結(jié)核特異性CD4+ α/β TCR四聚體細(xì)胞株篩選技術(shù)的建立和應(yīng)用

姚亞男，黃宇虹，王娟，陳伊，任亮亮，賴小敏

?

結(jié)核特異性CD4+α/β TCR四聚體細(xì)胞株篩選技術(shù)的建立和應(yīng)用

姚亞男，黃宇虹，王娟，陳伊，任亮亮，賴小敏

510080 廣州，中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)教研室/熱帶病防治研究教育部重點實驗室/海洋微生物功能分子廣東省高校重點實驗室/廣東省重大傳染病預(yù)防和控制技術(shù)中心

應(yīng)用不同的 MTB 多肽以及不同的 HLA-DR 基因構(gòu)建的膜表面表達結(jié)核抗原肽/HLA-DR 復(fù)合物的 S2 恒定細(xì)胞株，即人工 APC 篩選、鑒定結(jié)核特異性 CD4+α/β TCR 四聚體。

以 PE 標(biāo)記的 CD4+α/β TCR 四聚體、FITC 標(biāo)記的抗 HLA-DR 抗體（L243），分別與未誘導(dǎo)表達或 CuSO4誘導(dǎo)表達后的膜表面表達結(jié)核抗原肽/HLA-DR 的果蠅 S2 恒定細(xì)胞株，以及與無多肽或結(jié)合有結(jié)核多肽的、表達 HLA-DR 的 S2 細(xì)胞株共孵育，流式細(xì)胞技術(shù)檢測分析 TCR 四聚體與各種細(xì)胞株結(jié)合率的差異。

TCR 四聚體 6M、6N 均與 2# 細(xì)胞株，即 C5/HLA-DRB1*0404（1.73%、5.93%）等具有較高的陽性結(jié)合率；結(jié)核抗原肽孵育后，一些人工 APC 的四聚體陽性結(jié)合率有所提高；所篩選的 9 個 TCR 四聚體均與 2# 細(xì)胞株有較高的結(jié)合率。

膜表達結(jié)核抗原肽/HLA-DR 的 S2 細(xì)胞株，可以應(yīng)用于結(jié)核特異性 CD4+α/β TCR 四聚體的篩選、鑒定；構(gòu)建的 9 個 CD4+α/β TCR 四聚體均為結(jié)核特異性。

結(jié)核多肽； HLA-DR； 人工抗原遞呈細(xì)胞； CD4+T 細(xì)胞； TCR四聚體

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌（m，MTB）感染引起的以呼吸系統(tǒng)感染為主的慢性傳染病，可累及全身多器官系統(tǒng)，最常見的患病部位是肺臟，也可以累及肝、腎、腦、淋巴結(jié)等器官。近年來，隨著耐藥結(jié)核、HIV-TB 雙重感染等患者的增加，發(fā)病率曾一度呈下降趨勢的結(jié)核病再次成為威脅人類健康的主要疾病之一。

機體感染 MTB 后，抗原遞呈細(xì)胞（antigen presenting cell，APC）吞噬 MTB，經(jīng) APC 處理的結(jié)核抗原通過抗原肽/HLA-II 復(fù)合物與 T 細(xì)胞受體（T cell receptor，TCR）之間的相互作用被遞呈給 CD4+T 細(xì)胞，所以可以通過 TCR 四聚體染色技術(shù)來檢測 APC 表面的結(jié)核抗原肽/HLA-II 復(fù)合物。四聚體技術(shù)具有直接、靈敏、迅速的特點，然而首先需篩選、鑒定出高特異性和高親和力的結(jié)核特異性 TCR 四聚體[1-2]。本實驗室將 HLA-DRA 與結(jié)核抗原肽的融合基因以及 HLA-DRB 基因共轉(zhuǎn)染果蠅 S2 細(xì)胞，使用不同的結(jié)核抗原肽和不同的 HLA-DRB 等位基因構(gòu)建多種膜表達結(jié)核抗原肽/HLA-DR 復(fù)合物的細(xì)胞株，即人工 APC，模擬 MHC-抗原肽分子模型。S2 細(xì)胞本身不會與 TCR 四聚體發(fā)生交叉反應(yīng)，只是利用其能共轉(zhuǎn)染多個重組質(zhì)粒并高表達的特點建立表達模型，避免了用人體細(xì)胞作為表達系統(tǒng)可能產(chǎn)生的非特異結(jié)合反應(yīng)。人工 APC 上重組的結(jié)核抗原肽/HLA-DR 復(fù)合物可用作 TCR 的配體，能夠被用來檢測已制備好的 TCR 四聚體能否與結(jié)核抗原肽/HLA-DR 復(fù)合物特異性結(jié)合、分析與不同的結(jié)核多肽以及不同的 HLA-DRB 基因型背景的細(xì)胞株是否具有不同的結(jié)合力，從而證明 TCR 四聚體是否具有特異性以及 HLA 限制性情況。

1 材料與方法

1.1 材料

果蠅 S2 細(xì)胞株購于美國 Invitrogen 公司；膜表面表達不同HLA-DR 等位基因/抗原肽的 S2 細(xì)胞株、共表達 CD4+α/β TCR 雙鏈單體、生物素化酶、潮霉素 B 抗性基因的 S2 恒定細(xì)胞株由本課題組提供。

1.2 方法

1.2.1 結(jié)核特異性 CD4+α/β TCR 單體的復(fù)蘇、誘導(dǎo)表達及純化 復(fù)蘇穩(wěn)定轉(zhuǎn)染有 pMT-TCRα、pMT-TCRβ、pMT/Bip-BirA 和潮霉素篩選質(zhì)粒的果蠅 S2 恒定細(xì)胞株，在 28 ℃無 CO2培養(yǎng)箱中大量培養(yǎng)至800 ml左右，加 CuSO4（終濃度500 μmol/L）進行誘導(dǎo)表達，同時加入生物素（終濃度為 1 μg/ml）使表達蛋白生物素化。誘導(dǎo) 72 h 后，離心收集培養(yǎng)上清，加入胃蛋白酶抑制劑（終濃度 1 mmol/L）和苯甲基磺酰氟（PMSF）（終濃度1 μg/ml）抑制蛋白降解；以 12% PEG-6000 沉淀蛋白。沉淀以結(jié)合緩沖液（10 mmol/L 咪唑-PBS，pH 8.0）重懸后上 Ni-NTA 層析柱，再以洗滌緩沖液（20 mmol/L 咪唑-PBS）洗滌，然后用洗脫緩沖液（250 mmol/L 咪唑-PBS）洗脫，洗脫液用 30 kD 超濾管離心濃縮并以 PBS 交換液體。

1.2.2 斑點印跡實驗鑒定 TCR 單體蛋白 將適當(dāng)大小的 PVDF 膜于甲醇中浸泡 5 min 后，轉(zhuǎn)入去離子水中浸泡 5 min 取出，將膜晾至半干。用加樣槍吸取 20 μl 蛋白洗脫液，或 5 μl 蛋白濃縮液用 PBS 稀釋至 20 μl 點在膜上，待其吸收完全時，將膜置入 5% 的脫脂奶粉中，4 ℃封閉過夜。PBST 洗后，將膜轉(zhuǎn)入一抗鼠抗人α/β TCR 抗體（1:3000 稀釋）中，4 ℃過夜。PBST 洗后，室溫孵育堿性磷酸酶（AP）標(biāo)記的二抗羊抗鼠-IgG（1:3000 稀釋）2 h，PBS 洗 3 次，每次5 min。加顯色底物 NBT/BCIP 混合液（10 ml 顯色液中加入 66 μl NBT 混勻后，再加入 33 μl BCIP)，室溫孵育約 15 min，以去離子水沖洗終止反應(yīng)，觀察顯色結(jié)果。

1.2.3 SDS-PAGE 電泳鑒定 CD4+α/β TCR 雙鏈單體蛋白 取蛋白樣本（CD4+α/β TCR 雙鏈單體）20 μl 與 5 × 上樣緩沖液混勻，100 ℃加熱 5 min 使蛋白變性，上樣電泳。穩(wěn)壓 100 V，待指示劑到達分離膠底部，停止電泳。取出凝膠，去除濃縮膠，往分離膠中加入考馬斯亮藍染液染色 5 min。倒掉染液，用脫色液浸泡分離膠，間隔換液洗滌至蛋白條帶清晰，背景無色，觀察記錄結(jié)果。

1.2.4 CD4+α/β TCR 四聚體的制備 將純化的 CD4+α/β TCR 雙鏈單體與 PE 標(biāo)記的鏈霉親和素按摩爾比 8:1 混合，室溫孵育 30 min（PE 標(biāo)記的鏈霉親和素每隔 5 min，分 8 次加入），制備好后于 4 ℃避光保存。

1.2.5 應(yīng)用人工 APC 對 CD4+α/β TCR 四聚體 6M、6N 等的染色和流式檢測 將每 106個膜表達重組的結(jié)核抗原肽/HLA-DR 復(fù)合物（未誘導(dǎo)表達和 CuSO4誘導(dǎo)表達后）的人工 APC 和終濃度 5 μg/ml 的親和素共孵育從而阻斷內(nèi)源性生物素；細(xì)胞洗 2 次后加入 PE 標(biāo)記的 CD4+α/β TCR 四聚體和 FITC 標(biāo)記的抗人 HLA-DR（L243）染色，4 ℃孵育 20 min；PBS 洗滌 3 次后用 300 μl 2% 多聚甲醛重懸細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測。為了進一步證實 TCR 四聚體 6M、6N 與人工 APC 之間的結(jié)合是特異性結(jié)合，將只表達 HLA-DR 而不表達結(jié)核抗原肽的 S2 細(xì)胞株與結(jié)核多肽 E6、E7、C5、C14 在 28 ℃共孵育 2 h，用腫瘤多肽作為對照，然后用 PE 標(biāo)記的 TCR 四聚體（6M和 6N）以及 FITC 標(biāo)記的 L243 染色，流式細(xì)胞儀檢測。該方法建立后同樣的處理方式對實驗室已構(gòu)建的 9 個CD4+α/β TCR 四聚體（eu、6M、6N、6j、6p、A、B、C、D）進行篩選、鑒定。

2 結(jié)果

2.1 純化 CD4+ α/β TCR 雙鏈單體的斑點印跡實驗鑒定

取 20 μl 蛋白過柱液、洗脫液或蛋白濃縮液點膜，用抗 α/β TCR 抗體作為一抗檢測洗脫情況。圖 1 結(jié)果顯示誘導(dǎo)表達后獲取的蛋白洗脫液或蛋白濃縮液內(nèi)均分別含有相應(yīng)的CD4+α/β TCR 雙鏈復(fù)合物單體（6N 和 6M）。

1 2 3 4 5 6

Figure 1 The Dot blot results of CD4+α/β TCR monomers 6M and 6N

2.2 純化 CD4+ α/β TCR 雙鏈單體的 SDS-PAGE 鑒定

將純化過程中PEG-6000沉淀后上清，10mmol/L咪唑-PBS 過柱液、20 mmol/L 咪唑-PBS 洗滌液以及 250 mmol/L 咪唑-PBS 洗脫液進行SDS-PAGE。由于分泌表達的 TCR 雙鏈通過末端的 Fos 和 Jun 片段共價連接形成異二聚體，SDS-PAGE 時不解鏈，為 60 kD 左右。結(jié)果顯示 PEG 沉淀后上清無蛋白條帶，而 10、20、250 mmol/L 咪唑-PBS 的液體中均有 60 kD 目的條帶，但前兩者的液體中含有大量雜帶，而 250 mmol/L 咪唑-PBS 的洗脫液目標(biāo)條帶清晰，雜帶少。因此，以 10、20、250 mmol/L 咪唑-PBS 分別作為上樣液、洗滌液和洗脫液是合適的。

2.3 應(yīng)用膜表達結(jié)核抗原肽/HLA-DR 細(xì)胞株對四聚體 6M、6N 的流式檢測結(jié)果

TCR 與 MHC-肽的識別及結(jié)合具有特異性和限制性。將待測 PE 標(biāo)記的CD4+α/β TCR 四聚體 6M、6N 與細(xì)胞膜表面表達重組的結(jié)核抗原肽/HLA-DR 復(fù)合物的 S2 細(xì)胞株共孵育，如果待檢 TCR 四聚體為 MTB 特異性 CD4+α/β TCR 四聚體、同時 α 鏈與 β 鏈間配對較佳，該 TCR 四聚體將與 S2 細(xì)胞膜上結(jié)核抗原肽/HLA-DR 復(fù)合物結(jié)合識別，通過流式細(xì)胞術(shù)檢出其特異性強弱與配對情況；同時配合與 L243-FITC 共孵育，則可以觀察結(jié)核抗原肽/HLA-DR 復(fù)合物表達的強弱。通過未誘導(dǎo)表達和 CuSO4誘導(dǎo)表達后的兩組數(shù)據(jù)比較分析，不同組合表達的特異性結(jié)核抗原肽/HLA-DR 復(fù)合物 2# 和 5# S2 細(xì)胞株 CuSO4誘導(dǎo)表達后 FITC-L243 的陽性率均比未誘導(dǎo)前有所增加，說明結(jié)核抗原肽/HLA-DR 復(fù)合物誘導(dǎo)后表達增強，同時 PE-TCR 四聚體的陽性結(jié)合率也有所提高，表明 TCR 四聚體 6M、6N 均為結(jié)核特異性的 CD4+α/β TCR 四聚體。結(jié)果如表 1 所示。其中表達結(jié)核抗原肽 C5/HLA-DRB1*0404 的 2# S2 細(xì)胞株對 6M、6N 同時識別 L243-FITC 和 PE-TCR 四聚體的比例分別達 1.73% 和 5.93%（圖 2）。

表 1 膜表達結(jié)核抗原肽/HLA DR S2 細(xì)胞株對CD4+ α/β TCR 四聚體 6M和 6N 的流式細(xì)胞檢測結(jié)果

TCR-PE L243-FITCAL243-FITCB TCR-PE L243-FITCCL243-FITCD

Figure 2 MTB-specific CD4+α/β TCR tetramers detection with No. 2 cell strain

四聚體 6MTCR tetramer 6M 四聚體 6NTCR tetramer 6N 四聚體陽性細(xì)胞百分率（%）Positive rate of TCR tetramers (%) 6.00 3.00 0.00 6.00 3.00 0.00 多肽 PeptideNone腫瘤多肽Tumor peptideC5C14E6E7 DRB1* DRB1* DRB1* DRB1*1504 08032 090102 1503 DRB1* DRB1* DRB1* DRB1* 1504 08032 090102 1503 細(xì)胞株 HLA-DRB1 等位基因HLA-DRB1 alleles of S2 cell strains

Figure 3 Results of CD4+α/β TCR tetramers 6M, 6N with S2 cell strains expressed only HLA-DR and MTB peptide together by flow cytometry

2.4 應(yīng)用無多肽的膜表達細(xì)胞株與結(jié)核多肽共孵育對 6M、6N 的流式檢測結(jié)果

將僅表達 HLA-DR 而不表達結(jié)核抗原肽的 S2 細(xì)胞株與結(jié)核多肽 E6、E7、C5、C14 共孵育，用腫瘤多肽作為對照，流式染色后上機檢測。流式分析結(jié)果顯示僅表達 HLA-DR 而不表達結(jié)核抗原肽的 S2 細(xì)胞株和對照腫瘤多肽組低背景染色，結(jié)核抗原肽孵育后，一些人工 APC 的四聚體陽性結(jié)合率有所提高。其中，以 TCR 四聚體 6M、6N 分別染色E7/DRB1*1504 和 C5/DRB1*090102 細(xì)胞株時，四聚體陽性結(jié)合率顯著增高（圖 3）。

2.5 應(yīng)用 8 株人工 APC 細(xì)胞株對 9 個 CD4+ α/β TCR 四聚體的篩選結(jié)果

用 PE 標(biāo)記已構(gòu)建的 9 個 CD4+α/β TCR 四聚體（即四聚體 eu、6M、6N、6j、6p、A、B、C、D）、FITC 標(biāo)記的抗 L243 抗體分別與 8 株膜表面表達結(jié)核抗原肽/HLA-DR 的S2 細(xì)胞株共孵育，流式細(xì)胞技術(shù)從中篩選出結(jié)核特異性 CD4+α/β 四聚體，8 株膜表達結(jié)核抗原肽/HLA-DR S2 恒定細(xì)胞株的組成見表 2。

流式分析結(jié)果顯示 9 個四聚體均與 2# 細(xì)胞株（C5/HLA-DRB1*0404）有較高的陽性結(jié)合率，且四聚體 6p 與 20# 細(xì)胞株（C5/HLA-DRB1* 150101），四聚體 6j 與 5# 細(xì)胞株（E7/HLA- DRB1*0404）也有較高的陽性結(jié)合率，結(jié)果見圖 4。由此說明本實驗室已構(gòu)建的9 個四聚體均為結(jié)核特異性 CD4+α/β TCR 四聚體。

表 2 8 株膜表達結(jié)核抗原肽/HLA-DRS2 細(xì)胞株的組成

3 討論

結(jié)核抗原特異性 T 細(xì)胞活性的檢測是了解機體的免疫狀態(tài)和疾病轉(zhuǎn)歸的重要方法之一。人們致力于體外制備 MHC-肽復(fù)合物以及模擬 APC 特異性靶細(xì)胞表面 MHC 遞呈的多肽復(fù)合物，直接檢測能與之特異性結(jié)合的 T 細(xì)胞。但 TCR 與 MHC-肽復(fù)合物的特異性結(jié)合存在親和力低、容易解離以及半衰期短等問題[3-4]，而不能直接用于檢測抗原特異性細(xì)胞。研究表明單聚體多聚化能提高作用物的親和力[5]。目前，肽/MHC Class I 四聚體已被廣泛用于分析 CD8+T 細(xì)胞在抗病毒[6]、抗腫瘤[7]和自身免疫病[8]中的作用。除本實驗室的研究外，只有一篇關(guān)于 α/β TCR 四聚體的文獻，即 Subbramanian 等[9]構(gòu)建出對特定的多肽（SIV 多肽）有特異性的 α/β TCR 四聚體。TCR 四聚體是利用 MHC 四聚體技術(shù)通過類似的方法制備而成。但是由于 TCR 是細(xì)胞膜表面分子，構(gòu)建有功能的可溶性 TCR 四聚體會有非常多的困難。首先，最主要的技術(shù)難題在于缺乏跨膜區(qū)的錨定點，僅依賴 TCR α/β 鏈間的二硫鍵 TCR 異二聚體難以維持穩(wěn)定；其次，TCR-MHC/肽天然反應(yīng)親和力低，解離迅速；第三，自然條件下，T 細(xì)胞上的 TCR 識別 APC 上 MHC 遞呈的抗原，需要細(xì)胞表面表達的 CD4 或者 CD8 分子等一系列分子的輔助。之前也沒有人構(gòu)建過結(jié)核特異性 α/β TCR 四聚體，同時，高特異性和高親和力的結(jié)核特異性 TCR 四聚體篩選、鑒定較困難。本實驗室參照科學(xué)家們設(shè)計的多種解決方案成功構(gòu)建了結(jié)核特異性 CD4+α/β TCR 四聚體。本研究中，我們應(yīng)用多種膜表達結(jié)核抗原肽/HLA-DR 復(fù)合物果蠅 S2 細(xì)胞株，用于檢測已構(gòu)建好的 α/β TCR 四聚體是否具有結(jié)核特異性，從中篩選出高特異性和高親和力的 CD4+α/β TCR 四聚體用于后續(xù)研究。

圖 4 應(yīng)用8 株膜表達結(jié)核抗原肽/HLA-DR S2 細(xì)胞株對實驗室已構(gòu)建的9 個CD4+ α/β TCR 四聚體的流式分析結(jié)果

Figure 4 Screening results of 9 CD4+TCR tetramers with 8 membrane expressing MTB antigen peptide/HLA-DR S2 cell strains by flow cytometry

1992 年，Jackson 等[10]報道了 MHC 基因可以成功轉(zhuǎn)染果蠅細(xì)胞并可在昆蟲細(xì)胞表面表達。在此基礎(chǔ)上，Sakita 等[11]在 1996 年研究了用 MHC Class I 類分子轉(zhuǎn)染的昆蟲細(xì)胞可作為 APCs 的方法。有研究者對這一方法進行了擴展，通過對 T2 和昆蟲細(xì)胞 S2、Sf9 作為 APC 的比較，提出用昆蟲細(xì)胞作為APCs 比自身的 APCs 更具敏感性和特異性[12]。本研究采用的果蠅 S2 細(xì)胞外源蛋白表達系統(tǒng)，結(jié)合了昆蟲細(xì)胞高水平表達和哺乳動物細(xì)胞穩(wěn)定表達的優(yōu)點，非常適合低消耗而高水平的表達真核細(xì)胞蛋白。

應(yīng)用膜表達結(jié)核抗原肽/HLA-DR 細(xì)胞株對結(jié)核特異性 CD4+α/β TCR 四聚體的流式檢測結(jié)果顯示，TCR 四聚體能與 MTB 特異性多肽結(jié)合，但不同的 TCR 四聚體與不同的特異性多肽和不同的 HLA-DR 結(jié)合能力有較大差異。兩種四聚體（6M和 6N）均不與尚未誘導(dǎo)的細(xì)胞株以及僅表達 HLA-DR 而不表達結(jié)核抗原肽的 S2 細(xì)胞株結(jié)合，但細(xì)胞株與結(jié)核多肽（E6、E7、C5、C14）共孵育后對 6M、6N 的流式檢測結(jié)果顯示，一些人工 APC 的四聚體陽性結(jié)合率得到提高。上述結(jié)核抗原肽為我們在前期的研究工作，是針對我國活動性結(jié)核患者篩選獲得的 CD4+T 細(xì)胞反應(yīng)性多肽，來自于 MTB 蛋白質(zhì) ESAT-6 或CFP-10[13-14]。ESAT-6 和 CFP-10 僅存在于致病性結(jié)核菌，而不存在于卡介苗（BCG）及其他非結(jié)核分枝桿菌（環(huán)境分枝桿菌）[15]。這些結(jié)果均說明應(yīng)用膜表達結(jié)核抗原肽/HLA-DR 細(xì)胞株篩選結(jié)核特異性 CD4+α/β TCR 四聚體的方法是可行的。本研究應(yīng)用此種方法對實驗室已構(gòu)建的 9 個 CD4+α/β TCR 四聚體進行篩選，流式分析結(jié)果顯示 9 個四聚體均與 2# 細(xì)胞株（C5/HLA-DRB1*0404）有較高的陽性結(jié)合率，提示 9 個四聚體均為結(jié)核特異性 CD4+α/β TCR 四聚體。

在后續(xù)的研究中我們以篩選出來的結(jié)核特異性較好的 CD4+α/β TCR 四聚體應(yīng)用于臨床標(biāo)本的檢測分析。將 PE 標(biāo)記的 CD4+α/β TCR 四聚體、抗 CD14-FITC 抗體與結(jié)核患者及對照人群（包括非結(jié)核患者組、健康對照組及臍帶血組）的外周血單個核細(xì)胞共孵育，以流式細(xì)胞術(shù)定量檢測 TCR 四聚體及抗 CD14-FITC 染色雙陽性的抗原特異性單核-巨噬細(xì)胞（APC）百分?jǐn)?shù)。通過比較結(jié)核患者組及對照組 APC 的陽性率，進一步證實了篩選出來的四聚體的特異性；這些四聚體可應(yīng)用于結(jié)核患者治療前與治療過程中 APC 水平變化的監(jiān)測等[16]。

TCR 四聚體技術(shù)作為一種新的研究細(xì)胞免疫的方法，具有特異性結(jié)合，可定性、定量進行檢測等特點，具有廣闊的應(yīng)用前景。而膜表達重組結(jié)核抗原肽/HLA-DR 復(fù)合物的細(xì)胞株能被用來檢測 TCR 四聚體的特異性和親和力，有助于從中篩選出高特異性和高親和力的TCR 四聚體，獲得的四聚體可為目前結(jié)核與潛伏結(jié)核臨床實驗診斷、療效監(jiān)測手段等方面存在的局限性提供可能的補充解決方法，也為 T 細(xì)胞和抗原遞呈細(xì)胞間相互作用以及結(jié)核細(xì)胞免疫方面的研究提供新的研究方法和數(shù)據(jù)。

[1] Chen Y, Ren LL, Dong T, et al. Construction and application of cell fines screening Mycobacterium tuberculosis-specific tetramers of CD4+α/β T cell receptor. Chin J Microbiol Immunol, 2009, 29(3):271- 275. (in Chinese)

陳伊, 任亮亮, 董濤, 等.結(jié)核分枝桿菌特異性CD4+α/β T細(xì)胞受體四聚體篩選細(xì)胞系的構(gòu)建及檢測. 中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志, 2009, 29(3):271-275.

[2] Cooper AM. Cell-mediated immune responses in tuberculosis. Annu Rev Immunol, 2009, 27:393-422.

[3] Corr M, Slanetz AE, Boyd LF, et al. T cell receptor-MHC class I peptide interactions: affinity, kinetics, and specificity. Science, 1994, 265(5174):946-949.

[4] Weber S, Traunecker A, Oliveri F, et al. Specific low-affinity recognition of major histocompatibility complex plus peptide by soluble T cell receptor. Nature, 1992, 356(6372):793-796.

[5] Altman JD, Moss PA, Goulder PJ, et al. Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes. Science, 1996, 274(5248):94-96.

[6] Radaelli A, Nacsa J, Tsai WP, et al. Prior DNA immunization enhances immune response to dominant and subdominant viral epitopes induced by a fowlpox-based SIVmac vaccine in long-term slow-progressor macaques infected with SIVmac251. Virology, 2003, 312(1):181-195.

[7] Vonderheide RH, Domchek SM, Schultze JL, et al. Vaccination of cancer patients against telomerase induces functional antitumor CD8+ T lymphocytes. Clin Cancer Res, 2004, 10(3):828-839.

[8] Kosor E, Gagro A, Drazenovic V, et al. MHC tetramers: tracking specific immunity. Acta Med Croatica, 2003, 57(4):255-259.

[9] Subbramanian RA, Moriya C, Martin KL, et al. Engineered T-cell receptor tetramers bind MHC-peptide complexes with high affinity. Nat Biotechnol, 2004, 22(11):1429-1434.

[10] Jackson MR, Song ES, Yang Y, et al. Empty and peptide-containing conformers of class I major histocompatibility complex molecules expressed in Drosophila melanogaster cells. Proc Natl Acad Sci U S A, 1992, 89(24):12117-12121.

[11] Sakita I, Horig H, Sun R, et al. In vivo CTL immunity can be elicited by in vitro reconstituted MHC/peptide complex. Immunol Methods, 1996, 192(1-2):105-115.

[12] Janetzki S, Song P, Gupta V, et al. Insect cells as HLA-restricted antigen-presenting cells for the IFN-gamma elispot assay. J Immunol Methods, 2000, 234(1-2):1-12.

[13] Yang FF, Tu ZQ, Fang YM, et al. Monitoring of peptide-specific and gamma interferon-productive T cells in patients with active and convalescent tuberculosis using an enzyme-linked immunosorbent spot assay. Clin Vaccine Immunol, 2012, 19(3):401-410.

[14] Li Y, Zhu Y, Zhou L, et al. Use of HLA-DR*08032/E7 and HLA-DR*0818/E7 tetramers in tracking of epitope-specific CD4+ T cells in active and convalescent tuberculosis patients compared with control donors. Immunobiology, 2011, 216(8):947-960.

[15] van Pinxteren LA, Ravn P, Agger EM, et al. Diagnosis of tuberculosis based on the two specific antigens ESAT-6 and CFP10. Clin Diagn Lab Immunol, 2000, 7(2):155-160.

[16] Huang Y, Huang Y, Fang Y, et al. Relatively low level of antigen-specific monocytes detected in blood from untreated tuberculosis patients using CD4+ T-cell receptor tetramers. PLoS Pathog, 2012, 8(11):e1003036.

Establishment and application of cell strains to screen specific CD4+α/β TCR tetramers

YAO Ya-nan, HUANG Yu-hong, WANG Juan, CHEN Yi, REN Liang-liang, LAI Xiao-min

To screen and identify MTB antigen-specific CD4+α/β TCR tetramers using different membrane expressing MTB antigen peptide/HLA-DR complex cell strains (artificial APCs).

PE labeled CD4+α/β TCR tetramers and FITC labeled anti-HLA-DR antibody (L243) were incubated with membrane expressing MTB antigen peptide/HLA-DR cell strains (before and after induction) or S2 cell strains expressing only HLA-DR or HLA-DR binding with MTB peptides E6, E7, C5, C14 or tumor peptide respectively, and then different binding capacity of TCR tetramers were detect and analyzed by flow cytometry.

Both TCR tetramers 6M and 6N showed a high positive rate with No. 2 cell strain (C5/HLA-DRB1*0404, 1.73% and 5.93% respectively). After incubation with MTB peptide, the percentage of tetramer positive rate increased in some of the artificial APCs, and high affinity was observed between all of the nine TCR tetramers and No. 2 cell strain respectively.

Membrane expressing MTB antigen peptide/HLA-DR complex cell strains could be used to screen and identify MTB-specific CD4+α/β TCR tetramers, and all of the nine tested TCR tetramers are MTB-specific.

Mycobacterium tuberculosis peptide; HLA-DR; Artificial APCs; CD4+T cell; TCR tetramer

LAI Xiao-min, Email: laixm@mail.sysu.edu.cn

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2014.02.002

國家自然科學(xué)基金面上項目（81271779）；“十二五”國家科技重大專項傳染病防治專項(2012ZX10004903-004-002）

賴小敏，Email：laixm@mail.sysu.edu.cn

2013-11-13

Author Affiliations: Department of Microbiology, Zhongshan School of Medicine, Sun Yat-sen University, Ministry of Education Key Laboratory of Tropical Disease Control, Guangdong Provincial Department of Education Key Laboratory of Functional Molecules from Marine Microorganisms, Guangdong Provincial Research Center for Severe Infectious Disease Prevention and Control Technology, Guangzhou 510080, China