人載脂蛋白A-I表達上調劑的發現與活性研究

杜郁，賈曉健，王麗，王麗非，姜華軍，楊帆，司書毅，楊媛，洪斌

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人載脂蛋白A-I表達上調劑的發現與活性研究

杜郁，賈曉健，王麗，王麗非，姜華軍，楊帆，司書毅，楊媛，洪斌

100050 北京，中國醫學科學院北京協和醫學院醫藥生物技術研究所衛生部抗生素生物工程重點實驗室（杜郁、賈曉健、王麗、王麗非、姜華軍、楊帆、楊媛、洪斌），國家新藥（微生物）篩選實驗室（司書毅）

篩選上調人載脂蛋白 A-I（ApoA-I）基因表達的新型活性化合物，并在表達和功能水平對其作用進行研究。

利用人 ApoA-I 基因表達上調劑篩選模型對化合物庫進行篩選；對發現的活性化合物在 ApoA-I 啟動子水平進行量效關系研究；利用實時熒光定量 RT-PCR 檢測 ApoA-I mRNA 的表達水平；利用 Western blot、ELISA 和流式細胞技術檢測 ApoA-I 的蛋白表達；利用膽固醇流出試驗檢測 ApoA-I 介導的巨噬細胞膽固醇外流的情況。

從 20000 樣次化合物篩選中得到活性化合物 5238B-69，在一定濃度范圍內存在轉錄調控活性的量-效關系，當化合物濃度為 0.30 μg/ml 時，上調 ApoA-I 表達活性達到最高值（408%），EC50為 0.01 μg/ml。5238B-69 能顯著上調 HepG2 細胞中 ApoA-I mRNA 的水平；同時，Western blot 結果顯示 5238B-69 能增加 HepG2 細胞 ApoA-I 蛋白的表達。ELISA 結果顯示，與對照相比，5238B-69 作用 48 h 時，胞外 ApoA-I 水平增加了 48%，流式細胞檢測表明，5238B-69 作用 24 h 后，胞內 ApoA-I 蛋白水平增加了 21.4%。功能分析試驗顯示，5238B-69 作用 HepG2 細胞上調生成的 ApoA-I，能促進巨噬細胞RAW 264.7 內 [3H] 標記的膽固醇的流出。

得到一個具有上調 ApoA-I 表達的活性化合物，在提高 ApoA-I 表達水平和生物學功能方面均有明顯的效果。

載脂蛋白 A-I； 基因表達調控； 動脈粥樣硬化； 轉錄水平

血漿高密度脂蛋白膽固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）水平偏低是心血管病的獨立危險因素，在過去的三十年中，國內外的研究人員一直尋求通過升高血漿中高密度脂蛋白膽固醇的水平來降低動脈粥樣硬化性心血管病的發生。隨著對 HDL 生物學特性認識的不斷深入，人們發現 HDL 是包括了一系列大小、形態、密度及結構極不均一的脂蛋白顆粒，根據結構組成上的異質性，HDL 可分為多種亞型并表現有代謝和功能上的差異[1]。2006 年和 2012 年，兩個旨在升高血漿 HDL-C 水平的膽固醇酯轉運蛋白（cholesteryl ester transfer protein，CETP）抑制劑 torcetrapib 和 dalcetrapib（JTT-705）臨床試驗分別遭遇失敗[2-3]，引發了研究人員對 HDL 復雜性與心血管病收益的一系列爭論，研究關注的焦點逐漸從升高 HDL-C的水平轉向提升 HDL-C 的功能。

載脂蛋白 A-I（apolipoprotein A-I，ApoA-I）約占 HDL 蛋白組成的 70%，因而血漿ApoA-I 的濃度與 HDL-C 水平密切相關。同時，ApoA-I 作為 ATP 結合盒式轉運子（ATP-binding cassette-A1，ABCA1）的配體，能夠介導巨噬細胞中游離膽固醇的外流，從而起始 HDL 的生物合成，同時啟動膽固醇逆轉運過程，在肝外組織清除過多膽固醇的過程中發揮了重要作用。動物體內的研究表明，過表達人 ApoA-I 基因能顯著抑制小鼠體內動脈粥樣硬化早期損傷——脂紋的形成[4]，更重要的是，在動脈粥樣硬化易感小鼠中，過表達 ApoA-I 通過增強巨噬細胞 RCT 增加了糞便中膽固醇的排出，這有可能是其消退動脈粥樣斑塊的潛在機制[5-6]。所以，ApoA-I 不僅是 HDL 的主要結構蛋白，還是 HDL 發揮心血管保護功能的重要組成單位。因此，以 ApoA-I 為靶點的藥物被認為是基于 HDL 的抗動脈粥樣硬化藥物中極具應用前景的治療策略[7]。為尋找能夠提高 ApoA-I 表達水平的活性化合物，作者在前期工作中構建了 ApoA-I 基因表達上調劑篩選模型[8]。本研究在此模型的基礎上，對國家新藥（微生物）篩選實驗室化合物庫進行了20 000 樣次篩選，得到了結構新穎的活性化合物 5238B-69，對其生物活性進行了研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株 人肝癌細胞株 HepG2 和小鼠的單核-巨噬細胞 RAW 264.7 均為本室保存；ApoP- Luc HepG2 細胞由本實驗室構建[8]。

1.1.2 主要試劑 Luciferase assay system 細胞裂解液和熒光素酶檢測系統、SV 總 RNA 提取試劑盒、TMB 單相發光底物購自美國 Promega公司；Turbo script 1st-strand cDNA synthesis 反轉錄試劑盒購自原平皓生物技術有限公司；熒光實時定量 PCR 試劑盒（Faststart universal SYBR green PCR master，ROX）購自瑞士 Roche 公司；兔抗人 ApoA-I 多克隆抗體（178422）購自美國 Calbiochem 公司；增強型 HRP 化學發光液購自美國 Millipore 公司；MEM 細胞培養基為美國 Thermo 公司產品；胎牛血清、丙酮酸鈉、非必需氨基酸和G418 抗生素為美國 Gibco 公司產品；二甲基亞砜（DMSO）購自美國 Sigma 公司；牛血清白蛋白購自美國 Sigma Aldrich 公司。篩選所用的化合物來自國家新藥（微生物）篩選實驗室，純度 > 95%，可商業購買。

1.1.3 儀器 EnVision 多功能微孔板檢測儀和 MicroBeta2液體閃爍計數儀為美國 Perkin Elmer 公司產品；iQ5 Multicolor real time PCR 儀為美國 Bio-Rad 公司產品；TE-70PWR 半干式轉膜儀和 ImageQuant 300 凝膠成像儀為美國 GE Healthcare 公司產品；EPICS XL 流式細胞儀為美國 Coulter 公司產品。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 人肝癌細胞株 HepG2 培養于含 10% 胎牛血清的 MEM 培養基中；ApoP-Luc HepG2 細胞培養于含 700 μg/ml G418 和 10% 胎牛血清的 MEM 培養基中；小鼠的單核-巨噬細胞 RAW 264.7 用含 10% 胎牛血清的 DMEM 高糖培養液培養。所有細胞都在 5% CO2培養箱中37 ℃貼壁培養。

1.2.2 化合物高通量篩選 在前期工作中，構建了含有人 ApoA-I 基因啟動子序列的熒光素酶報告基因重組質粒，并獲得了穩定轉染細胞株——ApoP-Luc HepG2 細胞[8]，本研究利用該細胞考察化合物上調 ApoA-I 基因表達的作用。將對數生長期的細胞用含 G418 700 μg/ml 的 MEM 選擇培養液調節至 5 × 105個/ml，接種于 96 孔細胞培養板，每孔 100 μl。37 ℃、5% CO2培養6 h 后，吸棄含血清的培養液上清，更換無血清 MEM 培養液，并加入待篩化合物樣品（初篩樣品濃度為 2 μg/ml）及 DMSO（終濃度 0.1%）對照。20 h 后移去細胞培養液上清，PBS 漂洗細胞 2 次，每孔加入 20 μl 細胞裂解液，37 ℃孵育 15 min 以充分裂解，加入 Luciferase assay system 中提供的熒光素酶檢測液后，通過微孔板多功能檢測儀讀取熒光素酶活性數值。以熒光素酶的表達活性來考察化合物對 ApoA-I 基因表達的上調作用。熒光素酶活性的評價采用調節率來定義：

調節率=（樣品組細胞熒光素酶活性/DMSO 組細胞熒光素酶活性）× 100%

本研究將化合物樣品的調節率大于 150% 視為初篩陽性。

1.2.3 篩選模型量效關系研究 將化合物溶于 DMSO，制成濃度為 10 mg/ml 的母液。在 96 孔板中接種 ApoP-Luc HepG2 細胞，將化合物濃度從0.625 μg/ml 開始行對倍稀釋，共制備 12 個濃度梯度，并使 DMSO 終濃度保持為 0.1%（W/V）。按照 1.2.2 所述方法檢測細胞的熒光素酶活性。利用 SigmaPlot9.0 制圖軟件計算 EC50。

1.2.4 實時熒光定量 RT-PCR 檢測 ApoA-I mRNA 的表達 取人肝癌細胞 HepG2，以細胞數 8 × 105/孔接種于 6 孔細胞培養板，37 ℃、5% CO2培養 24 h，用 PBS 漂洗細胞后，加入含指定濃度化合物的無血清培養液，對照孔加入 0.1% 的 DMSO。37 ℃、5% CO2培養 24 h。450 ×離心5 min，收集細胞，用 SV 總 RNA 提取試劑盒提取細胞總 RNA。ApoA-I 擴增片段長度為 114 bp，正向引物為 5' TGTGTACGTGGATGTGCTCAAAG 3'，反向引物為 5' GTCACGCTGTCCCAGTTGTCA 3'；內參基因為GAPDH，正向引物 5' AGCCACAT CGCTCAGACAC 3'；反向引物 5' GCCCAATACGA CCAAATCC 3'。PCR 條件為 95 ℃預變性 10 min，95 ℃變性 15 s，60 ℃退火 30 s，30 個循環。

1.2.5 Western blot 檢測 ApoA-I 蛋白表達 HepG2 細胞接種于 6 孔細胞培養板，加入化合物，作用 24 h后，消化收集細胞，以 RIPA 裂解液處理細胞，抽提細胞總蛋白。細胞蛋白樣品經 10% SDS-PAGE 分離，上樣量為 50 μg，采用半干電轉移系統將蛋白轉移至 PVDF 膜上，5% 脫脂奶粉封閉 1 h，加入 ApoA-I 一抗（1:1000）4 ℃孵育過夜，TBST 洗膜 3 次，加入 HRP 標記的二抗（1:3000），室溫孵育 1 h，增強化學發光法（ECL）顯色。以 β-actin 作為內參，用兩者灰度掃描結果的比值進行 ApoA-I 表達變化的統計分析。

1.2.6 ELISA 檢測胞外 ApoA-I 蛋白水平 取細胞培養液上清，酶標板每孔加 100 μl 包被過夜。用 3% BSA 封閉，將 ApoA-I 抗體按 1:1000稀釋，每孔 100 μl，37 ℃放置 1 h，加入辣根過氧化物酶標記的二抗（1:5000），37 ℃孵育 1 h，加入 TMB 顯色底物，室溫靜置 30 min，加入1 mol/L HCl 終止反應，每步驟之間用 PBST 洗滌 4 次，以酶標儀檢測450。

1.2.7 流式細胞技術檢測胞內 ApoA-I 蛋白表達 消化收集細胞，經 4%（W/V）多聚甲醛室溫固定 40 min，PBS 漂洗，以 0.1% Triton 對細胞進行穿孔處理，含 5% FBS 的 PBS 封閉 15 min，PBS 漂洗后用 ApoA-I 一抗（1:50）4 ℃處理50 min，PBS 漂洗細胞 3 次，FITC 標記二抗（1:100）處理 50 min，利用流式細胞儀檢測胞內 ApoA-I 蛋白水平的變化，每組樣品平均檢測細胞數為 10 000 個，各組細胞的相對熒光強度以對數積分圖表示。

1.2.8 膽固醇流出試驗 取 RAW 264.7 細胞，按 2 × 104個/孔接種于 24 孔板，于 37 ℃、5% CO2培養 6 h 后，用 0.5 ml 含 1 μCi/ml [3H] 標記膽固醇的 DMEM 培養液（5% FBS、0.2% 牛血清白蛋白）孵育 24 h。棄去含同位素的上清培養基，PBS 漂洗細胞，加入含濃度為 0.3 mmol/L 的 cAMP 的 DMEM 無血清培養液以上調 ABCA1 表達，培養 24 h。PBS 洗滌細胞，加入化合物作用 HepG2 細胞后的培養液上清，孵育 6 h。收集 RAW 264.7 細胞培養液上清，高速離心 3 min，取上清液檢測；細胞部分用 500 μl 0.1 mol/L NaOH 裂解，收集裂解液。用閃爍計數法檢測培養液和細胞的[3H] 標記膽固醇。膽固醇流出程度用如下公式表示：

膽固醇流出程度（%）= 培養液中 cpm 值/（培養液中cpm 值+ 培養細胞中cpm 值）× 100 %（cpm：每分鐘記數）。

1.3 統計學處理

2 結果

2.1 化合物篩選結果

用 ApoP-Luc HepG2 細胞對本所國家新藥（微生物）篩選實驗室化合物庫進行篩選，若相對熒光素酶活性增加 50% 以上，則認為是初篩陽性化合物，進一步進行量效關系復篩。通過對化合物庫進行 20 000 樣次篩選及復篩，獲得活性化合物5238B-69（圖 1A）。5238B-69 的化學名稱是 2-(1,3- 苯并噻唑-2-巰基)-N-喹啉基-5-乙酰胺，化學式為 C18H13N3OS2，分子量是 351.45。MTT 結果顯示在實驗所采用的濃度范圍內，化合物 5238B-69 對 HepG2 細胞沒有明顯的細胞毒活性。

2.2 5238B-69 在 ApoA-I 表達上調劑篩選模型中的量效關系曲線

檢測不同濃度的化合物作用于ApoP-Luc HepG2 細胞后熒光素酶表達活性的變化，得到化合物在 ApoA-I 表達上調劑篩選模型上的量效關系曲線（圖 1B）。結果表明，5238B-69 以劑量依賴的方式增強 ApoP-Luc HepG2 細胞熒光素酶表達活性。5238B-69 在質量濃度為 0.30 μg/ml 時，其上調ApoA-I 表達活性達到最高值408%，EC50為 0.01 μg/ml。

相對熒光素酶活性（%）Relative luciferase activity (%) 400 300 200 100 0.0001 0.001 0.01 0.1 1 A 5238B-69 濃度（μg/ml）Concentration of 5238B-69 (μg/ml)B

Figure 1 Chemical structure of 5238B-69 (A) and dose-response curve in log scale (B)

mRNA 表達相對含量Relative mRNA expression(ApoA-I/GAPDH)1.5 1.0 0.5 0 mRNA 表達相對含量Relative mRNA expression(ApoA-I/GAPDH)1.5 1.0 0.5 0 對照 0.01 0.05 0.1 0.5 1Control 12 24 36 48 5238B-69 濃度（μg/ml）Concentration of 5238B-69 (μg/ml)A 時間（h）Time (h)B

Figure 2 Effect of 5238B-69 on ApoA-I mRNA expression in HepG2 cells in a concentration-dependent (A) and time-dependent manner (B) (*< 0.05,**< 0.01)

2.3 5238B-69 對 HepG2 細胞中 ApoA-I mRNA 水平的影響

HepG2 細胞經化合物 5238B-69 處理 24 h 后，提取細胞總 RNA，反轉錄成 cDNA 后，采用RT-PCR 反應檢測 ApoA-I 的 mRNA 表達。以管家基因 GAPDH（不同樣品間表達量基本恒定）作為內參，得到樣品待測基因相對于內參基因的含量，再同對照組相比考察 mRNA 的含量變化。結果顯示，5238B-69 能增加 HepG2 細胞中 ApoA-I mRNA 的表達，當化合物在濃度為 0.01 ~ 0.1 μg/ml 的范圍內時，mRNA 表達上調與對照組相比有顯著的差異，在 0.05 μg/ml 時，mRNA 水平上調最高，可以達到（1.33 ± 0.05）倍（圖 2A）。進而考察了0.1 μg/ml 的 5238B-69 在不同時間對 ApoA-I mRNA 表達的影響（圖 2B），作用 24 h 后，ApoA-I mRNA 水平上調最高。

2.4 5238B-69 對 HepG2 細胞 ApoA-I 蛋白水平的影響

分別以不同濃度的化合物 5238B-69 作用 HepG2 細胞，48 h 后提取培養基上清中和細胞總蛋白，SDS-PAGE 分離后，采用 Western blot 法檢測 ApoA-I 蛋白含量。結果顯示，在 0.001~0.05 μg/ml 的濃度范圍內，5238B-69 能明顯增加 HepG2 細胞分泌到上清中的 ApoA-I 蛋白水平，同時對胞內 ApoA-I 的蛋白水平也存在一定程度的上調（圖 3）。

上清 Supernatant胞內 Cell lysatesβ-actin 對照 0.05 0.01 0.005 0.001Control 5238B-69 濃度（μg/ml）Concentration of 5238B-69 (μg/ml)

Figure 3 Western blot analysis for the effect of 5238B-69 at different concentrations on ApoA-I protein expression in HepG2 cells

2.5 ELISA 檢測 5238B-69 對分泌到 HepG 細胞上清中 ApoA-I 蛋白水平的影響

為進一步明確化合物對上清中 ApoA-I 水平的影響，采用 ELISA 的技術手段分析了0 ~ 72 h 上清中 ApoA-I 蛋白的變化。結果顯示，在 48 h，0.1 μg/ml的 5238B-69 處理組的 ApoA-I 分泌至胞外的蛋白水平是對照組的 1.48 倍（< 0.05）（圖 4）。

上清中 ApoA-I 蛋白相對含量Relative ApoA-I in media2.0 1.5 1.0 0.5 0 0 24 48 72 時間（h）Time (h)

Figure 4 ELISA anlysis of the effect of 5238B-69 on ApoA-I protein level in media for the indicated time (*< 0.05)

2.6 流式細胞技術檢測 5238B-69 對 HepG2 胞內 ApoA-I 蛋白表達的作用

由于流式細胞技術能較敏感地從單個細胞水平定量或半定量檢測細胞蛋白，利用該技術分析了化合物對胞內 ApoA-I 表達的影響。結果表明，0.5 μg/ml 的 5238B-69 處理 HepG2 細胞 24 h 后，化合物處理組 ApoA-I 的蛋白含量比對照組增加了 21.4%（圖 5），進一步證實了化合物 5238B-69的作用。

2.7 5238B-69 對 RAW 264.7 細胞中[3H] 標記膽固醇流出的影響

0.05 μg/ml 的化合物 5238B-69 作用 HepG2 細胞 24 h 后，吸取培養基上清，與事先荷載有 [3H]-膽固醇的 RAW 264.7 細胞共同孵育。6 h 后，分別收集 RAW 264.7 細胞的培養基上清及細胞裂解液，利用液體閃爍儀檢測其中的 [3H] 標記膽固醇，分析 [3H] 標記膽固醇流出的情況。功能水平的初步研究結果顯示，對照組、化合物組和 HDL（50 μg/ml）組的膽固醇流出分別是（15.7 ± 3.9）%、（22.5 ± 6.2）% 和（19.9 ± 2.5）%。5238B-69 作用 HepG2 細胞后分泌產生的 ApoA-I，促進巨噬細胞內膽固醇的流出明顯高于對照組（= 0.036），從而在生物學功能水平證明該化合物所上調表達的 ApoA-I 是具有接受膽固醇功能的（圖 6）。

3 討論

動脈粥樣硬化性心血管疾病是全球范圍造成人口死亡的主要病因，盡管他汀類藥物能減少 40% 左右的心血管病的發生，但此類疾病的復發和繼續發展的可能性依然很高，心血管病的剩留風險依然存在。為此，研究人員一直在積極尋找動脈粥樣硬化疾病的新型治療策略，在降低低密度脂蛋白膽固醇的同時，從逆轉動脈粥樣硬化進程的新靶點入手，開發具有新作用機制的藥物。

ApoA-I 相對蛋白水平Relative ApoA-I protein levels1.5 1.0 0.5 0 對照 5238B-69Control

Figure 5 Flow cytometry analysis for the effect of 5238B-69 on ApoA-I protein levels in HepG2 cells (*< 0.05)

[3H]標記膽固醇外排（%）[3H]-cholesterol efflux (%)35 30 25 20 15 10 5 0 對照 5238B-69 HDLControl

Figure 6 5238B-69 promoted cholesterol efflux from RAW 264.7 cells (*< 0.05)

HDL 和 ApoA-I 因有促進巨噬細胞膽固醇流出、啟動膽固醇逆轉運、抗炎、抗氧化、抗血栓、保護內皮細胞等多種功能，可能是其多效性發揮抗動脈粥樣硬化的潛在機制。van der Steeg 等[9]在HDL-C、HDL 顆粒、ApoA-I 與心血管病風險的關系研究中發現，盡管極高濃度的 HDL-C 和大顆粒的 HDL 可能存在增加心血管事件發生的風險，但 ApoA-I 始終表現出動脈保護作用，提示 ApoA-I 在抗動脈粥樣硬化過程中的關鍵作用。目前有多項以 ApoA-I 為靶點的藥物正處于臨床研究階段。CSL-112 是由血漿中純化的 ApoA-I 重組成適合于輸注的 HDL，能夠顯著增強人體內膽固醇流出，同時升高pre-β-HDL 的水平，有望減輕動脈粥樣硬化在急性冠狀動脈綜合征發病初期所造成的負擔，目前正在進行臨床 II 期研究[10-11]。CER-001 是首個模擬 pre-β-HDL 結構及功能的類似物，也是一個基于 ApoA-I 的模擬肽，臨床前研究證實，CER-001 能促進膽固醇動員，增強膽固醇逆轉運，2011 年開始進行臨床 II 期研究[12]。D-4F/L-4F 是根據 ApoA-I 脂質結合區雙親性螺旋的二級結構，設計合成的含有 18 個氨基酸的短肽。動物水平的研究發現，它可促進 ABCA1 及 B 族 I 型清道夫受體（scavenger receptor class B member 1，SR-BI）介導的膽固醇流出，但 D-4F 在人體中生物利用度較低[13]。

和上述以 ApoA-I 為靶點的藥物相比，本研究發現的新型化合物 5238B-69 具有潛在的優勢。首先，它是一個小分子化合物，結構新穎，成藥性好。而上述 CSL-112、CER-001 等藥物屬于多肽蛋白類，這一屬性在很大程度上限制了其在臨床上的應用。其次，上文提到的藥物大都是通過外源性直接增加 HDL 的數量進而發揮作用，本文的研究結果顯示，5238B-69 是內源性上調 ApoA-I 表達的化合物，膽固醇流出試驗表明這種基于蛋白表達水平的上調所產生的是具有生理功能的 ApoA-I 及 HDL，可通過增強 ApoA-I/HDL 介導的膽固醇外排來減少細胞中脂質的累積。RVX-208 是第一個能增加 ApoA-I 內源性表達的小分子化合物，臨床試驗證實，RVX-208 顯著增加 ApoA-I 和大顆粒 HDL 的水平，可能在增強膽固醇逆轉運的過程中發揮重要作用。剛剛結束的 Assure 研究進一步發現，聯用瑞舒伐他汀和 RVX-208 的患者表現出顯著的斑塊消退，其動脈粥樣斑塊體積百分比（percent atheroma volume，PAV）變化為 –1.43%，是試驗預先設定的 PAV 終點（–0.6%）的兩倍多[14-15]。隨著結果的陸續公布，必將繼續深入地揭示這類藥物在抗動脈粥樣硬化治療中的重要作用。

為了驗證化合物 5238B-69 對 HepG2 細胞中ApoA-I 蛋白表達的影響，本研究選用了三種方法檢測 ApoA-I 的蛋白水平。由于細胞合成 ApoA-I 蛋白后會不斷向胞外分泌，所以利用 Western blot 的方法分別檢測了胞內和培養基上清中的 ApoA-I。為了進一步明確胞外 ApoA-I 蛋白的變化情況，利用 ELISA 方法進行檢測，結果顯示在化合物作用 48 h 后，胞外蛋白的水平與對照有顯著性差異。進一步用流式細胞技術檢測胞內的蛋白表達，發現在 24 h 時，化合物處理組的 ApoA-I 水平較對照組顯著地上調。這些結果提示化合物 5238B-69 在 24 h 時即可顯著上調 ApoA-I 的表達水平，隨著時間的推移，48 h 時分泌到胞外的 ApoA-I 蛋白顯著增加。

本研究首先通過啟動子報告基因實驗，初步證明了化合物對 ApoA-I 轉錄的激活作用，繼而在 mRNA 和蛋白水平驗證了化合物增強 ApoA-I 基因轉錄的作用。我們還利用構建的另一個包含有更長 5'調控序列（–456 ~ 173 bp）的報告基因質粒，檢測了 5238B-69 對其表達活性的影響（結果未給出）。研究發現，5238B-69 對這兩段調控序列表現出接近的調控活性和 EC50，提示該化合物可能的作用范圍應該在–277 ~ 173 bp 之內，這段序列含有重要的轉錄因子結合位點 Site A（–214 ~ –192 bp）、Site B（–169 ~ –146 bp）和 Site C（–134 ~ –119 bp），負責與核受體，例如過氧化物酶體增殖物激活型受體（PPAR）、視黃醇類物質 X 受體（RXR）、肝細胞核因子 3 或 4（HNF-3/4）和肝 X 受體（LXR）等相識別，參與對 ApoA-I 基因轉錄的調控。接下來的工作將進一步確定發揮作用的順式元件及轉錄因子，以期完善化合物 5238B-69 的分子作用機制。

本研究以前期的工作為基礎，利用已建立的 ApoA-I 基因表達上調劑篩選模型，發現化合物 5238B-69 具有誘導 ApoA-I 基因轉錄激活的作用；通過 mRNA 和蛋白水平的研究，證實了 5238B-69 對 HepG2 細胞內 ApoA-I 的表達上調；以此為基礎，在功能水平進一步證明該化合物能夠顯著促進巨噬細胞中膽固醇的流出。以上結果證明，5238B-69 可以上調 HepG2 細胞中 ApoA-I 的內源性表達，并且能在生物學功能上得到驗證。外周細胞內膽固醇積聚是動脈粥樣硬化的重要環節，促進膽固醇的清除代謝是預防和治療動脈粥樣硬化的關鍵步驟，功能試驗的結果提示化合物 5238B-69 可能通過作用于膽固醇逆轉運的起始環節，增強外周組織中膽固醇的動員，進而起到抗動脈粥樣硬化的作用。本研究為化合物 5238B-69 抗動脈粥樣硬化機制的深入研究提供了重要的依據，為開發尋找具有自主知識產權的抗動脈粥樣硬化新機制藥物奠定了基礎。

[1] Ng DS, Wong NC, Hegele RA. HDL--is it too big to fail? Nat Rev Endocrinol, 2013, 9(5):308-312.

[2] Tall AR, Yvan-Charvet L, Wang N. The failure of torcetrapib: was it the molecule or the mechanism? Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2007, 27(2):257-260.

[3] Schwartz GG, Olsson AG, Abt M, et al. Effects of dalcetrapib in patients with a recent acute coronary syndrome. N Engl J Med, 2012, 367(22):2089-2099.

[4] Rubin EM, Krauss RM, Spangler EA, et al. Inhibition of early atherosclerosis in transgenic mice by human apolipoprotein AI. Nature, 1991, 353(6341):265-267.

[5] Plump AS, Scott CJ, Breslow JL. Human apolipoprotein A-I gene expression increases high density lipoprotein and suppresses atherosclerosis in the apolipoprotein E-deficient mouse. Proc Natl Acad Sci U S A, 1994, 91(20):9607-9611.

[6] Tangirala RK, Tsukamoto K, Chun SH, et al. Regression of atherosclerosis induced by liver-directed gene transfer of apolipoprotein A-I in mice. Circulation, 1999, 100(17):1816-1822.

[7] Shah PK. Atherosclerosis: targeting endogenous apo A-I--a new approach for raising HDL. Nat Rev Cardiol, 2011, 8(4):187-188.

[8] Du Y, Wang L, Wang LF, et al. Establishment of a high-throughput screening model for identifying upregulator of human Apo A-I expression. Chin Med Biotechnol, 2011, 6(3):178-183. (in Chinese)

杜郁, 王麗, 王麗非, 等. 以Apo A-I為靶點的基因表達上調劑篩選模型的建立. 中國醫藥生物技術, 2011, 6(3):178-183.

[9] van der Steeg WA, Holme I, Boekholdt SM, et al. High-density lipoprotein cholesterol, high-density lipoprotein particle size, and apolipoprotein A-I: significance for cardiovascular risk: the IDEAL and EPIC-Norfolk studies. J Am Coll Cardiol, 2008, 51(6):634-642.

[10] Tardif JC, Grégoire J, L'Allier PL, et al. Effects of reconstituted high-density lipoprotein infusions on coronary atherosclerosis: a randomized controlled trial. JAMA, 2007, 297(15):1675-1682.

[11] Kones R. Reducing residual risk: modern pharmacochemistry meets old-fashioned lifestyle and adherence improvement. Ther Adv Cardiovasc Dis, 2013, 7(3):169-182.

[12] Keyserling CH, Hunt TL, Klepp HM, et al. CER-001, a synthetic HDL-mimetic, safely mobilizes cholesterol in healthy dyslipidemic volunteers. Circulation, 2011, 124:A15525.

[13] Bloedon LT, Dunbar R, Duffy D, et al. Safety, pharmacokinetics, and pharmacodynamics of oral apoA-I mimetic peptide D-4F in high-risk cardiovascular patients. J Lipid Res, 2008, 49(6):1344-1352.

[14] Bailey D, Jahagirdar R, Gordon A, et al. RVX-208: a small molecule that increases apolipoprotein A-I and high-density lipoprotein cholesterol in vitro and in vivo. J Am Coll Cardiol, 2010, 55(23): 2580-2589.

[15] Nicholls SJ, Gordon A, Johannson J, et al. ApoA-I induction as a potential cardioprotective strategy: rationale for the SUSTAIN and ASSURE studies. Cardiovasc Drugs Ther, 2012, 26(2):181-187.

Identification and characterization of novel upregulator of human Apolipoprotein A-I

DU Yu, JIA Xiao-jian, WANG Li, WANG Li-fei, JIANG Hua-jun, YANG Fan, SI Shu-yi, YANG Yuan, HONG Bin

To find potential small molecules that increase endogenous synthesis of apolipoprotein A-I (ApoA-I), and to identify its ability of increasing ApoA-I at expression and functional levels.

Compounds screening was performed with established screening model based on the ApoP-Luc HepG2 cell line. Dose-response relationship of the active compound was achieved in promoter activity. The expression of ApoA-I in HepG2 cells regulated by the compound was detected by real-time quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR), Western blot, ELISA and flow cytometry analysis. The cholesterol efflux assay was applied to investigate the effect of promoted ApoA-I on mediating lipid transfer in RAW 264.7 cells.

In the present study, compound 5238B-69 was found using the screening model. 5238B-69 increased ApoA-I promoter activity in a dose-dependent manner with EC50of 0.01 μg/ml, and maximal activity of 408% at 0.30 μg/ml. 5238B-69 significantly increased ApoA-I mRNA level and protein level in HepG2 cells. ELISA and flow cytometry analysis showed 5238B-69 could increase ApoA-I protein by 48% and 21.4% compared with control in the media and cells, respectively. The functional efflux assay further illustrated the role of ApoA-I induced by 5238B-69 with RAW 264.7 cells.

A potential small molecular upregulator was obtained, which could significantly increase the expression of human ApoA-I in liver cells and promote cholesterol efflux from mice macrophages.

Apolipoprotein A-I; Gene expression regulation; Atherosclerosis; Transcriptional regulation

HONG Bin, Email: binhong69@hotmail.com; YANG Yuan, Email: yangyuan78@hotmail.com

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2014.02.003

國家自然科學基金（30801401）；“重大新藥創制”國家科技重大專項（2012ZX09301002-003、2012ZX09301002-001）

洪斌，Email：binhong69@hotmail.com；楊媛，Email：yangyuan78@hotmail.com

2013-11-12

Author Affiliations: Key Laboratory of Biotechnology of Antibiotics of Ministry of Health (DU Yu, JIA Xiao-jian, WANG Li,WANG Li-fei, JIANG Hua-jun, YANG Fan, YANG Yuan, HONG Bin), National Laboratory for Screening New Microbial Drugs (SI Shu-yi), Institute of Medicinal Biotechnology, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Beijing 100050, China