三氧化二砷聯合順鉑抑制C6膠質瘤細胞增殖的實驗研究

王志剛，鐘根深，馬鵬舉，岳雙柱，周國勝

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三氧化二砷聯合順鉑抑制C6膠質瘤細胞增殖的實驗研究

王志剛，鐘根深，馬鵬舉，岳雙柱，周國勝

453100 河南衛輝，新鄉醫學院第一附屬醫院神經外科/河南省神經病學研究所

探討三氧化二砷（As2O3）聯合順鉑（CDDP）抑制 C6 神經膠質瘤細胞增殖情況及其分子機制。

體外實驗采用 MTT 法檢測對 C6 神經膠質瘤細胞的抑制率，流式細胞法檢測 C6 膠質瘤細胞的凋亡及周期，Western blot 檢測 caspase-3、PTEN、PI3K、Akt 蛋白表達水平；體內實驗采用免疫組化法檢測 caspase-3、IκB-α 調控因子的表達，并觀察大鼠的生存情況。

As2O3、CDDP 及聯合應用分別作用于 C6 神經膠質瘤細胞 24 h 后的細胞增殖最大抑制率分別為 34.37%、31.73% 和 76.40%，其相應藥物濃度分別為 12.5、10.0、（12.5 + 10.0）μmol/L；兩者聯用后對 C6 膠質瘤細胞作用 24 h 后的凋亡率分別為從單獨用藥時的（4.60 ± 1.12）%、（14.59 ± 0.79）% 提高到（36.13 ± 1.55）%；采用 PI 單染檢測的細胞周期也進一步證明了聯合用藥增加了 C6 細胞的周期抑制作用。Caspase-3、PTEN 蛋白在聯合組 C6 膠質瘤細胞中表達顯著上調，而 PI3K、Akt 蛋白在聯合組C6 膠質瘤細胞中表達下調；免疫組化法檢測結果顯示，caspase-3 調控因子在聯合組用藥的 C6 膠質瘤細胞中的表達上調，而IκB-α 調控因子表達下調；但體內實驗表明，在 18 d 觀察期內各組大鼠的生存期無明顯差異（= 0.2531）。

As2O3聯合 CDDP 通過上調 caspase-3 和 PTEN，下調 PI3K、Akt 及IκB-α 抑制膠質瘤細胞體內外的生長。

順鉑； 神經膠質瘤； 細胞凋亡； 三氧化二砷； 藥物療法，聯合

惡性腫瘤的術后化療可以阻滯腫瘤細胞的生長、侵襲及擴散，進而提高患者的生活質量，延長患者的生存期。近年來研究發現，As2O3不僅對急性早幼粒細胞白血病有很好療效，而且對實體腫瘤，如胃癌、肺癌、肝癌、前列腺癌、乳腺癌等也顯現了一定的抗腫瘤效果[1-5]。另有研究表明，As2O3與順鉑（CDDP）聯合應用，在不增加 CDDP 對腎毒性作用情況下，還能提高 CDDP 的化療效果[6-7]。同時亦有研究發現，As2O3脂質體可使更多的 As2O3通過血腦屏障，誘導腦膠質瘤細胞凋亡，并具有明顯的劑量-時間依賴性關系[8]。CDDP 在膠質瘤的化療中應用較為廣泛，本研究欲通過 As2O3與 CDDP 聯合應用的體外、體內實驗，來探討臨床 As2O3與 CDDP 聯合應用治療腦膠質瘤的可行性及其可能的機制；并探討中西藥結合治療腦膠質瘤的優勢。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株及實驗動物 C6 膠質瘤細胞由河南省神經病學研究所提供，常規傳代培養；雌性SD 大鼠，體重 150 ~ 200 g，購自河南省實驗動物中心，許可證編號：SCXK（京）2013-0001，普通環境飼養。

1.1.2 主要藥物和試劑 As2O3、CDDP（20061001）為云南生物谷燈盞花藥業有限公司產品；caspase-3、IκB-α、PTEN、PI3K、Akt 單克隆抗體及 ABC 免疫組織化學試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司；BCA 蛋白定量試劑盒及定影液、顯影液購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.1.3 主要儀器 Multiskan MK3 酶標儀由美國 Thermo Electron 公司生產；BM-IX 生物組織包埋機由孝感醫療器械公司生產；HI122 型烤片機由德國 Leica Microsystem Nussloch 公司生產；江灣I 型腦立體定向儀為第二軍醫大學生產。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養及處理 C6 膠質瘤細胞常規傳代培養，取對數生長期的細胞以 5 × 103個/孔接種于 96 孔板中。分為 4 組：①對照組；②As2O3組；③CDDP 組；④As2O3+ CDDP 組。CDDP 濃度分別為 10、5、2.5 μmol/L，As2O3濃度為 12.5、6.25 和 3.125 μmol/L。對照組加入無藥物的 RPMI 1640 細胞培養液，終體積為 0.2 ml/孔。培養 24 h 后，加入 MTT（5 mg/ml）溶液 20 μl，于細胞培養箱中繼續培養 4 h。取出后，將培養液丟棄，加入150 μl 二甲基亞砜，置水平搖床振蕩 20 min 后，酶標儀上測定570。兩藥聯合指數（CI）根據文獻[9-10]計算，公式為：

1.2.2 流式細胞術測定細胞周期和凋亡 取對數生長期細胞，以 5 × 104個/孔接種于 6 孔板中，分為 4 組：①對照組；②As2O3組（12.5 μmol/L）；③CDDP 組（10 μmol/L）；④As2O3+ CDDP[（12.5 + 10）μmol/L]聯用組。加入藥物后，繼續培養 24 h，收集各組細胞于 1.5 ml EP 管中，其中檢測細胞周期的細胞采用預冷的 70%乙醇固定，4 ℃碘化丙啶（PI）染色 30 min，過濾，以流式細胞儀及 ModFit 分析軟件檢測細胞周期；檢測細胞凋亡的細胞不固定，采用 Annexin V/PI 雙染試劑盒，按試劑盒說明書檢測細胞凋亡。每組實驗重復 3 次。

1.2.3 Western blot 實驗 按照 BCA 蛋白定量試劑盒說明書進行蛋白提取。caspase-3、PTEN、PI3K 和 Akt 抗體使用時按照 1:500 進行稀釋，同時 4 ℃孵育過夜。蛋白電泳（10% 的SDS- PAGE）進行相關抗體的電泳實驗。

1.2.4 SD 大鼠 C6 膠質瘤模型的建立 10% 水合氯醛（3.0 ml/kg）麻醉 SD 大鼠，固定在腦立體定向儀上，選取對數生長期的 C6 膠質瘤細胞制備成單細胞懸液，接種至大鼠右側尾狀核區（前囟中點旁 3 mm，冠狀縫前 1 mm），接種細胞數為 5 × 105個，共 15 μl，速度為 1 μl/min，注射完畢留針 5 min，緩慢拔針，骨蠟封閉骨孔，消毒，縫合皮膚[11-12]。

1.2.5 動物分組治療及病理檢測 大鼠經 Gd-DTPA 強化 MRI 掃描檢測成瘤后，隨機分4 組，每組 10 只大鼠：①對照組，0.9%氯化鈉溶液腹腔注射 1 mg/kg；②As2O3組，腹腔注射 As2O31 mg/kg；③CDDP 組，腹腔注射 CDDP1 mg/kg；④As2O3+ CDDP 組，腹腔注射 CDDP 和 As2O3均為 1 mg/kg。連續給藥 7 d 后，每組處死 4 只大鼠，取出腦組織，切取含瘤灶部位 4 mm 厚組織，福爾馬林溶液固定，石蠟包埋，4 μm 厚連續切片，用于免疫組織化學檢測。

1.2.6 免疫組織化學分析 采用 ABC 免疫組織化學法，按照檢測試劑盒說明書進行。200 倍視野下，隨機選取 10 個視野（high power field，hpf），計數 800 ~ 1000 個細胞中陽性細胞百分比（%/hpf）。IκB-α 陽性表達定位于細胞核或細胞質，呈棕黃色或棕褐色顆粒沉著；caspase-3 陽性表達定位于細胞質，呈棕黃色顆粒沉著。

1.2.7 生存分析 根據剩余大鼠死亡情況，采用 Graphpad prism 5 軟件作 Kaplan-Meier 生存分析。

1.3 統計學處理

2 結果

2.1 對 C6 膠質瘤細胞的抑制作用

各實驗組（不包括對照組）24 h 后對 C6 膠質瘤細胞均有抑制作用，且具有較明顯的劑量－時效關系，抑制作用隨著藥物濃度的提高及作用時間的延長而增強；同時從實驗結果中能夠觀測到各濃度 As2O3與 CDDP 聯合用藥對 C6 膠質瘤細胞的生長抑制明顯增強（< 0.05）。如圖 1 所示，不同濃度聯合用藥時，CI 值分別為 0.59、0.67 和 0.95，說明 CDDP 和 As2O3在高、中濃度聯合用藥組對腦膠質瘤細胞的生長抑制率增加更為明顯，具有較好的協同作用。

抑制率（%）Inhibition rate (%)1009080706050403020100 CDDP 10 5 2.5 As2O3 12.5 6.25 3.125 藥物濃度（μmol/L）Drug concentration (μmol/L)

Figure 1 Inhibition efficiency of CDDP, As2O3and their combination on proliferation of glioma cell line C6 (*< 0.05)

2.2 對 C6 膠質瘤細胞凋亡及周期的影響

通過 MTT 法我們測得CDDP、As2O3及聯合用藥對 C6 膠質瘤細胞抑制率最高的藥物濃度。根據 CI 值，選擇 CDDP 10 μmol/L 和 As2O312.5 μmol/L 作為細胞凋亡和周期時的藥物濃度，作用于 C6 膠質瘤細胞并測得其凋亡及周期曲線（圖2 和圖3）。

圖 2 不同藥物對C6 膠質瘤細胞凋亡的影響

Figure 2 Effect of CDDP, As2O3and their combinationon apoptosis of glioma cell line C6

圖 3 不同藥物對C6 膠質瘤細胞周期的影響

Figure 3 Effect of CDDP, As2O3and their combinationon cell cycle distribution of glioma cell line C6

由圖 2 可知，采用 PI/Annexin V 雙染的方法檢測細胞凋亡，結果表明As2O3、CDDP 及聯合應用對 C6 膠質瘤細胞作用 24 h 后的凋亡率分別從單獨用藥時的（4.60 ± 1.12）%、（14.59 ± 0.79）% 增加到（36.13 ± 1.55）%。聯用組能夠明顯促進 C6 膠質瘤細胞凋亡，與 CDDP 或者 As2O3單獨用藥相比，差異具有統計學意義（< 0.05）。在采用 PI 單染的情況下檢測細胞周期，由圖 3 可知，聯用組能夠顯著阻止 C6 膠質瘤細胞周期停在 G2/S 期，導致亞 G1 峰的細胞碎片大量增加，說明聯合后能夠增強細胞增殖抑制的效果。

2.3 Western blot 檢測蛋白表達

Western blot 結果顯示，caspase-3、PTEN 蛋白在聯用組表達明顯上調，而 PI3K、Akt 蛋白在聯用組則表達量明顯下降（圖 4）。

對照組 As2O3 CDDP As2O3 +Control CDDPkD Pro-Caspase-3Caspase-3 PTEN PI3K Akt β-actin 321712 54 85 60 42

Figure 4 Effect of CDDP, As2O3and their combination on caspase-3, PTEN, PI3K, Akt protein expression in glioma cell line C6

2.4 免疫組化檢測 IκB-α 在 C6 膠質瘤細胞中的表達

采用免疫組織化學法檢測了 IκB-α 的表達，以腫瘤細胞中見淡黃色至棕黃色者為陽性細胞，顯微鏡下觀察結果表明，IκB-α 在聯用組 C6 膠質瘤細胞中表達明顯減少，且表達的 C6 膠質瘤細胞數目較少（圖 5）。

2.5 大鼠生活狀態觀察和生存分析

對照組大部分大鼠精神較差，飲食量明顯較其他各實驗組差，活動遲緩，行走旋轉，皮膚毛發紊亂潮濕，接種側眼球突出并見球結膜充血水腫，整體大鼠呈消瘦狀態，隨著時間的推移，在第 18 天時對照組大鼠全部死亡。As2O3及CDDP 組的大鼠生活情況較對照組稍好。聯合組用藥后的大鼠精神較用藥前明顯改善，飲食量尚可，四肢活動無明顯旋轉運動，皮膚毛發清潔干燥，接種腫瘤側的眼球無明顯突出，未見球結膜充血水腫，體型正常，隨著時間的推移，大鼠死亡數量較對照組少。腫瘤接種后 1 周內各組大鼠死亡數目相差不多，但隨著用藥后，各組之間大鼠死亡數有一定差異，在第 18 天時對照組全部死亡，CDDP 組和 As2O3組各還有 2 只存活，聯合組有 4 只存活。但在 18 d 的觀察期內，雖然各組大鼠死亡數目不同，但 Kaplan-Meier 分析結果顯示，各組之間差異并不顯著（= 0.2531）（圖 6）。

IκB-α 陽性率（%/hpf）IκB-α positive ratio (%/hpf)0.04 0.03 0.02 0.01 0 對照組 As2O3 CDDP As2O3 +Control CDDPE

A：對照組；B：As2O3組；C：CDDP 組；D：As2O3+ CDDP 組；E：各組藥物作用膠質瘤細胞后 IκB-α 表達的定量分析；**與對照組相比，< 0.05；△△與 As2O3和 CDDP 組相比，< 0.05。

A: Control group; B: As2O3group;C: CDDP group; D: As2O3+ CDDP group; E: Quantitative analysis of various drugson IκB-α expression in glioma cell;**Compared with control group,< 0.05;△△Compared with As2O3and CDDP group,< 0.05.

圖 5 免疫組化分析 CDDP 和As2O3對膠質瘤細胞 IκB-α 的表達影響（200 ×）

Figure 5 Effects ofCDDP and As2O3on IκB-α expression in glioma cell as determined byimmunohistochemical staining (200 ×)

存活率（%）Percent survival (%)100 80 60 40 20 0 5 10 15 20 時間（d）Time (d)

Figure 6 Various experimental group of rats survival curve

3 討論

膠質瘤是顱內常見的惡性腫瘤，早期診斷困難，治愈率低，具有高復發率、高致殘率、高死亡率的特點[13]。目前主要通過手術治療，并聯合化療、放療減少腫瘤的復發及轉移，但其治愈率仍較低，為此需尋找新的治療藥物。As2O3是中藥砒霜的主要成分，近些年來用于臨床治療急性早幼粒細胞白血病，同時對實體瘤也有明顯療效，但 As2O3的毒副作用較大，治療劑量和致死劑量很接近[14-15]。CDDP是臨床上常用的抗癌藥物，其療效呈劑量相關性，但大劑量可引起不可逆性腎功能損害及嚴重的胃腸道反應，從而限制了臨床應用[16-17]。任何抗癌藥單獨應用，療效總是有限的，過分提高藥物劑量或藥物濃度，都會明顯地增加毒性，因此臨床上主張聯合用藥，以便提高療效、降低毒性、延緩或防止耐藥。

腫瘤的發生與正常細胞內抑癌基因和癌基因的平衡失調有關。Caspase-3 是一種重要的細胞促凋亡因子，在正常細胞內通過級聯反應而使細胞凋亡，也可通過水解蛋白質導致細胞解體，最終形成凋亡小體[4]。在腫瘤治療過程中，caspase-3 蛋白表達上調，或者說 pro-caspase-3 切割的增加，常意味著細胞凋亡的增加。PTEN 基因是膠質瘤的抑癌基因，PTEN 蛋白的正常表達可抑制腫瘤的發生。在人腦膠質瘤中，PTEN 基因常發生突變或缺失，導致腫瘤的發生[18]。相關研究表明，As2O3與CDDP 聯合應用在體內外實驗中可抑制腫瘤細胞的生長發育。主要機制為阻滯細胞周期[19]、誘導腫瘤細胞的凋亡[20-21]及誘導腫瘤細胞的分化。本研究結果顯示，As2O3與 CDDP 聯合應用可上調 C6 膠質瘤細胞中 caspase-3 和 PTEN 蛋白的表達，進而誘導 C6 膠質瘤細胞的凋亡。PI3K-Akt 信號通路可調節腫瘤細胞的增殖和存活[22]。其主要機制是 PI3K 可使 Akt 活化，而活化的 Akt 通過磷酸化作用激活或抑制其下游靶蛋白 caspase3、IκB-α、p27 等，進而調節細胞的增殖、分化、凋亡等。PI3K-Akt 信號通路的活性可以被類脂磷酸酶 PTEN 負調節[23]。本實驗結果顯示，對照組中 PI3K/Akt 蛋白表達顯著，而聯合用藥組 PI3K/Akt 蛋白表達減低，說明 As2O3與 CDDP 聯合應用可破壞 PI3K-Akt 信號通路導致腫瘤細胞凋亡的增加，也可能是 As2O3與 CDDP 聯合應用上調 PTEN 蛋白的表達而起到負性調節 PI3K-Akt 信號通路的作用，進而抑制腫瘤細胞的增殖。IκB-α 與腫瘤細胞的生長、增殖和浸潤、轉移的關系密切，還能調控腫瘤細胞的凋亡和免疫活性[24-25]。本實驗結果顯示，As2O3與 CDDP 聯合應用可使 IκB-α 的表達減少。IκB-α 表達下調，常意味著 NF-κB p65 亞基的釋放，導致 p65 蛋白轉移入核，誘導相關抗凋亡基因的表達，從而對抗 As2O3與 CDDP 誘導的凋亡作用。因此，在 As2O3與 CDDP 誘導細胞凋亡過程中，IκB-α 在其中所扮演的作用可能是多方面的，其作用機制可能還需進一步研究。

本實驗可得出以下結論：①As2O3、CDDP 對腦膠質瘤細胞有一定抑制作用，尤其是兩者聯合使用效果更加明顯；②As2O3與 CDDP 聯合使用可通過提高 caspase3、PTEN 的表達，抑制或降低 IκB-α、PI3K/Akt 的表達來調節腦膠質瘤細胞凋亡及周期阻滯。因此，As2O3與 CDDP 聯合使用可影響腦膠質瘤細胞的增殖。

雖然本實驗體外結果證明了 As2O3與 CDDP 聯合可促進腦膠質瘤細胞的凋亡，抑制其生長，阻滯其細胞周期的循環，體內實驗表明可提高大鼠的存活率，但本實驗因觀察時間有限（僅 18 d），實驗結果經統計分析表明兩者聯用并不能有效地延長大鼠的生存期，這也指導我們在臨床化療過程中，如遇到膠質瘤晚期患者，在可預測的生存期有限的情況下，如何合理選擇兩藥聯用，需要仔細斟酌，以便獲得最佳的臨床療效，讓患者最大獲益。

[1] Doyle D. Notoriety to respectability: a short history of arsenic prior to present day use in haematology. Br J Haematology, 2009, 145(3):309- 317.

[2] Akao Y, Mizoguchi H, Kojima S, et al. Arsenic induces apoptosis in B-cell leukaemic cell lines in vitro: activation of caspases and down-regulation of Bcl-2 protein. Br J Haematol, 1998, 102(4):1055- 1060.

[3] Zheng CY, Lam SK, Li YY, et al. Combination of arsenic trioxide and chemotherapy in small cell lung cancer. Lung Cancer, 2013, 82(2): 222-230.

[4] Li X, Ding X, A drian TE. Arsenic trioxide induces apoptosis in pancreatic cancer cells via changes in cell cycle, caspase activation, and GADD expression. Pancreas, 2003, 27(2):174-179.

[5] Chou WC, Chen HY, Yu SL, et al. Arsenic suppresses gene expression in promyelocytic leukemia cells partly through Sp1 oxidation. Blood, 2005, 106(1):304-310.

[6] Cao HX, Xia W, Shen Q, et al. Mechanism of differentiation and apoptosis in acute promyelocytic leukemia cells by JWA involving in retinoic acid, 12-o-tetradecanoylphorbol-13-acetate and arsenic trioxide. Chin Sci Bull, 2001, 46(23):1979-1983. (in Chinese)

曹海霞, 夏薇, 沈群, 等. JWA參與維甲酸、佛波酯和三氧化二砷誘導急性早幼粒細胞性白血病細胞分化和凋亡的可能機制. 科學通報, 2001, 46(23):1979-1983.

[7] Huang JY, Cai H, Huang JL. Effect of arsenic trioxide used in combination with cisplatin in inhibiting mice transplantation tumor and its effect on kidney. Jiangsu J Traditional Chin Med, 2006, 27(6): 57-59. (in Chinese)

黃建元, 蔡橫, 黃金玲. 三氧化二砷聯合順鉑對小鼠移植性腫瘤的抑制作用及其對腎功能的影響. 江蘇中醫藥, 2006, 27(6):57-59.

[8] Zhang X, Zhao SG, Ren Y, et al. Preparation and effects of arsenic trioxide liposome on glioma cell apoptosis in rats. Chin J Minimally Invasive Neurosurg, 2007, 12(6):269-272. (in Chinese)

張旭, 趙世光, 任穎, 等. 三氧化二砷脂質體的制備及其對鼠腦膠質瘤的影響. 中國微侵襲神經外科雜志, 2007, 12(6):269-272.

[9] Romanelli S, Perego P, Pratesi G, et al. In vitro and in vivo interaction between cisplatin and topotecan in ovarian carcinoma systems. Cancer Chemother Pharmacol, 1998, 41(5):385-390.

[10] Mai Z, Blackbrun GL, Zhou JR. Soy phytochemicals synergistically enhance the preventive effect of tamoxifen on the growth of estrogen-dependent human breast carcinoma in mice. Carcinogenesis, 2007, 28(6):1217-1223.

[11] Morreale VM, Herman BH, Der-Minassian V, et al. A brain-tumor model utilizing stereotacic implantation of a permanent cannula.J Neurosurg, 1993, 78(6):959-965.

[12] De Ridder L. Behaviour of gliomas in vitro vs histopathological grading. Int J Devl Neuroscience, 1999, 17(5-6):541-546.

[13] Hadziahmetovic M, Shirai K, Chakravarti A. Recent advancements in multimodality treatment of gliomas. Future Oncol, 201l, 7(10):1169- 1183.

[14] Kanzawa T, Kondo Y, Ito H, et al. Induction of autophagic cell death in malignant glioma cells by arsenic trioxide. Cancer Res, 2003, 63(9):2103-2108.

[15] Carré M, Carles G, André N, et al. Involvement of microtubules and mitochondria in the antagonism of arsenic trioxide on paclitaxel- induced apoptosis. Biochem Pharmacol, 2002, 63(10):1831-1842.

[16] Lane DP. Cancer. A death in the life of p53. Nature, 1993, 362(6423): 786-787.

[17] Hall AG, Tillby MJ. Mechanisms of action, and modes of resistance to, alkylating agents used in the treatment of hematological malignancies. Blood Rev, 1992, 6(3):163-173.

[18] Weng LP, Smith WM, Dahia PL, et al. PTEN suppresses breast cancer cell growth by phosphatase activity dependent G1 arrest followed by cell death. Cancer Res, 1999, 59(22):5808-5814.

[19] Seol JG, Park WH, Kim ES, et al. Effect of arsenic trioxide on cell cycle arrest in head and neck cancer cell line PCI-1. Biochem Biophys Res Commun, 1999, 265(2):400-404.

[20] Desagher S, Martinou JC. Mitochondria as the central control point of apoptosis. Trends Cell Biol, 2000, 10(9):369-377.

[21] Green DR, Kroemer G. The pathophysiology of mitochondrial cell death. Science, 2004, 305(5684):626-629.

[22] Vivanco I, Sawyers CL. The phosphatidylinositol 3-Kinase AKT pathway in human cancer. Nat Rev Cancer, 2002, 2(7):489-501.

[23] Jimenez C, Jones DR, Rodríguez-Viciana P, et a1. Identification and characterization of a new oncogene derived from the regulatory subunit of phosphoinositide 3-kinase. EMBO J, 1998, 17(3):743-753.

[24] Tang WZ, Xia YJ. Expression of nuclear factor-kappaBP65 in human brain glioma and human brain metastatic carcinoma and its significance. J First Mil Med Univ, 2004, 24(1):75-78. (in Chinese)

唐萬忠, 夏玉軍. 人腦膠質瘤與人腦轉移瘤中NF-κBP65的表達及意義. 第一軍醫大學學報, 2004, 24(1):75-78.

[25] Nagai S, Washiyama K, Kurimoto M, et al. Aberrant nuclear factor-kappaB activity and its participation in the growth of human malignant astrocytoma. J Neurosurg, 2002, 96(5):909-917.

Effect of arsenic trioxide in combination with cisplatin on the proliferation of glioma C6 cells

WANG Zhi-gang, ZHONG Gen-shen, MA Peng-ju, YUE Shuang-zhu, ZHOU Guo-sheng

To investigate the effects of arsenic trioxide in combination with cisplatin on the proliferation of glioma cells C6.

In theexperiment, the proliferation inhibition of glioma cell line C6 was assessed by MTT assay, and the cell cycle distribution and apoptosis ratio of the cells were detected by flow cytometry. The expression levels of caspase-3, PTEN, PI3K and Akt were examined by Western blot. In theexperiment, the expression levels of caspase-3 and IκB-α were measured by immunohistochemical methods, and the rats’ life span was observed.

At the dosage of 12.5 μmol/L of As2O3and 10.0 μmol/L of CDDP, the proliferation inhibitory ratios of As2O3, CDDP and co-treatment group on glioma cell line C6 after 24 hours were 34.37%, 31.73% and 76.40%, respectively. Correspondingly, the apoptosis ratios after 24 hours were (4.60 ± 1.12)%, (14.59 ± 0.79)% and (36.13 ± 1.55)% respectively. Apoptosis induction was also proved by FACS using PI-stained method. The expression levels of caspase-3 and PTEN were up-regulated, while the expression levels of PI3K and Akt were down-regulated in the co-treatment group. Forexperiment, the expression of caspase-3 was up-regulated and IκB-α was down-regulated in the co-treatment group. However, the rats’ survival rate in different treatment groups was similar in the limited observation time (= 0.2531).

As2O3combined with CDDP has potent inhibitory action on glioma cells proliferation through up-regulating caspase-3 and PTEN and down-regulating PI3K, Akt and IκB-α expression levels.

Cisplatin; Glioma cell; Apoptosis; Arsenic trioxide; Drug therapy, combination

ZHOU Guo-sheng, Email: 745772199@qq.com; ZHONG Gen-shen, Email: genshenzhong@163.com

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2014.03.002

國家自然科學基金青年科學基金（81201765）；河南省衛生科技創新型人才工程（4160）

周國勝，Email：745772199@qq.com；鐘根深，Email：genshenzhong@163.com

2013-12-31

Author Affiliation: The Institute of Neurology, Department of Neurosurgery, The First Affiliated Hospital of Xinxiang Medical University, 453100 Henan Weihui, China