人脫細胞軟骨細胞外基質對異種軟骨種子細胞的影響

高鉞，劉舒云，黃靖香，郭維民，陳繼鳳，張莉，趙斌，彭江，汪愛媛，王玉，許文靜，盧世璧，郭全義

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人脫細胞軟骨細胞外基質對異種軟骨種子細胞的影響

高鉞，劉舒云，黃靖香，郭維民，陳繼鳳，張莉，趙斌，彭江，汪愛媛，王玉，許文靜，盧世璧，郭全義

100853 北京，中國人民解放軍總醫院骨科研究所

觀察人脫細胞軟骨細胞外基質（hACAM）對異種兔軟骨種子細胞增殖和表型的影響。

將差速梯度離心法制作的人脫細胞軟骨細胞外基質，配制成 0.5% 的漿料，分別鋪于 6 孔細胞培養板和 96 孔細胞培養板，形成 1 mm 厚的薄膜，以此培養板為實驗組?？瞻讓φ战M培養板僅使用單純培養液培養。在培養板上培養兔關節軟骨細胞。通過 hochest33258 染色驗證人軟骨細胞外基質脫細胞完全與否；分別在第 5、15 天兩個時間點，通過倒置顯微鏡、甲苯胺藍染色觀察兩種培養方法的兔軟骨細胞的生長形態、細胞表型和增殖情況，用 CCK-8 細胞增殖實驗比較兩種培養方法在第1、3、7、10 天的增殖情況。

通過 hochest33258 染色發現差速梯度離心的人軟骨細胞外基質脫細胞完全。通過倒置顯微鏡觀察第 5 和15 天的實驗組細胞增殖情況優于空白對照組，甲苯胺藍染色的結果也證明這個觀點；CCK-8 細胞增殖試驗顯示第 7 天 hACAM 組在細胞增殖方面明顯地優于單純培養液的對照組（= 0.0298），hACAM 組的軟骨細胞與空白組的軟骨細胞在第 10 天的增殖情況相比沒有統計學差異。

hACAM 免疫原性低，無細胞毒性，能夠很好地促進異種軟骨細胞的增殖。

細胞外基質； 軟骨； 軟骨細胞； 組織工程； 細胞增殖

關節軟骨損傷是臨床上常見的疾病，由于關節軟骨自我修復能力有限，目前的一些傳統方法尚無法獲得滿意的治療效果[1-2]。通過構建組織工程軟骨或骨軟骨復合體來修復軟骨缺損被認為是目前較有前景的治療手段。在組織工程研究領域，種子細胞、可降解的支架材料以及信號因子并稱為組織工程的三大基本要素，其中種子細胞在軟骨組織工程方法修復過程中起著至關重要的作用。軟骨細胞是軟骨組織工程最常用的種子細胞，但軟骨細胞增殖數量有限、體外培養易出現去分化等缺陷，是目前軟骨組織工程大量應用的瓶頸[1]。目前軟骨組織最常用的細胞外支架材料為人工合成材料：如聚羥基乙酸（polyglycolic acid，PGA）、聚乳酸（polylactic acid、PLA）等。但由于人工合成材料本身為異物，有可能導致過敏、感染等問題[2]。比起人工合成的支架材料，人脫細胞軟骨細胞外基質（human articular cartilage acellular matrix，hACAM）用優選的方法脫去了具有免疫原性的細胞，保留了大量對細胞黏附、增殖有利的蛋白多糖和 II 型膠原等，該基質在經過處理做成支架以后的力學性質與天然的軟骨也很相近[3]，而且還具有能提供對細胞黏附有益的信號分子[4]。有實驗研究證實脫細胞耳軟骨基質可以促進同種耳軟骨種子細胞增殖，而且可以修復耳軟骨缺損[5-6]，因此，我們認為人關節軟骨的 hACAM 也能對兔軟骨種子細胞增殖和表型維持起到一定的作用，本實驗的目的在于探索 hACAM 對異種軟骨種子細胞的影響[7]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑和儀器 小鼠抗人II型膠原蛋白抗體購自北京世安科興科技公司；BCPCAS 4800 型掃描電子顯微鏡、低溫高速離心機為美國貝克曼公司產品；IX70-121 型熒光顯微鏡為日本 Olympus 公司產品；H-DMEM 培養基分別為美國 Hyclone 和 Gibco 公司產品；胰蛋白酶、胎牛血清（FBS）為美國 Gibco 公司產品，0.2% 的II型膠原酶為美國 Sigma 公司產品；II型膠原抗體（SC-28887）、“三抗體”（青霉素、鏈霉素、兩性霉素）購自上海碧云天生物技術研究所；Gen5 酶標儀為美國BioTek 公司產品；CCK-8 為美國 Sigma-Aldrich 公司產品。

1.1.2 實驗動物 雄性新西蘭白兔，4 月齡，2.5 kg，解放軍總醫院實驗動物中心提供。所有動物實驗方案均經解放軍總醫院倫理委員會批準。

1.1.3 軟骨組織 人軟骨取自關節置換的正常軟骨部分。

1.2 方法

1.2.1 hACAM 的制備及培養板的包被 采用改良脫細胞方法[8-9]，雙氧水漂洗軟骨組織，將其切成片狀后以無菌 PBS 溶液漂洗，用勻漿機制成懸浮的漿料，分離大顆粒的懸浮微粒，將懸浮微粒多次、不同轉速離心，獲得 hACAM。將 hACAM 稀釋至 0.5%（W/V）鋪于試驗組細胞培養板上，酒精固定后，用 PBS 清洗，風干，于 4 ℃保存。實驗組和空白對照組的細胞培養板分別有兩種，一種底部沒有鋪蓋玻片，另一種底部鋪有蓋玻片，方便以后的染色。hACAM 包被的培養板在使用前用 PBS 洗滌 2 次[10]。

1.2.2 軟骨細胞分離培養 無菌打開 4 月齡新西蘭兔軟骨的膝關節和肩關節，用尖刀削下關節軟骨，置于培養皿中，PBS 洗滌 2 次，每次 2 min，棄去上清液。用眼科剪將軟骨塊剪至極小塊之后加入II型膠原酶，用吸管充分吹打混勻后，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的培養箱中消化 2 h（隔 30 min 用移液器吹打 1 次，每次持續 1 min）；加入 8 ml 含10% FBS 的 H-DMEM 培養液終止消化，充分吹打混勻后收集至 15 ml 的離心管中，以599 ×離心 5 min，棄上清，加入 7 ml 培養液，充分吹打混勻，取混懸液分至培養瓶中，置培養箱培養[11-12]。24 h 后進行首次換液，此后隔日換液。顯微鏡下觀察細胞生長情況，當細胞生長面積達到培養瓶底部的 70% ~ 80% 后，用胰蛋白酶消化細胞，進行傳代培養。用第二代（P2）的兔關節軟骨細胞接種到實驗組和空白對照組的培養板上。

1.2.3 形態學和組織學染色

⑴甲苯胺藍染色：將分離出來的 P2 兔關節軟骨細胞和分別在 hACAM 組和空白對照組的兔關節軟骨細胞用 PBS 洗 2 次，每次 5 min，10% 甲醛固定 15 min，然后用 PBS 洗滌 2 次，每次5 min，室溫下加 1% 甲苯胺藍染色，37 ℃孵育2 h；去除多余的染料，PBS 洗 2 次，每次 5 min。倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照。

⑵番紅 O 染色：將脫細胞后的 hACAM 涂在載玻片上，酒精固定，三蒸水清洗后，Weigert 蘇木精染色 3 min，自來水沖洗，在酸性酒精（加入 1%鹽酸的 70%酒精）中使之分化 15 s，自來水沖洗 3 min，在 0.02%堿性孔雀綠水溶液中染色3 min，在 1%的醋酸中快速漂洗，載玻片引流，在 0.1% 的番紅 O 水溶液中染色 3 min，95%酒精沖洗，脫水，清理，封片觀察。

⑶II型膠原免疫組化染色：將兔關節軟骨上分離出來的軟骨細胞用多聚甲醛固定漂洗后晾干，3% 的雙氧水室溫孵育 10 min，以消除內源性過氧化物酶活性，PBS 漂洗 3 次，每次 5 min，棄封閉液，滴加 1:100 的II型膠原抗體，4 ℃過夜，PBS 漂洗 3 次，每次 5 min，然后加入生物標記的二抗，37 ℃孵育30 min，PBS 漂洗 3 次，每次 5 min，DAB/雙氧水顯色，蘇木素復染，常規封片照相。

1.2.4 掃描電鏡觀察 將種植有兔軟骨種子細胞的細胞外基質（extracellular matrix，ECM），用緩沖液漂洗，3% 戊二醛固定 2 h 以上，0.1 mol/L 磷酸緩沖液漂洗 3 次，每次 15 min，1% 鋨酸固定2 h，采用 50%、70%、80%、90%、95% 的酒精各 15 min 梯度脫水，然后換醋酸異戊酯脫水 15 min，冷凍干燥，鍍膜，把標本置于掃描電鏡下面觀察。

1.2.5 CCK-8 細胞增殖試驗 將兔軟骨細胞接種到 hACAM 鋪板的 96 孔平板上（2 × 103個/孔），每個時間點每個樣品 7 個孔，用軟骨細胞培養液培養，并于第 1、3、7、10 天進行檢測。每孔加入 10 μl CCK-8，37 ℃孵育 2 h，使用空白培養板作對照，測量在 492 nm 處的值，進行統計學分析[13-14]。

1.3 統計學處理

2 結果

2.1 細胞形態及活性檢測

對差速梯度離心脫細胞前后的 hACAM 進行hochest33258 染色，結果顯示脫細胞完全（圖1）。組織學染色發現 hACAM 中含大量糖胺多糖、透明質酸，證明在差速梯度離心脫細胞中去除免疫原性的同時保留了多種軟骨細胞外基質的成分（圖 2）。通過電鏡觀察（圖 3），鋪在 6 孔板的 hACAM 質地均一，膠原含量豐富。分離的兔關節軟骨原代細胞剛接種時呈球形，懸浮于培養液中，12 h 后大多數細胞開始貼壁，細胞逐漸呈短梭狀，或多角形、星形，體積小，生長緩慢。第 7 天，細胞有 90% 融合，呈多角形，形態均一[15]。P2 代兔軟骨細胞的甲苯胺藍染色和免疫組化染色為陽性，證實其增殖和生長情況良好，并能很好地分泌軟骨細胞基質（圖 4）。

圖 1 hACAM 的 hochest33258 染色（A：脫細胞前；B：脫細胞后）

Figure 1 Hochest33258 staining of hACAM (A: Before the decellularization; B: After the decellularization)

光鏡觀察脫細胞軟骨膜基質呈均質的細顆粒狀，脫細胞軟骨細胞外基質呈不規則、邊緣略模糊的蜂巢樣結構。P2 代軟骨細胞種植后，其形態為輪廓清晰的圓形，核明亮而清楚，可偏向細胞的一側，有較強的折光性[6]。光鏡下可見，在第 5、15 天時，hACAM 組生長的兔軟骨細胞的增殖情況明顯優于空白對照組的兔軟骨細胞（圖 5），甲苯胺藍染色結果可見軟骨細胞增殖有明顯差異（< 0.05）（圖 6）。

圖 2 hACAM 的組織學染色（A：甲苯胺藍染色；B：番紅 O 染色）

Figure 2 Histological stainings of hACAM (A: Toluidine blue staining; B: Saffron O staining)

圖 3 鋪膜后未接種細胞的 hACAM 電鏡圖

Figure 3 The SEM image of hACAM-plated not seeding chondrocytes

圖 4 兔關節軟骨細胞的光鏡觀察和組織化學染色（A：第1 天的 P2 代兔軟骨細胞；B：第3 天的 P2 代兔軟骨細胞；C：P2 代兔軟骨細胞甲苯胺藍染色；D：P2 代兔軟骨細胞II型膠原免疫組織化學染色）

Figure 5 Light microscope images and histological staining of the rabbit cartilage chondrocytes (A: Passage 2 of rabbit cartilage chondrocytes after 1d; B: Passage 2 of rabbit cartilage chondrocytes after 3d; C: Toluidine blue staining of P2 chondrocytes; D: Collagen II immunohistochemistrical staining of the P2 rabbit chondrocytes)

5 d 15 d 人脫細胞軟骨細胞外基質組hACAM groups 空白對照組Control groups

Figure 5 Rabbit chondrocytes of hACAM-plated groups and control groups

5 d 15 d 人脫細胞軟骨細胞外基質組hACAM groups 空白對照組Control groups

Figure 6 Toluidine blue staining of the rabbit chondrocytes of the hACAM-plated groups and control groups

2.2 CCK-8 細胞增殖試驗

從 CCK-8 的增殖柱狀圖（圖 7）可以看出，隨著時間的推移，hACAM 組的軟骨細胞增殖優于空白對照組，在第 7 天，hACAM 組的軟骨細胞的增殖情況明顯地優于空白對照組（= 0.0298）；在第 10 天，hACAM 組的軟骨細胞與空白對照組的軟骨細胞的增殖情況相比沒有統計學差異。

OD4924.03.53.02.52.01.51.00.50 1 3 5 7 時間（d）Time (d)

Figure 7 Rabbit chondrocytes proliferation experiment of the CCK-8 (*< 0.05)

3 討論

軟骨病變是骨科較為常見的疾患，同時由于關節軟骨自我修復能力有限，而目前的多種治療方法，如微骨折術、自體或異體組織（骨膜、軟骨膜、骨軟骨塊）移植等，又存在種種缺陷，限制了其臨床應用[16-17]，并且不能獲得滿意的治療效果。組織工程方法的發展和應用為關節軟骨的修復提供了新的思路和途徑。應用組織工程技術構建組織工程軟骨被認為是目前最有可能解決此難題的技術手段[18-23]。

軟骨組織由單一的軟骨細胞和細胞外基質組成，細胞只占軟骨組織體積的 3%，其余均為細胞外基質。軟骨無血管，故以糖酵解為主，但是成熟軟骨細胞本身的代謝非?；钴S，軟骨細胞合成和分泌各種細胞外基質的同時，也合成和分泌多種基質降解酶，因此軟骨細胞對基質的形成和維持起著重要的調節作用，另一方面基質成分反過來也調節著軟骨細胞的功能[15]。有研究表明，滅活的軟骨組織可作為細胞生長的支架[24]。因此，我們認為脫細胞的 hACAM 也很有可能成為軟骨種子細胞很好的生長場所。況且 hACAM 富含透明質酸、糖胺多糖及膠原等，還包括很多生長因子，諸如胰島素生長因子（insulin-like growth factor I，IGF-1）、堿性成纖維生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）、轉化生長因子 β（transforming growth factor β，TGF-β）、血小板生長因子（platelet-derived growth factor，P-DGF）、表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）和其他細胞外基質蛋白[4]。這些生長因子和 ECM 結構蛋白構成了一種微環境，不僅能提供結構支持，還能保持細胞的表型[25-26]。本實驗的目的在于觀察 hACAM 對軟骨種子細胞的增殖及表型維持的影響，探索使兔軟骨種子細胞大量擴增及維持表型的方法。

組織脫細胞的研究出現在 20 世紀 90 年代，它的原理是通過去除組織的移植免疫原性，從而獲得一種天然的無免疫排斥反應的組織替代物。脫細胞目的是在去除細胞、可溶性蛋白、核酸等引起免疫反應的物質的同時，盡可能保留 ECM 成分，保持其生物活性和生物力學性能[27]。目前，來源于肌腱、韌帶、小腸黏膜下層、膀胱、肝[28-31]等組織和器官的生物支架材料均是經過脫細胞處理得到的。ECM 材料是目前再生醫學和組織工程研究的熱點，無論是在動物實驗還是臨床應用上都表現了良好的應用前景。常用的脫細胞方法有離子去垢劑法、雙性離子法、酶法、高滲或低滲溶液法、螯合劑法、差速梯度離心法等，非離子的 Triton X-100 脫細胞劑會造成大量的糖胺多糖的流失和層黏連蛋白、纖維連接蛋白含量的降低，甚至有的組織使用 Triton X-100 長達 4 d 還不能完全除去細胞的碎片[30-32]；其中差速梯度離心法比起其他脫細胞方法，能夠避免其他雜質摻入到材料中，極大地降低細胞毒性，更多地保留 ECM 蛋白和生長因子[27]。脫細胞人軟骨細胞外基質是生物新鮮組織經過物理方法處理，脫去組織中的所有細胞、抗原等物質后所得到的產物，主要包括膠原、彈性蛋白、非膠原糖蛋白、蛋白多糖和糖胺多糖，基本保留了細胞外基質的主要成分和結構。脫細胞基質的主要特點是具有良好的生物相容性、柔韌性、低抗原性。脫細胞軟骨基質可以作為一種天然支架，在體外培養過程中無降解變形，保留了培養前的結構，與軟骨細胞共同培養，軟骨細胞能在其表面生長，并產生基質，說明脫細胞軟骨基質具有良好的穩定性，對軟骨細胞無明顯毒性作用，其本身具有軟骨細胞生長的原始結構和環境，在體內具有誘導軟骨細胞生長的作用[33]。

因此，本實驗選擇差速梯度離心法[8]制作hACAM，保留了蛋白多糖、糖胺聚糖、膠原和生長因子等有效成分，最大限度去除了材料的免疫原性，改善了細胞的生長環境。組織學結果證實經脫細胞處理后的 hACAM，不但把軟骨細胞外基質細胞成分完全脫除，而且保留了蛋白多糖等主要的 ECM 成分。本實驗以同等密度種植兔軟骨種子細胞于空白培養板上作為空白對照組。兩組都以同樣的單純軟骨培養基進行培養。通過倒置顯微鏡和組織學染色發現，隨時間的推移，hACAM 組的兔軟骨細胞的增殖情況較空白對照組更好。通過掃描電鏡可以看到 hACAM 的膠原交叉地排列在培養板的底部，這些膠原蛋白具有張力和剪力特性，固定基質中的蛋白多糖給軟骨細胞提供更好的黏附環境，增強軟骨細胞增殖的可持續性。甲苯胺藍組織學染色同樣證明 hACAM 上的軟骨細胞增殖優于空白對照組。

綜上，本實驗通過物理方法制備的 hACAM 免疫原性低，無細胞毒性作用，有適合細胞生長需要的糖胺聚糖、膠原和生長因子等成分，能夠很好地促進軟骨細胞的增殖，能作為組織工程軟骨的候選材料。

[1] Kuo CK, Li WJ, Mauck RL, et al. Cartilage tissue engineering: its potential and uses. Curr Opin Rheumatol, 2006, 18(1):64-73.

[2] Vacanti JP, Morse MA, Saltzman WM, et al. Selective cell transplantation using bioabsorbable artificial polymers as matrices.J Pediatr Surg, 1988, 23(1 Pt 2):3-9.

[3] Yao J, Lu SB, Peng J, et al. Preparation of articular cartilage extracellular matrix derived oriented scaffold for cartilage tissue engineering. J Clin Rehabilitative Tissue Eng Res, 2009, 13(3):432- 436. (in Chinese)

姚軍, 盧世壁, 彭江, 等. 關節軟骨細胞外基質源性軟骨組織工程取向支架的制備. 中國組織工程研究與臨床康復, 2009, 13(3):432- 436.

[4] Yang Q, Peng J, Guo Q, et al. A cartilage ECM-derived 3-D porous acellular matrix scaffold for in vivo cartilage tissue engineering with PKH26-labeled chondrogenic bone marrow-derived mesenchymal stem cells. Biomaterials, 2008, 29(15):2378-2387.

[5] Zhang C, Jin Z, Gao JH, et al. The regeneration of rabbit ear cartilage with allogenic chondrial ECM: a preliminary experimental report.J Practical Aesthetic Plast Surg,1997, 8(5):228-231. (in Chinese)

張晨, 金鑄, 高景恒, 等. 同種異體兔耳軟骨ECM復制兔耳軟骨的實驗研究──軟骨組織工程的實驗研究預試驗報告. 實用美容整形外科雜志, 1997, 8(5):228-231.

[6] Luan J, Cai Z, Yang PY. Culture of chondrocytes using allogenous acellular cartilaginous matrix. Chin J Plast Surg Burns, 1999, 15(3): 178-179. (in Chinese)

欒杰, 蔡哲, 楊佩瑛. 軟骨細胞在異體脫細胞軟骨基質上的體外培養實驗. 中華整形燒傷外科雜志, 1999, 15(3):178-179.

[7] Pei M, Li JT, Shoukry M, et al. A review of decellularized stem cell matrix: a novel cell expansion system for cartilage tissue engineering. Eur Cell Mater, 2011, 22:333-343.

[8] Zhang JD, Lu SB, Yuan M, et al. Preparation of human articular cartilage acellular matrix. Chin J Clin Rehabil, 2005, 9(14):242-243, 282.

[9] Kang HJ, Lu SB, Zhang L, et al. Human adipose derived stem cell-seeded articular cartilage acellular matrix in the construction of tissue-engineered cartilage in bioreactor. J Clin Rehabilitative Tissue Eng Res, 2007, 11(10):1801-1804, 1811. (in Chinese)

康紅軍, 盧世璧, 張莉, 等. 人脂肪干細胞復合脫細胞軟骨基質支架在生物反應器中構建組織工程軟骨. 中國組織工程研究與臨床康復, 2007, 11(10):1801-1804, 1811.

[10] Hao H, Chen G, Liu J, et al. Culturing on Wharton's jelly extract delays mesenchymal stem cell senescence through p53 and p16INK4a/pRb pathways. PLoS One, 2013, 8(3):e58314.

[11] Xu L, Ye ZY, Zhou Y, et al. Rabbit articular chondrocyte dedifferentiation during in vitro expansion. Chin J Tissue Eng Res, 2013, 17(20):3626-3634. (in Chinese)

徐磊, 葉朝陽, 周燕, 等. 體外傳代培養兔關節軟骨細胞的去分化現象. 中國組織工程研究, 2013, 17(20):3626-3634.

[12] Klagsbrun M. Large-scale preparation of chondrocytes. Methods Enzymol, 1979, 58:560-564.

[13] Kirimoto A, Takagi Y, Ohya K, et al. Effects of retinoic acid on the differentiation of chondrogenic progenitor cells, ATDC5. J Med Dent Sci, 2005, 52(3):153-162.

[14] Li B, Wu ZH, Xiao J, et al. Effect of recombination human Ieptin on the proliferation of cultured chondrocyte. Chin Bone Joint Surg, 2008, 1(4-5):312-316. (in Chinese)

李兵, 吳志宏, 肖軍, 等. 瘦素對于體外培養人類軟骨細胞增殖的影響. 中國骨與關節外科, 2008, 1(4-5):312-316.

[15] Yu L, Li FT, Wang ZY. Effects of extracellular matrix on the proliferation and matrix metabolism of rabbit article chondrocytes in vitro. J Jinan Univ (Med Ed), 2006, 27(6):807-811, 816. (in Chinese)

宇麗, 李發濤, 汪卓赟. 細胞外基質對體外培養兔關節軟骨細胞增殖及基質代謝的影響. 暨南大學學報(醫學版), 2006, 27(6):807-811, 816.

[16] Minas T, Nehrer S. Current concepts in the treatment of articular cartilage defects. Orthopedics, 1997, 20(6):525-538.

[17] Newman AP. Articular cartilage repair. Am J Sports Med, 1998, 26(2): 309-324.

[18] Yan J, Qi N, Zhang Q. Rabbit articular chondrocytes seeded on collagen-chitosan-GAG scaffold for cartilage tissue engineering in vivo. Artif Cells Blood Substit Immobil Biotechnol, 2007, 35(4):333- 344.

[19] Oliveira JM, Rodrigues MT, Silva SS, et al. Novel hydroxyapatite/ chitosan bilayered scaffold for osteochondral tissue-engineering applications: Scaffold design and its performance when seeded with goat bone marrow stromal cells. Biomaterials, 2006, 27(36):6123- 6137.

[20] Li X, Jin L, Balian G, et al. Demineralized bone matrix gelatin as scaffold for osteochondral tissue engineering. Biomaterials, 2006, 27(11):2426-2433.

[21] Kandel RA, Grynpas M, Pilliar R, et al. Repair of osteochondral defects with biphasic cartilage-calcium polyphosphate constructs in a sheep model. Biomaterials, 2006, 27(22):4120-4131.

[22] Swieszkowski W, Tuan BH, Kurzydlowski KJ, et al. Repair and regeneration of osteochondral defects in the articular joints. Biomol Eng, 2007, 24(5):489-495.

[23] Chang CH, Kuo TF, Lin CC, et al. Tissue engineering-based cartilage repair with allogenous chondrocytes and gelatin-chondroitin- hyaluronan tri-copolymer scaffold: a porcine model assessed at 18, 24, and 36 weeks. Biomaterials, 2006, 27(9):1876-1888.

[24] Kelley TF, Sutton FM, Wallace VP, et al. Chondrocyte repopulation of allograft cartilage: a preliminary investigation and strategy for developing cartilage matrices for reconstruction. Otolaryngol Head Neck Surg, 2002, 127(4):265-270.

[25] Forbes K, Westwood M. Maternal growth factor regulation of human placental development and fetal growth. J Endocrinol, 2010, 207(1):1- 16.

[26] Kuhn NZ, Tuan RS. Regulation of stemness and stem cell niche of mesenchymal stem cells: implications in tumorigenesis and metastasis. J Cell Physiol, 2010, 222(2):268-277.

[27] Gilbert TW, Sellaro TL, Badylak SF. Decellularization of tissues and organs. Biomaterials, 2006, 27(19):3675-3683.

[28] Lin P, Chan WC, Badylak SF, et al. Assessing porcine liver-derived biomatrix for hepatic tissue engineering. Tissue Eng, 2004, 10(7-8): 1046-1053.

[29] Bolland F, Korossis S, Wilshaw SP, et al. Development and characterisation of a full-thickness acellular porcine bladder matrix for tissue engineering. Biomaterials, 2007, 28(6):1061-1070.

[30] Woods T, Gratzer PF. Effectiveness of three extraction techniques in the development of a decellularized bone-anterior cruciate ligament-bone graft. Biomaterials, 2005, 26(35):7339-7349.

[31] Cartmell JS, Dunn MG. Effect of chemical treatments on tendon cellularity and mechanical properties. J Biomed Mater Res, 2000, 49(1):134-140.

[32] Grauss RW, Hazekamp MG, Oppenhuizen F, et al. Histological evaluation of decellularised porcine aortic valves: matrix changes due to different decellularisation methods. Eur J Cardiothorac Surg, 2005, 27(4):566-571.

[33] Zhang C, Jing SB, Yang K, et al. Cartilage tissue engineering with acellular cartilage matrix as scaffold in rabbit model. Chin J Reparative Reconstr Surg, 2008, 22(7):846-850. (in Chinese)

張晨, 景士兵, 楊琨, 等. 軟骨脫細胞基質支架材料的軟骨組織工程實驗研究. 中國修復重建外科雜志, 2008, 22(7):846-850.

The effect of human articular cartilage acellular matrix on rabbit chondrocytes

GAO Yue, LIU Shu-yun, HUANG Jing-xiang, GUO Wei-min, CHEN Ji-feng, ZHANG Li, ZHAO Bin, PENG Jiang, WANG Ai-yuan, WANG Yu, XU Wen-jing, LU Shi-bi, GUO Quan-yi

To observe the proliferation of rabbit chondrocytes on human articular cartilage acellular matrix (hACAM) duringexpansion.

hACAM was prepared with the differential centrifugation as 0.5 % slurry, and then coated the 6-well and 96-well plate to form 1 mm thick film as the experimental group. There was no any process for the control group. Chondrocytes were isolated from articular cartilage of New Zealand white rabbits and cultured on hACAM-coated plates hochest33258 staining was used to verify no cell in the hACAM. The cell proliferation and morphology were analyzed with an inverted microscope, toluidine blue staining, and Cell Counting Kit-8 (CCK-8) assay.

The cells of hACAM groups grew faster than that of the control groups under the inverted microscope in d5, d15, which was also proved by the results of toluidine blue staining. The cells of hACAM groups proliferated significantly faster than that of the control groups (= 0.0298 < 0.05) in d7. The experiment groups and the control groups were not statistically significant difference in proliferation (= 0.1322 > 0.05) by CCK-8 cell proliferation assay in d10.

hACAM promotes the proliferation of chondrocytes at low immunogenicity and no cytotoxic effects, and then it is used as an ideal biological material.

Extracellular matrix; Cartilage; Chondrocytes; Tissue engineering; Cell proliferation

GUO Quan-yi, Email: doctorguo@163.com

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2014.02.001

國家自然科學基金（81071458、81000810）；國家高技術發展研究計劃（863計劃）（2012AA020502）

郭全義，Email：doctorguo@163.com

2014-02-10

Author Affiliation: Institute of Orthopedics, Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853, China