貴州省銅仁地區豬鏈球菌2型的分子流行病學分析

朱鋒釗　杜秀園　高俊波　李秀富

摘要：通過菌株分離培養、生化鑒定分析了貴州省銅仁地區各屠宰場收集的150份豬扁桃體樣本，并用PCR方法對豬鏈球菌2型的主要致病毒力因子進行了檢測。結果表明，150例樣本中豬鏈球菌2型帶菌率達到41.3%，其中屠宰場3的檢出率較高，mrp、epf片段與陽性對照相關基因的同源性達到100%，屠宰場3的所有樣本mrp、epf毒力因子均表現為陽性。說明該地區豬群豬鏈球菌2型攜帶率較高， mrp、epf毒性因子陽性表現型與疫病的流行可能存在一定的關聯性。

關鍵詞：豬鏈球菌；多重PCR；分子流行病學；貴州銅仁

中圖分類號：S858.28 文獻標識碼：A 文章編號：1007-273X（2014）08-0011-02

豬鏈球菌是一種重要的人畜共患病原菌，通常存在于豬的上呼吸道。其中以豬鏈球菌2型致病性最強，可以導致斷奶豬仔發生腦膜炎、關節炎、敗血癥等疾病，并可能造成人類感染致死[1，2]。隨著我國養豬業的不斷發展，豬鏈球菌的發病率不斷升高，對該產業造成了極大的經濟損失，相關從業人員的健康安全也受到極大威脅。本研究對貴州省銅仁地區的豬群豬鏈球菌2型進行了分子流行病學分析，現將結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料采集和菌株培養

從貴州省銅仁地區各屠宰場收集來源明確的豬扁桃體共計150份。將各個扁桃體樣品培養分離得到單個菌落，接種于馬丁肉湯中（葡萄糖含量0.2%、小牛血清1%），于37.5 ℃下培養20 h。

1.2 菌株鑒定

對可疑菌落革蘭染色后進行鏡檢，對于確定為革蘭氏陽性鏈球菌的菌落進行過氧化氫酶實驗，結果為陰性者初步確定為豬鏈球菌2型，進行進一步的生化鑒定：將確定菌落分別接種于5%蔗糖、麥芽糖、葡萄糖、乳糖、D-核糖等培養基中，24 h后觀察記錄并分檢出為豬鏈球菌2型的菌株，用于后續試驗。

1.3 DNA提取

取細菌培養物1.5 mL，10 000r/min離心1 min，將沉淀物通過567μLTE緩沖液進行重懸，加入10%SDS30 μL、20mg/mL蛋白酶K3 μL，在37 ℃下水浴60 min；然后加入5mol/L NaCl溶液100μL、CTAB/NaCl溶液80μL，在65℃下水浴10 min。使用24：1的氯仿-異戊醇溶液進行抽提，然后用25：24：1的酚-氯仿-異戊醇溶液再次抽提，最后使用等體積異丙醇對核酸進行沉淀。沉淀物用70%的乙醇清洗兩次，后溶于20μL雙蒸水中備用。

1.4 分型PCR擴增和毒力因子檢測

對菌株DNA的cps2J、mrp、epf基因片段進行PCR擴增。在95 ℃下進行5 min預變性，后在95 ℃下變性40 s（退火時間和退火溫度等見表1）。其后在72 ℃下延伸30 s，循環30次后同溫度下再延伸10 min。取8μL的擴增產物，在130 V電壓下于1.5%瓊脂凝膠中進行電泳。后取條帶清晰的擴增

摘要：通過菌株分離培養、生化鑒定分析了貴州省銅仁地區各屠宰場收集的150份豬扁桃體樣本，并用PCR方法對豬鏈球菌2型的主要致病毒力因子進行了檢測。結果表明，150例樣本中豬鏈球菌2型帶菌率達到41.3%，其中屠宰場3的檢出率較高，mrp、epf片段與陽性對照相關基因的同源性達到100%，屠宰場3的所有樣本mrp、epf毒力因子均表現為陽性。說明該地區豬群豬鏈球菌2型攜帶率較高， mrp、epf毒性因子陽性表現型與疫病的流行可能存在一定的關聯性。

關鍵詞：豬鏈球菌；多重PCR；分子流行病學；貴州銅仁

中圖分類號：S858.28 文獻標識碼：A 文章編號：1007-273X（2014）08-0011-02

豬鏈球菌是一種重要的人畜共患病原菌，通常存在于豬的上呼吸道。其中以豬鏈球菌2型致病性最強，可以導致斷奶豬仔發生腦膜炎、關節炎、敗血癥等疾病，并可能造成人類感染致死[1，2]。隨著我國養豬業的不斷發展，豬鏈球菌的發病率不斷升高，對該產業造成了極大的經濟損失，相關從業人員的健康安全也受到極大威脅。本研究對貴州省銅仁地區的豬群豬鏈球菌2型進行了分子流行病學分析，現將結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料采集和菌株培養

從貴州省銅仁地區各屠宰場收集來源明確的豬扁桃體共計150份。將各個扁桃體樣品培養分離得到單個菌落，接種于馬丁肉湯中（葡萄糖含量0.2%、小牛血清1%），于37.5 ℃下培養20 h。

1.2 菌株鑒定

對可疑菌落革蘭染色后進行鏡檢，對于確定為革蘭氏陽性鏈球菌的菌落進行過氧化氫酶實驗，結果為陰性者初步確定為豬鏈球菌2型，進行進一步的生化鑒定：將確定菌落分別接種于5%蔗糖、麥芽糖、葡萄糖、乳糖、D-核糖等培養基中，24 h后觀察記錄并分檢出為豬鏈球菌2型的菌株，用于后續試驗。

1.3 DNA提取

取細菌培養物1.5 mL，10 000r/min離心1 min，將沉淀物通過567μLTE緩沖液進行重懸，加入10%SDS30 μL、20mg/mL蛋白酶K3 μL，在37 ℃下水浴60 min；然后加入5mol/L NaCl溶液100μL、CTAB/NaCl溶液80μL，在65℃下水浴10 min。使用24：1的氯仿-異戊醇溶液進行抽提，然后用25：24：1的酚-氯仿-異戊醇溶液再次抽提，最后使用等體積異丙醇對核酸進行沉淀。沉淀物用70%的乙醇清洗兩次，后溶于20μL雙蒸水中備用。

1.4 分型PCR擴增和毒力因子檢測

對菌株DNA的cps2J、mrp、epf基因片段進行PCR擴增。在95 ℃下進行5 min預變性，后在95 ℃下變性40 s（退火時間和退火溫度等見表1）。其后在72 ℃下延伸30 s，循環30次后同溫度下再延伸10 min。取8μL的擴增產物，在130 V電壓下于1.5%瓊脂凝膠中進行電泳。后取條帶清晰的擴增

摘要：通過菌株分離培養、生化鑒定分析了貴州省銅仁地區各屠宰場收集的150份豬扁桃體樣本，并用PCR方法對豬鏈球菌2型的主要致病毒力因子進行了檢測。結果表明，150例樣本中豬鏈球菌2型帶菌率達到41.3%，其中屠宰場3的檢出率較高，mrp、epf片段與陽性對照相關基因的同源性達到100%，屠宰場3的所有樣本mrp、epf毒力因子均表現為陽性。說明該地區豬群豬鏈球菌2型攜帶率較高， mrp、epf毒性因子陽性表現型與疫病的流行可能存在一定的關聯性。

關鍵詞：豬鏈球菌；多重PCR；分子流行病學；貴州銅仁

中圖分類號：S858.28 文獻標識碼：A 文章編號：1007-273X（2014）08-0011-02

豬鏈球菌是一種重要的人畜共患病原菌，通常存在于豬的上呼吸道。其中以豬鏈球菌2型致病性最強，可以導致斷奶豬仔發生腦膜炎、關節炎、敗血癥等疾病，并可能造成人類感染致死[1，2]。隨著我國養豬業的不斷發展，豬鏈球菌的發病率不斷升高，對該產業造成了極大的經濟損失，相關從業人員的健康安全也受到極大威脅。本研究對貴州省銅仁地區的豬群豬鏈球菌2型進行了分子流行病學分析，現將結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料采集和菌株培養

從貴州省銅仁地區各屠宰場收集來源明確的豬扁桃體共計150份。將各個扁桃體樣品培養分離得到單個菌落，接種于馬丁肉湯中（葡萄糖含量0.2%、小牛血清1%），于37.5 ℃下培養20 h。

1.2 菌株鑒定

對可疑菌落革蘭染色后進行鏡檢，對于確定為革蘭氏陽性鏈球菌的菌落進行過氧化氫酶實驗，結果為陰性者初步確定為豬鏈球菌2型，進行進一步的生化鑒定：將確定菌落分別接種于5%蔗糖、麥芽糖、葡萄糖、乳糖、D-核糖等培養基中，24 h后觀察記錄并分檢出為豬鏈球菌2型的菌株，用于后續試驗。

1.3 DNA提取

取細菌培養物1.5 mL，10 000r/min離心1 min，將沉淀物通過567μLTE緩沖液進行重懸，加入10%SDS30 μL、20mg/mL蛋白酶K3 μL，在37 ℃下水浴60 min；然后加入5mol/L NaCl溶液100μL、CTAB/NaCl溶液80μL，在65℃下水浴10 min。使用24：1的氯仿-異戊醇溶液進行抽提，然后用25：24：1的酚-氯仿-異戊醇溶液再次抽提，最后使用等體積異丙醇對核酸進行沉淀。沉淀物用70%的乙醇清洗兩次，后溶于20μL雙蒸水中備用。

1.4 分型PCR擴增和毒力因子檢測

對菌株DNA的cps2J、mrp、epf基因片段進行PCR擴增。在95 ℃下進行5 min預變性，后在95 ℃下變性40 s（退火時間和退火溫度等見表1）。其后在72 ℃下延伸30 s，循環30次后同溫度下再延伸10 min。取8μL的擴增產物，在130 V電壓下于1.5%瓊脂凝膠中進行電泳。后取條帶清晰的擴增