姜黃素通過MAPK信號通路誘導人肝癌SMMC-7721細胞凋亡

李會宣，楊 虹，張紅兵，高 健

1河北經貿大學生物科學與工程學院，石家莊050061;2華北制藥集團新藥研究開發有限責任公司抗體藥物研制國家重點實驗室，石家莊 050015

姜黃素(Curcumin)是植物多酚類色素，廣泛存在于姜黃屬植物的根莖中，中藥姜黃的重要活性成分之一。姜黃素的主要藥理作用有抗氧化、抗炎、抗癌、降脂、抗動脈粥樣硬化、抗纖維化、清除自由基等作用［1］。由于姜黃素無明顯的毒副作用，其抗腫瘤作用日益引起人們的重視，已成為腫瘤預防和治療的一個研究熱點［2］。姜黃素對于肝癌的作用，目前的研究多集中于體外抗腫瘤效應［3］，對其分子機制報道較少。本實驗對姜黃素抑制人肝癌SMMC-7721細胞增殖并誘導凋亡作用及其可能的作用機制進行初步的研究。通過觀察姜黃素對人肝癌SMMC-7721細胞增殖和凋亡的影響，檢測姜黃素對SMMC-7721細胞中 Caspase-3、Survivin、Bcl-2 和 Bax基因表達的影響，揭示姜黃素誘導細胞凋亡的信號通路，以期為臨床應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

肝癌細胞SMMC-7721(華北制藥集團新藥研究開發有限責任公司惠贈);姜黃素(國藥集團化學試劑有限公司)以少量二甲基亞砜(DMSO)溶解配制成1 mmol/L儲備溶液;RPMI-1640(Gibico公司);MTT、胎牛血清、DMSO、ERK特異性抑制劑PD98059、p38 MAPK特異性抑制劑 SB203580及JNK特異性抑制劑SP600125購自Sigma公司;Trizol試劑及RT-PCR反應體系購自Promega公司;Survivin、Bcl-2和Bax的PCR引物由上海生物工程有限責任公司合成;鼠抗人 Caspase 3、Survivin、Bcl-2、Bax、β-actin、p-JNK/JNK、p-ERK/ERK 和 p-p38/p38的單克隆抗體，HRP聯連的兔抗鼠的二抗、化學發光試劑均為Santa Cruz公司產品。

1.2 儀器與設備

垂直電泳系統(美國Bio-Rad公司)，流式細胞儀(BD FACSCalibur)，Gel DOC2000凝膠成像系統(美國Bio-Rad公司)，Microplate Reader 450酶標儀(美國Bio-Rad公司)，5415D離心機(基因科技公司)，半干轉膜儀(美國Bio-Rad公司)和ID數碼成像分析系統(美國Kodak公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 MTT法測定姜黃素對SMCC-7721細胞增殖的影響

取對數生長期的SMCC-7721細胞，0.25%胰蛋白酶消化分離，重新混懸于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養液，調整細胞數為5×104cell/mL，以每孔200 μL加入96孔培養板中于CO2培養箱中培養，貼壁24 h后分別加入終濃度為10、20、40和80 μmol/L的姜黃素，每組設5個復孔，并設陰性和空白對照組，分別培養 12、24、48、72 h，每孔分別加入5 mg/mL MTT溶液40μL，振蕩后于37.0℃繼續培養4 h，吸棄孔內上清培養液，于每孔內加入300 μL DMSO，使形成的甲月贊(ormazan)充分溶解，放入酶標儀，選擇570 nm，空白孔調零，記錄各孔吸光度OD值。

1.3.2 細胞計數法測定姜黃素對SMCC-7721細胞增殖的影響

將處于對數生長期的SMCC-7721細胞懸液以3×104～4×104cell/孔的密度接種于24孔板，培養12 h后，吸去培養液，隨機分組(n=5)，加入正常培養液(不加姜黃素的Control組)或終濃度為10、20、40和80 μmol/L的姜黃素的培養液，培養一定時間后，用血細胞計數板計數，以時間為橫軸、細胞數為縱軸做量效曲線。

1.3.3 流式細胞儀(FCM)檢測姜黃素誘導SMMC-7721細胞的凋亡

人肝癌SMMC-7721細胞常規培養至對數生長期，換無血清培養液培養12 h使細胞周期同步化，加入終濃度為40 μmol/L的姜黃素溶液培養，正常對照Control組加入等量培養基，再培養48 h后，制成單細胞懸液，離心棄上清，沿管壁緩慢加入700 mL/L預冷(-20℃)乙醇固定，上機檢測前RNA酶消化，再加入PI染色液，4℃避光30 min，FCM檢測凋亡率及細胞周期。

1.3.4 RT-PCR檢測 Survivin、Bcl-2和 Bax的 mRNA的表達

取對數生長期SMMC-7721細胞，加入40 μmol/L的姜黃素作用不同后采用Trizol一步法提取總RNA，取 1 μL 總 RNA 以 10 μL 體系逆轉錄，制備cDNA并進行反轉錄PCR。使用引物如下:Survivin(GenBank:U75285.1)上游引物5'-CCACCGCATCTCTACATTC-3'，下游引物 5'-CTTTC TTCGCAGTTTCCTC-3'，產物長度 344 bp;Bcl-2(Gen-Bank:M13995.1)上游引物5'-ATGGCGCACGCTGGGAGAA-3'，下 游 引 物 5'-CGGTAGCGGCGGGAGAAGTC-3'，產物長度 326bp;Bax(GenBank:AY217036.1)上游引物5'-ACCAAGAAGCTGAGCGAGTGTC-3'，下游引物 5'-CCC ACCCCTCCCAGAAAAAT-3'，產物長度 480bp;β-actin(Gen-Bank:DQ407611.1)上游引物5'-AGTGTGACGTG-GACATCCGCA-3'，下游引物5'-ATCCACATCTGCTGGAAGGTGGAC-3'，產物長度220 bp。循環條件:預變性94℃ 5 min，變性94℃ 40 s，退火58℃ 40 s，延伸72℃ 50 s，循環30次，終延伸10 min。擴增產物用瓊脂糖凝膠電泳檢測，應用凝膠成像系統進行掃描。

1.3.5 Western blot檢測 Bcl-2、Survivin、Bax 和Caspase-3蛋白的表達

1.3.5.1 細胞總蛋白提取

取對數生長期的 SMMC-7721細胞，加入40 μmol/L姜黃素處理一定時間后，收集細胞，PBS洗滌兩次，加入細胞裂解液100 μL，4℃14000 rpm離心10 min，將上清按需分裝，保存于-70℃，蛋白濃度以改良Lowry法進行蛋白定量。

1.3.5.2 Western blot檢測

各組取等量蛋白提取液，經SDS-PAGE泳分離，電轉移至PVDF膜上;取膜并用5% 脫脂奶粉封閉后，與鼠抗人 Bcl-2、Survivin、Bax或 Caspase 3的單克隆抗體(1∶300)于4℃反應過夜，洗膜后再與HRP標記的相應二抗(1∶10000)室溫反應2 h，洗膜后利用增強性化學發光試劑盒(ECL)檢測特異性蛋白條帶，采用成像分析系統分析結果。

1.3.6 Western blot檢測姜黃素對JNK、ERK和p38 MAPK信號通路的影響

Western blot檢測JNK、ERK和p38 MAPK蛋白及磷酸化水平，一抗使用p-JNK/JNK、p-ERK/ERK和p-p38/p38 MAPK的單克隆抗體，方法同1.3.5。

1.3.7 統計學處理

所有數據用means±SD表示，采用SPSS13.0統計軟件進行數據處理，兩組以上數據間比較用方差分析，兩組間比較用t檢驗，以P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 實驗結果

2.1 姜黃素可抑制人肝癌細胞SMMC-7721的增殖

以10、20、40 和 80 μmol/L 四種濃度的姜黃素分別處理人肝癌SMMC-7721細胞不同時間，檢測細胞增殖情況。結果如圖1所示，MTT法檢測結果表明(圖 1A):與正常對照組相比，20、40 和 80 μmol/L的姜黃素明顯抑制SMMC-7721的增殖，且隨濃度的增大和時間的增加效果愈明顯。利用細胞計數法得到了同樣的結果，如圖1B所示。為了防止藥物的細胞毒性作用，后續試驗姜黃素的濃度宜采用40 μmol/L，處理時間48 h。

圖1 姜黃素對人肝癌細胞SMMC-7721增殖的影響Fig.1 Effect of curcumin on proliferation of SMMC-7721 cells

2.2 姜黃素可誘導人肝癌細胞SMMC-7721凋亡

流式細胞術檢測發現，40 μmol/L的姜黃素作用于人肝癌細胞48 h后，與正常對照組Control相比，在實相圖上出現典型性細胞亞二倍體凋亡峰，細胞凋亡率為32.59%，明顯高于對照組的凋亡率1.89%，結果見表1和圖2。

表1 姜黃素對SMMC-7721細胞凋亡的影響 (n=6，means±SD)Table 1 Effect of curcumin on apoptosis of SMMC-7721 cells(n=6，means±SD)

圖2 姜黃素對人肝癌細胞SMMC-7721細胞凋亡的影響Fig.2 Effect of curcumin on apoptosis of SMMC-7721 cells

2.3 姜黃素可抑制人肝癌細胞SMMC-7721抗凋亡蛋白Bcl-2和Survivin的表達，誘導促凋亡蛋白Bax的表達

為了明確姜黃素誘導人肝癌SMMC-7721細胞凋亡的機制，用40 μmol/L的姜黃素分別處理細胞12 h、24 h、48 h、72 h 后提取總 RNA 和蛋白，檢測SMMC-7721中凋亡相關蛋白基因的表達。RT-PCR檢測結果顯示隨著姜黃素作用時間的延長SMMC-7721細胞的抗凋亡蛋白Bcl-2和Survivin的表達量逐漸減少;而促凋亡蛋白Bax的表達逐漸增加，如圖3A所示，Western blot檢測結果與RT-PCR一致，如圖3B所示。表明，姜黃素誘導SMMC-7721細胞凋亡可能與上調Bax的表達、下調Bcl-2和Survivin的表達有關。

圖3 姜黃素對人肝癌細胞SMMC-7721細胞中Bcl-2、Survivin和Bax表達的影響Fig.3 Effect of curcumin on expression of Bcl-2，Survivin and Bax in SMMC-7721cells

2.4 姜黃素可誘導人肝癌細胞SMMC-7721中Caspase-3活性增強

用40 μmol/L的姜黃素分別處理細胞12、24、48、72 h后，Western blot檢測促凋亡蛋白Caspase 3的表達及活性的變化。隨著姜黃素作用時間的延長，24 h后Caspase 3蛋白的表達量顯著提高，而其剪切后的活化型Caspase 3(p17亞基)的表達量48 h后顯著上升，結果見圖4。提示，姜黃素誘導人肝癌SMMC-7721細胞凋亡可能與增強Caspase 3活性增強有關。

圖4 姜黃素對人肝癌細胞SMMC-7721細胞中Caspase 3表達的影響Fig.4 Effect of curcumin on the expression of Caspase 3 in SMMC-7721cells

2.5 姜黃素激活人肝癌細胞SMMC-7721中JNK，抑制ERK和p38 MAPK信號通路

為了考察姜黃素誘導人肝癌細胞SMMC-7721凋亡的信號通路，用姜黃素處理培養的SMMC-7721細胞，觀察 MAPK信號通路三個主要成員，即ERK1/2、JNK、p38 MAPK 的變化。用 Western blot的方法檢測姜黃素處理后三個信號轉導蛋白的磷酸化水平變化。結果顯示，當40 μmol/L姜黃素作用于SMMC-7721細胞24 h后，JNK的磷酸化開始升高，48 h后明顯升高。ERK和p38 MAPK的磷酸化水平48 h后降低明顯，見圖5。表明，姜黃素可以激活人肝癌細胞SMMC-7721中的JNK信號通路、抑制ERK和p38 MAPK信號通路。

圖5 姜黃素對人肝癌細胞SMMC-7721細胞中MAPK信號通路的影響Fig.5 Effect of curcumin on MAPK pathway activity in SMMC-7721cells

2.6 姜黃素通過JNK，ERK和p38 MAPK信號通路影響人肝癌細胞SMMC-7721中Bax、Caspase 3、Bcl-2和Survivin的表達

為了驗證姜黃素激活SMMC-7721細胞中JNK、抑制ERK和p38 MAPK信號通路與上調Bax和Caspase 3的表達、下調Bcl-2和Survivin的表達有關，分別檢測用JNK、ERK、p38 MAPK信號通路抑制劑SP600125、PD98059和SB203580對姜黃素處理SMMC-7721細胞后上述蛋白的表達。結果顯示，加入抑制PD98059和SB203580后，進一步上調了Bax的表達、下調了Bcl-2和Survivin的表達(圖6A、B)，其中，兩種抑制劑引起的不同效應是PD98059的加入并沒有顯著提升Caspase 3的活性。加入抑制劑SP600125后，下調了姜黃素誘導的Bax和Caspase 3的表達、上調了姜黃素抑制的Bcl-2和Survivin的表達(圖6C)。結果提示，JNK、ERK和p38 MAPK均可介導姜黃素對人肝癌細胞SMMC-7721中Bax、Caspase 3、Bcl-2和Survivin的表達。

圖6 MAPK抑制劑在姜黃素對人肝癌細胞SMMC-7721細胞中Bcl-2、Survivin、Bax和活性Caspase 3表達的影響Fig.6 Effect of MAPK inhibitor on the expression of Bcl-2，Survivin and Bax in SMMC-7721cells with curcumin

2.7 姜黃素通過JNK，ERK和p38 MAPK信號通路影響人肝癌細胞SMMC-7721凋亡

為了證明姜黃素激活JNK、抑制ERK和p38 MAPK信號通路與人肝癌SMMC-7721細胞凋亡有關，用信號通路抑制劑 SP600125、PD98059和SB203580處理細胞后流式細胞儀檢測細胞的凋亡。如圖7所示，阻斷ERK和p38 MAPK信號通路后，與單純姜黃素誘導條件下相比(圖7B)，細胞的凋亡率進一步上升(圖7C、D)。阻斷JNK信號通路后，細胞的凋亡率比單純姜黃素誘導條件下有所下降(圖7E)。柱形圖顯示各組的凋亡率。以上結果表明，JNK、ERK和p38 MAPK信號通路參與介導了姜黃素誘導的人肝癌SMMC-7721細胞的凋亡。

圖7 MAPK抑制劑在姜黃素對人肝癌細胞SMMC-7721細胞凋亡的影響Fig.7 Effect of MAPK inhibitor on SMMC-7721 cells apoptosis with curcumin

3 討論

姜黃素可以抑制多種癌細胞的增殖并誘導凋亡，其機制多與姜黃素多與增強Caspase的活性，干擾腫瘤細胞的細胞周期，調節凋亡相關蛋白的表達以誘導細胞凋亡有關。而姜黃素對于人肝癌細胞SMMC-7721的作用，以往的研究表明姜黃素可以抑制增殖并誘導凋亡，已發現機制為姜黃素作用于肝癌細胞后產生H2O2，H2O2損傷細胞線粒體并與膜電位降低有關，從而通過線粒體途徑誘導細胞凋亡［4］。姜黃素誘導人肝癌SMMC-7721細胞凋亡還與調節表達的Bax/bcl-2蛋白比例有關［5］。最近研究表明MAPK的活化也是諸多抗癌藥引起腫瘤細胞凋亡必需的，ERK MAPK由生長因子所活化，對細胞的增殖和存活起著關鍵作用，抑制ERK的活性可以下調細胞中c-myc的表達而促進細胞凋亡。目前普遍認為p38 MAPK可以通過增強c-myc、Bax、Fas、Caspase 3等蛋白的表達、磷酸化p53、參與Fas/FasL介導的凋亡、激活c-jun和c-fos、誘導Bax轉位等途徑導致細胞發生凋亡。而JNK MAPK促進凋亡的機制與增強Fas表達、調控Bcl-2的表達、改變細胞內Ca2+環境和激活Caspase家族有關。以上表明，ERK、p38和JNK三組MAPK家族與癌細胞的凋亡密切相關［6］。本研究考察姜黃素作用于人肝癌細胞SMMC-7721后MAPK信號通路在細胞凋亡中的作用。研究發現，姜黃素作用于人肝癌細胞SMMC-7721后，細胞的增殖受到抑制，細胞出現明顯的凋亡，Bax、Caspase 3的表達明顯增加而Bcl-2和Survivin的表達明顯減少。研究中還發現，姜黃素可以激活人肝癌細胞SMMC-7721的JNK信號通路、抑制ERK和p38 MAPK信號通路，阻斷這些信號通路后Bax、Caspase 3、Bcl-2和Survivin的表達發生變化。表明通過 MAPK信號通路上調 Bax、Caspase 3的表達和下調Survivin、Bcl-2的表達是姜黃素誘導肝癌細胞凋亡的重要機制之一。

本文的研究中發現，與以前的報道相似的是姜黃素的作用并沒有明顯改變人肝癌細胞SMMC-7721的細胞周期，也沒有引起細胞周期阻滯作用［7］。至于姜黃素是具有作用于其他腫瘤細胞，能夠增強腫瘤細胞周期蛋白依賴激酶(CDK)的表達并抑制p21、p27和 p53等的表達的功能［8］，有待于進一步考察。

在不同類型的細胞凋亡過程中，Caspase-3是細胞色素C下游的靶標激活物，激活Caspase-3是線粒體-細胞色素C-細胞凋亡途徑中的關鍵步驟［9］。本實驗中還發現，JNK和p38 MAPK信號通路與Caspase-3的活化有關，而ERK信號通路的阻斷沒有引起Caspase 3活性的明顯變化。推測可能是JNK和p38 MAPK信號通路與線粒體途徑有著共同的通路最終導致凋亡的發生。本實驗顯示姜黃素可以通過MAPK信號通路發揮誘導肝癌細胞凋亡的作用，在治療肝癌方面表現出良好的應用前景，這為姜黃素的臨床應用提供了更多的理論依據。

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