動態濁度法測定人參多糖注射液中細菌內毒素的含量

張 娟，祝清芬，范治云

(山東省食品藥品檢驗所，山東濟南250101)

人參多糖注射液是從人參中提取出來的免疫增強劑，主要成分是人參多糖，人參多糖能刺激機體的體液免疫和細胞免疫功能，對S－180、ESA和u－14等動物移植腫瘤均有明顯的抑制作用，增強患者的自身免疫力、提高放化療期間的生存質量，且能降低環磷酰胺對骨髓和免疫功能的抑制作用。對腫瘤的放射治療具有輔助作用［1～3］。其在臨床應用廣泛，用量較大。中藥的安全性問題直接影響中醫臨床療效，為確保患者的用藥安全和醫療安全，細菌內毒素檢查法是控制藥物注射劑的重要的安全性指標［4］。本研究通過動態濁度法定量檢測人參多糖注射液細菌內毒素含量，建立人參多糖注射液中細菌內毒素定量分析的方法。

1 實驗材料

1.1 試劑與試藥 人參多糖注射液(國內一企業生產，批號:20111205、20111206、20111207，規格:4 mL∶12 mg);細菌內毒素工作標準品(中國食品藥品檢定研究院，批號:150601－201174，160 EU/支);細菌內毒素檢查用水(BET水，湛江安度斯生物有限公司，批號:1209030，5 mL/支);動態濁度法鱟試劑(湛江安度斯生物有限公司，批號:1301212，可測內毒素范圍0.01 ～10 EU·mL－1，規格 1.25 mL，有效期2015/12)。

1.2 儀器 BET－48G細菌內毒素測定儀，天大天發科技有限公司生產;ZH－2型自動漩渦混合器，天津藥典標準儀器廠;試驗用試管、刻度吸管等玻璃器材按規定清洗，250℃干烤1 h除去外源性內毒素。

2 方法與結果［5，6］

2.1 細菌內毒素檢查法限值(L)的計算 按《中國藥典》2010年版(一部)附錄ⅩⅢD細菌內毒素檢查法項下，內毒素限值的確定的要求，一般按以下公式確定:L=K/M，式中L為供試品的細菌內毒素限值。注射劑K=5 EU·kg－1·h－1。根據人參多糖注射液說明書，本品靜脈滴注，一次8 mL(2支)，一日1次。或遵醫囑。加入100～250 mL氯化鈉注射液中靜脈滴注。成人體重以60 kg計，可得M為0.4 mg·kg－1·h－1，即 L 為 12.5 EU·mg－1。因為此藥用于減輕腫瘤放、化療引起的副作用，亦可作為腫瘤治療的輔助用藥，為保障安全用藥，對于抗感染、抗腫瘤、治療心血管疾病等重癥用的藥品，可根據計算值適當調整，嚴格至計算限值的1/2或1/3。本品的限值設為每1 mg半乳糖醛酸中含內毒素應小于6 EU。

2.2 細菌內毒素標準曲線的建立和可靠性分析設定標準曲線各點濃度為2.0、0.5、0.125、0.031 25 EU·mL－1。用BET水將細菌內毒素標準品進行稀釋，使其最終細菌內毒素濃度分別為 2.0、0.5、0.125、0.031 25 EU·mL－1，各取 0.1 mL，分別加到預先加有0.1 mL鱟試劑的反應管內，混合均勻，插入BET－48G型細菌內毒素檢測儀內進行檢測，每一濃度重復3管，同時做陰性對照(NC)。以平均反應時間的對數(lgT)為縱坐標，內毒素濃度的對數(LgC)為橫坐標，繪制標準曲線。標準曲線回歸方程為LgT=－0.236 9 LgC+2.812 3，相關系數r=－0.998 9(絕對值應大于0.980)，平行管之間的RSD均小于10%，陰性對照的反應時間大于標準曲線最低濃度的反應時間，細菌內毒素標準曲線成立，結果見表1。

表1 細菌內毒素標準曲線及可靠性分析(n=3)

2.3 供試品最大可稀釋倍數的確定 本品細菌內毒素限值(L)為6 EU·mg－1，標準曲線最低濃度(λ1)為 0.031 25 EU·mL－1，供試品的 MVD=CL/λ1=(3 mg·mL－1×6 EU·mg－1)/0.031 25 EU·mL－1=576倍。

2.4 干擾試驗 根據標準曲線內毒素濃度的設置，選擇 0.25 EU·mL－1作為 λm。選擇批號為20111205的人參多糖注射液，用BET水將供試品分別稀釋為 18、36、72、144倍，作為供試品溶液(A液)，同時制備含上述供試品濃度并含內毒素濃度為λm(0.25 EU·mL－1)的溶液(B液)，分別取上述各液0.1 mL，加到預先加有0.1 mL鱟試劑的反應管內，混合均勻，插入儀器內進行測定，每個濃度重復2管。測定結束后，按標準曲線回歸方程分別計算出供試品溶液和含標準內毒素λm的供試品溶液的內毒素含量，并計算該試驗條件下的回收率(R)。

稀釋36倍及以下時，回收率均在50～200%，符合要求，因此建議采用36倍以上的稀釋液進行試驗。

另取批號為20111206、20111207兩批樣品，分別制備36倍供試品稀釋液(A液)和含相同供試品濃度且含內毒素濃度λm(0.25 EU·mL－1)的溶液(B液)，依法檢查，B液回收率均在50% ～200%，符合要求，結果見表2。

表2 供試品干擾試驗及供試品細菌內毒素測定(n=2)

2.5 供試品定量檢查 供試品檢查同“2.4”項下方法，根據標準曲線計算樣品的內毒素含量，3批樣品的內毒素含量均符合規定，結果見表2。

3 討論

細菌內毒素檢查法是利用鱟試劑來檢測或量化革蘭陰性菌產生的內毒素，以判斷供試品中細菌內毒素的限量是否符合規定的一種方法。隨著鱟試驗方法的測定儀器的不斷完善，內毒素測定已向微量定量方向發展。動態濁度法是最常用的定量測定方法之一，通過測定反應溶液達到規定濁度所需時間或測定溶液自身的濁度變化率定量測定樣品中內毒素含量。其克服了凝膠法檢驗結果只能判斷產品的內毒素含量是否超標，而無法給出準確的含量的不足，具有操作簡便、結果準確、檢測靈敏度高、減少人為誤差，幫助分析干擾情況和可以觀察反應過程等優點［7］。定量測定在常規藥品檢查、生產過程質控、各種除熱原方法的評價、特殊樣品的檢查(如血液、尿液、腦脊液)等方面。動態濁度法有快速、大范圍定量的特性，使干擾實驗在一兩次實驗后完成，節約成本，更適合于成分復雜，干擾大的中藥注射劑的內毒素檢測。

中藥多糖注射液因其療效顯著在臨床上得到越來越多的應用，但是與一般小分子中藥注射劑不同的是，大分子的中藥多糖注射液由于結構的復雜性使其在質量控制和安全性等方面存在著較大的風險［8］。不合格的供試品在臨床應用時可能產生熱原反應而造成嚴重的不良后果。我國藥典規定，靜脈用注射劑，應設細菌內毒素(或熱原)檢查項［5］。

本文采用動態濁度法對人參多糖注射液中細菌內毒素進行了檢測，試驗結果表明，樣品經36倍稀釋時即對試驗無干擾作用，3批樣品檢查結果符合規定。因此，用動態濁度法來檢測人參多糖注射液中細菌內毒素含量的方法是可行的。

［1］莫小為，徐萌，路安惠，等.不合理使用人參多糖注射液分析［J］.中國醫院藥學雜志，2009，29(12):1043－1044.

［2］馮青.人參多糖注射液配合化療治療晚期非小細胞肺癌80 例［J］.陜西中醫，2009，30(12):1572.

［3］鄭興斌.人參多糖注射液在直腸癌患者化療中的作用研究［J］.中國藥房，2009，20(18):1425 －1427.

［4］蔡彤，張國來，李波，等.84種注射用藥品細菌內毒素檢查法的方法學研究［J］.中國藥學雜志，2010，45(2):150－155.

［5］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典2010年版(一部)［S］.北京:中國醫藥科技出版社，2010:附錄88，附錄131.

［6］中國藥品生物制品檢定所.中國藥品檢驗標準操作規范(2010年版)［S］.北京:中國醫藥科技出版社，2010:310－325.

［7］王莉蓓，陳華龍，姜麗君.動態濁度法定量檢測血栓通注射液中細菌內毒素［J］.齊魯藥事，2011，30(1):27－28.

［8］萬琴，簫偉，王振中，等.市售不同廠家人參多糖注射液的質量評價［J］.中國中藥雜志，2013，38(5):683－685.