中藥注射液體外腎細胞毒性評價的方法學探討

阮浩瀾等

[摘要] 目的 研究柴胡注射液和丹參注射液在犬腎近端小管上皮細胞（MDCK細胞）和人胚腎細胞（HEK-293細胞）模型的毒性作用，并探討中藥注射液體外腎細胞毒性檢測的實驗方法。 方法 選用馬兜鈴酸A作為陽性對照，將不同廠家和批次的丹參注射液、柴胡注射液的原液及稀釋液，與MDCK細胞或HEK-293細胞共同孵育，通過四甲基偶氮唑鹽比色法（MTT法）量化細胞毒性，計算相對增殖率，進行中藥注射液體外腎細胞毒性評價。 結果 在MDCK細胞模型中，兩批丹參注射4個液稀釋濃度下毒性分級顯示為0級，一批稀釋9、27、81倍后顯示為0級，柴胡注射液稀釋27、81倍后顯示為0級；在HEK-293細胞模型中，一批丹參注射液4個稀釋濃度下毒性分級顯示為1級，一批稀釋9、27、81倍后顯示為1級，一批稀釋27、81倍后顯示為1級；柴胡注射液稀釋27、81倍后顯示為2級。 結論 利用腎臟細胞來源的細胞，可嘗試建立中藥注射液體外腎細胞毒性檢測的實驗方法。

[關鍵詞] 中藥注射液；腎；細胞毒性；四甲基偶氮唑鹽比色法

[中圖分類號] R285.1 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2014）09（a）-0011-04

[Abstract] Objective To study the cytotoxicity of Salvia Injection and Bupleurum Injection in MDCK cells and HEK-293 cells and discuss the applicability of these experimental methods. Methods Aristolochic acid A was selected as a positive control drug. MDCK cells and HEK-293 cells were incubated with different concentrations of Salvia Injection or Bupleurum Injection. Then cytotoxicity was evaluated with MTT assay and relative growth rate （RGR） was calculated. Results In MDCK cell model， the RGR from two batches of Salvia Injection were shown as Class 0 after diluting 4 levels and one was shown as Class 0 after diluting 9， 27， 81 times. The RGR of Bupleurum Injection was shown as Class 0 after diluting 27， 81 times. Meanwhile， in HEK-293 cell model， the RGR from one batch of Salvia Injection was shown as Class 1 after diluting 4 levels. One batch of Salvia Injection was shown as Class 1 after diluting 9， 27， 81 times. One was shown as Class 1 after diluting 27， 81 times. The RGR of Bupleurum Injection was shown as Class 2 after diluting 27， 81 times. Conclusion The use of kidney-derived cells can help to establish experimental methods to test the Chinese medicine injection nephrotoxicity.

[Key words] Chinese medicine injection； Kidney； Cell toxicity； MTT assay

中藥所致的腎臟損害在世界范圍內日益受到重視，目前顯示許多中藥具有腎毒性作用[1]，中藥腎毒性已經嚴重制約了中藥在臨床上的使用。中藥注射液大部分都是經血管給藥，其對腎臟損害的風險性更應提高警惕，如穿心蓮內酯注射液已發現可導致患者急性腎損害[2]。因此，建立一個快捷有效的中藥注射液腎毒性評價方法具有重要的意義。

目前體外細胞毒性試驗廣泛應用于生物材料、醫療器械和藥品包裝材料的毒性研究[3-5]，可以對受試物潛在的細胞毒性進行檢測。在中藥注射液方面，有研究選用小鼠成纖維細胞（L929細胞）進行體外細胞毒性的分析[6-7]，但用腎臟來源的細胞進行中藥注射液的腎毒性體外評價的研究少見報道。本研究選用來源于腎臟的犬腎近端小管上皮細胞（MDCK細胞）和人胚腎細胞（HEK-293細胞），參考中藥注射液在L929細胞毒性檢測的四甲基偶氮唑鹽比色法 （MTT法）[6]，考察中藥注射液對MDCK細胞和HEK-293細胞的體外細胞毒性作用，對建立基于MDCK細胞或HEK-293細胞的中藥注射液體外腎細胞毒性模型進行探討。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

柴胡注射液（廣東羅浮山國藥股份有限公司，批號L13C302），丹參注射液（廣東遠大藥業有限公司，批號130501、130502、130503）。馬兜鈴酸A（中國藥品生物制品檢定所，批號110746-200406）。馬兜鈴酸A用二甲基亞砜（DMSO，終濃度為0.5%）溶解，配成100 μmol/mL儲存液。實驗時，用DMEM培養液稀釋至實驗濃度。DMEM培養液（GIBCO公司），胎牛血清（浙江天杭生物科技有限公司）。胰酶（吉諾生物醫藥技術有限公司）。乳酸脫氫酶試劑盒（南京建成生物工程研究所）。其他試劑為國產分析純試劑。