算公式，RSA=(H0-H)/H0×100%，H0為空白對(duì)照樣中間峰的峰高，H為樣品中間的峰高，可以得到5種中草藥對(duì)DPPH自由基的清除率(表1)。

從表1可以看出，加入不同濃度的5種中草藥對(duì)DPPH都有一定的清除作用，而且清除作用快，幾分鐘內(nèi)就能清除大量的DPPH自由基，清除率和中藥濃度呈現(xiàn)明顯的量效關(guān)系，清除率隨著中藥濃度的增加而增加(圖2以香茅草為例)，并且在一定的清除率范圍內(nèi)(一般為15% ～75%)呈現(xiàn)很好的線性相關(guān)［5］，清除率太高或太低的時(shí)候線性相關(guān)性下降。

表1 五種中藥對(duì)DPPH的清除率Table 1 DPPH scavenging rates of five TCMs

圖2 不同濃度的香茅草對(duì)DPPH的清除率隨時(shí)間的變化曲線Fig.2 The DPPH radical scavenging rate-time curves of different concentrations of lemongrass

中草藥清除DPPH自由基能力一般采用IC50表示，IC50的物理意義為中草藥對(duì)DPPH自由基清除率達(dá)到50%時(shí)的質(zhì)量濃度，IC50值越低，中草藥清除自由基的能力越強(qiáng)。用Origin軟件對(duì)中草藥濃度和清除率進(jìn)行多項(xiàng)式擬合，相關(guān)系數(shù) R2勻大于0.9800，說(shuō)明回歸方程具有可靠性，能較好的解釋中草藥對(duì)DPPH自由基清除作用的劑量一效應(yīng)關(guān)系。

由回歸方程可以計(jì)算出5種中草藥對(duì)DPPH自由基清除率為50%時(shí)所需的樣品質(zhì)量濃度IC50的值。5種中草藥質(zhì)量濃度和清除率的相關(guān)擬合方程，相關(guān)系數(shù)和IC50見(jiàn)表2。

表2 中草藥對(duì)DPPH自由基清除作用的量效擬合方程Table 2 Dose-effect relationship simulated equations of the DPPH scavenging activity of TCMs

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明5種中草藥對(duì)DPPH均有一定的清除作用，并且清除率隨著中草藥濃度的增加而增加，其中大黃、香茅草和香青蘭對(duì)DPPH的清除作用較強(qiáng)，而大黃對(duì)DPPH的清除率更為顯著，IC50＜0.5 mg/mL，懈寄生和駱駝蓬子的對(duì)DPPH的清除率較弱。

2.2 中草藥對(duì)羥基自由基的清除作用

羥基自由基是一種短壽命的氧自由基，在水溶液中壽命只有10-6s，不能直接在室溫檢測(cè)得到EPR信號(hào)，必須加入自由基捕捉劑形成比較穩(wěn)定的自由基加合物［6］。通過(guò)DMPO捕捉劑捕捉到的自由基加合物雖然比原有的羥基自由基穩(wěn)定，但是也會(huì)發(fā)生衰減(圖3)，因此實(shí)驗(yàn)加入DMPO捕捉劑后在3 min內(nèi)完成EPR的檢測(cè)。

圖3 DMPO-OH的EPR強(qiáng)度隨時(shí)間的變化曲線Fig.3 The changing curve of EPR intensity of DMPO-OH with time

本文利用電子自旋捕捉技術(shù)［7］，研究了5種中草藥對(duì)通過(guò)Fenton反應(yīng)產(chǎn)生的羥基自由基的清除能力。DMPO-OH的EPR信號(hào)為四重峰，強(qiáng)度比為1∶2∶2∶1，超精細(xì)耦合常數(shù) aN=aH=14.9G。DMPOOH信號(hào)強(qiáng)度隨著中草藥濃度的升高而變小，而四重峰的峰形基本不變，只是高度發(fā)生了變化(圖4以香茅草為例)。

根據(jù)羥基自由基清除率的計(jì)算公式，RSA=(H0-H)/H0×100%，H0為空白對(duì)照樣第二個(gè)峰的峰高，H為樣品第二個(gè)峰的峰高，可以得到5種中草藥對(duì)·OH的清除率(表3)。

圖4 不同濃度的香茅草對(duì)·OH的清除作用的EPR譜圖Fig.4 EPR spectra of DMPO-OH after adding different concentrations of lemongrass

表3 五種中藥對(duì)·OH的清除率Table 3 ·OH scavenging rate of five TCMs

用Origin軟件對(duì)中草藥濃度和清除率進(jìn)行多項(xiàng)式擬合，得到5種中草藥質(zhì)量濃度和清除率的相關(guān)多項(xiàng)式擬合方程，相關(guān)系數(shù)和IC50見(jiàn)表4。

表4 中草藥對(duì)·OH自由基清除作用的量效擬合方程Table 4 Dose-effect simulation equations of the·OH scavenging activity of TCM

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明5種中草藥對(duì)·OH均有一定的清除作用，并且清除率隨著中草藥濃度的增加而增加，其中大黃和香茅草對(duì)·OH的清除作用較強(qiáng)，而大黃對(duì)·OH的清除率更為顯著，IC50=1.892 mg/mL，駱駝蓬子對(duì)·OH的清除率較弱，IC50=7.189 mg/mL。

2.3 中藥對(duì)超氧陰離子自由基的清除作用

超氧陰離子自由基和羥基自由基一樣也是一種短壽命氧自由基，不能直接在室溫檢測(cè)得到EPR信號(hào)，必須加入自由基捕捉劑形成較穩(wěn)定的自由基加合物。本文利用電子自旋捕捉技術(shù)，研究了5種中草藥對(duì)黃嘌呤和黃嘌呤氧化酶體系反應(yīng)產(chǎn)生的超氧陰離子自由基的清除能力，得到了DMPO-OOH的EPR譜圖(圖5以香茅草為例)，有12條譜線組成，超精細(xì)耦合常數(shù) aN=14.3G=11.3G=1.4G。

圖5 不同濃度的香茅草對(duì)的清除作用的EPR譜圖Fig.5 EPR spectra of DMPO-OOH after adding different concentrations of lemongrass

根據(jù)超氧陰離子自由基清除率的計(jì)算公式，RSA=(H0-H)/H0×100%，H0為空白對(duì)照樣第一個(gè)峰的峰高，H為樣品第一個(gè)峰的峰高，可以得到不同中草藥對(duì)的清除率(表5)。

表5 五種中藥對(duì)的清除率Table 5 scavenging rate of five TCMs

表5 五種中藥對(duì)的清除率Table 5 scavenging rate of five TCMs

樣品濃度Sample concentration(mg/mL)8 6 4 2 1 0.5香青蘭 D．moldavica L. 81.42 77.41 68.46 54.22 40.80 30.26香茅草Lemongrass 80.02 77.16 69.72 51.19 35.05 21.56懈寄生Mistletoe 77.75 71.24 61.41 41.96 26.11 18.03駱駝蓬子Deed of common peganum 80.61 72.91 67.31 57.04 50.97 44.57大黃Rhubarb 94.57 91.92 87.67 87.16 86.57 85.63

用Origin軟件對(duì)中草藥濃度和清除率進(jìn)行多項(xiàng)式擬合，得到5種中草藥質(zhì)量濃度和清除率的相關(guān)多項(xiàng)式擬合方程，相關(guān)系數(shù)和IC50見(jiàn)表6。

表6 中草藥對(duì)自由基清除作用的量效擬合方程Table 6 Dose-effect simulation equations of thescavenging activity of TCMs

表6 中草藥對(duì)自由基清除作用的量效擬合方程Table 6 Dose-effect simulation equations of thescavenging activity of TCMs

樣品Sample清除回歸擬合曲線Simulation equation of dose and·OH scavenging activity相關(guān)系數(shù)R2 Correlation coefficient R2 IC50(mg/mL)香青蘭D．moldavica L. y=25.52+15.02x-1.018x20.9846 1.866香茅草Lemongrass y=15.41+19.31x-1.426x2 0.9820 2.125懈寄生Mistletoe y=10.71+16.85x-1.073x2 0.9950 2.848駱駝蓬子Seed of common peganum y=42.63+7.443x-0.3496x2 0.9834 1.041大黃Rhubarb - - ＜0.5

2.4 討論

我國(guó)的中草藥是天然抗氧化劑的重要來(lái)源，從中藥中篩選出抗氧化活性強(qiáng)的物質(zhì)，用于生物體的抗氧化應(yīng)激研究方面具有一定的應(yīng)用價(jià)值。目前研究中草藥抗氧化活性的方法有好幾種，如勾明玥［8］等人采用DPPH分光光度法測(cè)定了26種植物的抗氧化活性，劉建華［9］等人采用DPPH和總抗氧化活性能力(FRAP)法對(duì)大黃蒽醌類(lèi)化合物抗氧化活性的研究。中草藥的抗氧化活性能力的大小主要表現(xiàn)為中草藥清除自由基能力的大小，而電子順磁共振方法是研究自由基最直接和最有效的方法和技術(shù)。本文采用了電子順磁共振方法研究了大黃等5種中草藥清除3種不同自由基的能力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明大黃中草藥對(duì)穩(wěn)定自由基和活性氧自由基的清除作用最強(qiáng)，表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗氧化活性能力。陳玉霞［10］等人用總抗氧化能力方法也研究過(guò)大黃等41種中草藥的抗氧化活性能力表明大黃等一些中藥具有較強(qiáng)的抗氧化作用。

3 結(jié)論

運(yùn)用電子順磁共振研究了大黃等5種中草藥對(duì)DPPH、·OH 和三種自由基的清除作用，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明大黃等5種中草藥對(duì)3種自由基均有一定的清除作用，其中大黃對(duì)3種自由基的清除率均為最大，大黃中草藥的抗氧化活性能力較強(qiáng)，可應(yīng)用于生物體的氧化應(yīng)激研究，為中草藥用于生物體的抗氧化應(yīng)激研究提供依據(jù)。

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