HPLC法測定雙氫青蒿素哌喹片中的磷酸哌喹含量

郭毅新，張元杰，丁 濤，來國防

(1.云南省食品藥品檢驗所，云南昆明650011;2.永城職業(yè)學院，河南永城476600)

雙氫青蒿素哌喹片是雙氫青蒿素與磷酸哌喹組成的復方劑型，本品種臨床定位適用于各種類型瘧疾，為目前國際上最有效的抗瘧藥之一。為保障用藥安全，全面評價該藥品質量，2012年度被列入國家評價性抽樣品種。現(xiàn)行標準采用紫外－分光光度法測定其含量，由于紫外－分光光度法測定易受外界干擾，造成測定結果不準確。本文參考相關文獻［1～5］，采用高效液相色譜方法，考察了不同填料色譜柱，不同流動相對磷酸哌喹的分離行為，并對優(yōu)選出的高效液相色譜測定磷酸哌喹方法進行了方法學考察及樣品的測定，結果該方法操作方便，色譜峰對稱性好，測定結果重現(xiàn)性好，能有效控制本產(chǎn)品的質量。

1 儀器與試藥

Waters 2695高效液相色譜儀(美國沃特世公司);AL204型電子天平(Mettler Toledo)。磷酸哌喹對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號:10751－200501，純度 91.2%)，乙腈為色譜純，水為二次蒸餾水，三氯乙酸、磷酸為分析純。雙氫青蒿素哌喹片(規(guī)格:每片含雙氫青蒿素40 mg，磷酸哌喹0.32 g，重慶市某制藥公司提供)。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 色譜柱Watres Symmetry RP18(4.6 mm ×150 mm，5 μm);流動相:乙腈 －0.1% 三氯乙酸 － 磷酸(19∶81∶0.035)，檢測波長:349 nm;柱溫:30 ℃;流速:1.0 mL·min－1;進樣量:20 μL。

圖1 對照品圖譜

圖2 樣品圖譜中磷酸哌喹

2.2 供試品溶液的制備 取本品10片，研細，混勻，取8 mg，精密稱定，置10 mL容量中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過，精密量取濾液3 mL置100 mL量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.3 對照品溶液制備 精密稱取磷酸哌喹對照品適量，加流動相制成每1 mL含磷酸哌喹15 μg的溶液，即得。

2.4 線性關系考察 精密稱取磷酸哌喹對照品5.57 mg，至10 mL容量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取3 mL至100 mL量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液，精密量取5、10、20、40、60 μL 注入液相色譜儀，進行測定，以峰面積的積分值為縱坐標，質量濃度為橫坐標，繪制標準曲線，并以最小二乘法計算得回歸方程:磷酸哌喹:Y=5.049 817×107X－1.839 466×104，在0.003 81～0.038 1 mg·mL－1(r=0.999 9)呈良好線性關系。

2.5 重復性試驗 取雙氫青蒿素哌喹片(批號:011011)供試品6份，照“2.2”項下方法制備供試品溶液，進樣20 μL，供試品中磷酸哌喹的含量分別為:0.337、0.336、0.338、0.336、0.337、0.336 g/片。

2.6 穩(wěn)定性試驗 取供試品溶液于室溫(20～25℃)下放置，分別于0、2、4、6、8 h 精密吸取 20 μL 進樣，測定磷酸哌喹的峰面積，6針峰面積RSD為0.9%，結果顯示供試品溶液在8 h內基本穩(wěn)定。

2.7 回收率試驗 取雙氫青蒿素哌喹片細粉4 mg(批號:011011)9份，精密稱定，分別按其質量分數(shù)的80%、100%、120%精密加入磷酸哌喹對照品適量，按“2.2”項下的方法制備供試品溶液，進行測定，計算加樣回收率，結果見表1。

表1 回收率試驗結果

2.8 樣品測定 取本品3批，照“2.2”項下方法制備供試品溶液，進樣20 μL，按上述色譜條件測定，以外標法(峰面積)計算樣品中磷酸哌喹的含量，結果見表2。

表2 樣品含量測定結果(n=2)

3 討論

3.1 色譜柱的考察 考慮到磷酸哌喹為生物堿鹽，極性較大，在一般色譜條件下，保留時間較短。參考相關文獻選擇氰基柱，以0.04 mol·L－1磷酸二氫鉀溶液(稀鹽酸調pH 2.5)－乙腈(90∶10)為流動相進行分離，結果色譜峰仍有一定的拖尾，隨著磷酸哌喹濃度的增加，拖尾現(xiàn)象加重。

3.2 流動相考察 曾采用乙腈－磷酸二氫鉀，甲醇－磷酸緩沖鹽，甲醇－十二烷基磺酸鈉，乙腈－水(11∶89，每 100 mL 水含三氟乙酸 50 μL，磷酸 40 μL，三乙胺 50 μL)，0.04 mol·L－1磷酸二氫鉀 － 乙腈 －三乙胺(90∶10∶0.2，用磷酸調節(jié) pH 至2.5)等溶液體系為流動相，但均因磷酸哌喹峰拖尾嚴重，無法準確定量。

3.3 經(jīng)過反復試驗，選擇一般C18色譜柱，以乙腈－0.1%三氯乙酸 － 磷酸(19∶81∶0.035)為流動相，色譜峰保留時間合適，峰對稱性好，可以準確定量。

［1］朱凱，范琦，張小松，等.HPLC測定雙氫青蒿素哌喹片中磷酸哌喹的含量［J］.中國藥學雜志，2008，43(9):713－714.

［2］李美琴，范琦，張曉松.HPLC同時測定復方雙氫青蒿素片中磷酸哌喹與甲氧芐啶的含量［J］.華西藥學雜志，2004，19(3):221 －223.

［3］張小松，江生，毛慶.磷酸哌喹有關物質的檢測研究［J］.中國藥事，2009，23(7):690 －691.

［4］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典2010年版(二部)［S］.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010.

［5］木書林，丁濤，來國防，等.項空氣相色譜法測定雙氫青蒿素哌喹片中乙醇殘留含量［J］.藥學研究，2013，32(9):504－506.