鮭魚降鈣素新型注射用溫度敏感原位凝膠系統的構建及評價

丁維明，李艷芳，李桂玲

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鮭魚降鈣素新型注射用溫度敏感原位凝膠系統的構建及評價

丁維明，李艷芳，李桂玲

100050 北京，中國醫學科學院北京協和醫學院醫藥生物技術研究所制劑室（丁維明、李桂玲）；100191 北京大學第三醫院中心實驗室（李艷芳）

構建鮭魚降鈣素新型注射用溫度敏感原位凝膠系統并對其膠凝特性和降血鈣效應進行評價。

以泊洛沙姆 F127 為主要基質材料，復合使用泊洛沙姆 F68，制備鮭魚降鈣素注射用溫度敏感原位凝膠給藥系統，以膠凝溫度、膠凝時間、流變學、質構特性為考察指標，對該凝膠系統性質進行評價；采用大鼠眼眶取血，鈣顯色法監測體內血清鈣離子濃度，對該凝膠系統降血鈣效應進行研究。

所制備的鮭魚降鈣素注射用溫度敏感原位凝膠的膠凝溫度為（35.3 ± 1.3）℃，膠凝時間為（108.3 ± 5.5）s，在 25 ℃條件下為流動的液體，原位凝膠的黏度和黏滯力極低，方便注射給藥，當溫度增至 37 ℃時能夠迅速發生相轉變，黏度和黏滯力等質構特性數據顯著增加，成為具有一定膠凝強度的半固體；大鼠降血鈣效應結果顯示，該給藥系統具有明顯的緩釋作用，其 24 h 時血鈣濃度明顯低于普通注射劑組，相對于普通注射劑的藥理活性為 138.6%。

溫度敏感原位凝膠用于鮭魚降鈣素的注射給藥，是一種很有潛力的遞送系統。

降鈣素； 泊洛沙姆； 溫度敏感原位凝膠

鮭魚降鈣素（salmon calcitonin，sCT）是由32 個氨基酸組成的活性肽，可維持血中鈣離子平衡和抑制破骨細胞活性，從而對有效降低血鈣和促進骨骼對鈣的吸收起著關鍵作用[1]，具有作用穩定、副作用小等特點，在臨床上廣泛應用于預防和治療骨質疏松、骨折、變形性骨炎、高血鈣等多種疾病[2-3]。然而，sCT 生物半衰期較短，需反復給藥，不利于骨質疏松患者的長期治療，因此，sCT 的緩釋制劑受到廣泛關注。

溫度敏感原位凝膠是指高分子材料以溶液狀態給藥后，利用材料受熱反向膠凝的性質，在用藥部位對溫度刺激產生響應，發生分散狀態或構象的可逆轉化，形成半固體狀的藥物儲庫[4]。該給藥系統有諸多優點，如分劑量準確、給藥方便、緩釋或控釋性、定位靶向性、增加藥物穩定性、提高藥物生物利用度等。注射用溫度敏感原位凝膠近年來研究較多，它是將可注射用的高分子材料及其他適宜輔料制成溫度敏感原位凝膠，以液體狀態局部注射于人體內部，在注射部位膠凝形成三維網狀結構的半固體狀藥物儲庫，隨材料的不斷溶蝕、降解而釋放藥物，達到長期緩釋的目的。其載體材料的選擇至關重要[5]。溫度敏感型非離子表面活性劑泊洛沙姆 F127 對某些難溶性藥物有很好的溶解性，系統載藥量充足，體內可降解，生物相容性好，且其非特異性抗黏附特性可阻止蛋白和細菌附著，從而有效防止感染發生，是一種優良的溫敏載體材料[6-7]。

為延長 sCT 作用時間、提高療效、降低給藥次數以提高患者順應性，本文以泊洛沙姆F127 為主要基質材料，復合使用泊洛沙姆 F68，制備了 sCT 注射用溫度敏感原位凝膠制劑。對該凝膠系統的膠凝溫度與膠凝時間、流變學特性、質構特性以及大鼠局部注射給藥后的釋放和降血鈣效應進行了研究，為蛋白多肽類藥物選擇可注射緩釋給藥系統提供了依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 鮭魚降鈣素由上海延長生化公司提供；泊洛沙姆 F127 和 F68 由德國 BASF 公司提供；其他試劑均為分析純。

1.1.2 儀器 RCT basic 加熱磁力攪拌器購自德國 Ika 公司；黏度計、TC-502D 恒溫水浴、R/S+ 流變儀及 CT3 質構分析儀均購自美國 Brookfield 公司；E200 恒溫水浴購自德國 Lauda公司。

1.1.3 實驗動物 SD 雄性大鼠 15 只，體重180 ~ 210 g，合格證號：SYXK（京）2011-0039，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 sCT 溫度敏感原位凝膠的制備 稱取處方量的sCT，加入注射用水使溶解并制成 10 μg/ml 的溶液，然后向其中加入處方量的泊洛沙姆 F127 和 F68，磁力攪拌使其分散均勻，然后于 4 ℃條件下冷藏放置 24 h，使充分溶脹，得到無色澄明的溶液，過 0.22 μm 微孔濾膜，即得。

1.2.2 膠凝溫度與膠凝時間的考察 采用轉子法測定體系的膠凝溫度[8]。將樣品置加熱磁力攪拌器中，自室溫開始，控制升溫速度 0.5 ℃/min，同時以 1.5 cm × 0.6 cm 磁性轉子攪拌，速率 100 r/min，磁性轉子完全停止轉動時的溫度即為膠凝溫度；將樣品置 37 ℃恒溫水浴中，仍采用上述轉子和攪拌速度，記錄磁性轉子完全停止轉動所用時間，即為膠凝時間。

1.2.3 流變學特性考察 采用R/S+ 流變儀（恒溫水浴控溫）考察體系的流變學特性。分別考察25 ℃和 37 ℃恒溫條件下剪切力隨剪切速率變化的規律，并繪制流變曲線。

1.2.4 質構特性考察 將樣品于37 ℃恒溫條件下放置約 30 min，待其充分膠凝后，以 CT3 質構分析儀測定其膠凝強度和黏附性能[9]。測定條件為：探頭模具 TA5，觸發點負載 0.2 g，預測試速度2 mm/s，測試速度 0.5 mm/s，返回速度 0.5 mm/s，穿透距離 10 mm。

1.2.5 大鼠降血鈣效應的研究[10]取 SD 雄性大鼠隨機分為 3 組，每組 5 只，分別作為空白對照組、sCT 普通注射液組和 sCT 注射用溫度敏感原位凝膠組。給藥途徑為皮下注射。兩個給藥組 sCT 的劑量均為 5.0 μg/kg，空白對照組給予等體積的生理鹽水，實驗前 12 h 禁食，可自由飲水。給藥前自大鼠眼眶取血約 0.5 ml 作為對照，給藥后分別于 0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 及 8.0 h 自大鼠眼眶取血 0.5 ml，6149 ×離心 15 min，取血清，按文獻[11-12]方法測定血鈣濃度：

⑴試液配制：按文獻方法，分別配制鈣儲備液（1.0 × 103μg/ml 鈣離子溶液）、鄰甲酚酞絡合劑（OCPC）試液（OCPC 32.5 mg、8-羥喹啉 1.1 g、濃鹽酸 7.5 ml，以去離子水稀釋至 500 ml）、二乙胺試液（二乙胺42 ml，以去離子水稀釋至1000 ml）。量取 OCPC 試液、二乙胺試液、甲醇，按 3:3:2 比例配成鈣顯色液，超聲混合 5 min（臨用前配制，室溫避光放置 1 h 后使用）。

⑵標準曲線繪制：精密吸取上述鈣儲備液 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 ml，分別置 25 ml量瓶中，以去離子水稀釋至刻度，制得 40、80、120、160、200 及 240 μg/ml 的系列濃度鈣標準溶液，分別吸取 40 μl，向其中加入鈣顯色液 5 ml，混合均勻后立即于 570 nm 波長處測定吸收度。以鈣離子濃度（）對吸收度值（）進行線性回歸。

⑶回收率與精密度：分別吸取 40、80 及120 μg/ml 的鈣標準溶液 40 μl，向其中加入大鼠空白血清 40 μl，然后按“標準曲線繪制”項下方法處理并測定 570 nm 波長處吸收度值，于 1 d 內重復測定 6 次，計算回收率和日內差。

⑷大鼠血清中鈣離子濃度測定：吸取大鼠血清樣品每份 40 μl，加入鈣顯色劑 5 ml，混合均勻后，立即于 570 nm 波長處測定其吸收度值。以標準曲線方程計算血清鈣離子濃度。

⑸數據處理：以給藥前大鼠血清鈣離子濃度作為 100%，各時間點降血鈣百分率計算公式為：

降血鈣百分率 F（%）=T/0× 100%

T和0分別為 T 時間及給藥前的大鼠血清鈣離子濃度。以降血鈣百分率（F%）對時間（T）作圖，得降血鈣百分率-時間曲線。以梯形法計算曲線上面積AAC0 ~ 24 h。相對藥理活性 RPA 由下述公式計算：

1.3 統計學處理

采用 SPSS13.0 統計學軟件進行數據分析，各組間比較采用檢驗，以< 0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 處方優化

參考本課題組以前在溫度敏感原位凝膠方面的研究工作結果[13]，初步確定 sCT 溫度敏感原位凝膠的基本處方組成為泊洛沙姆 F127（約 20%）及泊洛沙姆 F68（約 1.2%）。之前的原位凝膠基質中還加入了羥丙基甲基纖維素 K4M（HPMC K4M），以調節膠凝溫度和凝膠強度，但 HPMC 的溶脹需要加熱且過程緩慢，因此凝膠制備需要較長時間，而 sCT 為多肽類藥物，熱穩定性不佳，且長時間放置也不利于其穩定，因此本處方組成中去掉 HPMC K4M，通過調節泊洛沙姆 F127 和 F68 的濃度來調節合適的膠凝溫度。經處方篩選，得到最佳處方組成為：泊洛沙姆 F127 濃度19%，泊洛沙姆 F68 濃度 1.6%。

2.2 膠凝溫度

以轉子法測定 sCT 溫度敏感原位凝膠的膠凝溫度為（35.3 ± 1.3）℃，該膠凝溫度可較好地滿足以液體狀態局部注射給藥和在體迅速膠凝的要求。

2.3 膠凝時間

以轉子法測定 sCT 溫度敏感原位凝膠的膠凝時間為（108.3 ± 5.5）s。說明該原位凝膠局部注射后 2 min 以內即可于給藥部位形成凝膠，有利于其緩釋效果的發揮。

2.4 流變學特性

按最優化處方制備的 sCT 溫度敏感原位凝膠，其流變學曲線見圖 1。由圖可見，在 25 ℃（室溫）條件下原位凝膠的剪切力與切變速率呈線性關系，即黏度不隨切變速率改變而改變，表明此溫度下的原位凝膠具備牛頓流體特性，流動性好，便于制備和轉移、吸取、注射等操作，容器殘留量小。而當溫度升至37 ℃（體溫）時，黏度迅速增至很高，其流變曲線存在一屈服值，提示進入體內的凝膠不會因運動或體位變化產生凝膠的擠壓與摩擦而發生流動，容易保持一定形狀，作為凝膠貯庫，有利于緩釋效果的發揮。

2.5 質構特性

本研究中，按最優化處方制備的 sCT 溫度敏感原位凝膠質構特性考察結果見圖 2 和表 1。測定參數定義如下：硬度：第 1 個壓縮循環的正峰峰值；凝膠強度：壓縮總正峰面積；黏性：壓縮的負峰面積，代表探頭從樣品中離開時的難易程度；黏滯力：第 1 次壓縮負峰的峰值。由表 1 結果可知，在 25 ℃條件下，原位凝膠的黏性和黏滯力極低，表明其具備溶液的特性，而基本不表現凝膠的特性；當溫度增至 37 ℃時，所有質構特性數據顯著增加，表明該溫度下形成了具有較高凝膠強度和黏性的凝膠，推測其不易迅速被體液溶蝕，而能在一段較長的時間內保持半固體狀態，發揮凝膠骨架的作用，緩慢釋放其中所包載的藥物。

圖 1 鮭魚降鈣素溫度敏感原位凝膠的流變學曲線

Figure 1 Rheogram of thermosensitivegel loading salmon calcitonin

2.6 降血鈣效應

2.6.1 標準曲線的制作及回收率與精密度考察 以鈣離子濃度（）對吸收度值（）進行線性回歸得標準曲線方程為= 0.0026+ 0.0312（2= 0.9981）；平均回收率為（98.4 ± 2.6）%、（99.4 ± 1.5）% 和（98.6 ± 2.5）%，日內差 RSD 為 2.6%、1.5% 和 2.5%。

2.6.2 大鼠降血鈣效應 由圖 3 可見，sCT 普通注射液組 1 h 時血鈣濃度明顯下降，3 h 時血鈣濃度達最低值，隨后血鈣濃度隨時間迅速回升；而溫敏原位凝膠組血鈣濃度下降速率比普通注射液組低，其谷濃度顯著高于普通注射液組（< 0.01），表明其最大降血鈣能力相對較弱，這可能與原位凝膠中藥物初始釋放速率低于普通注射液有關。但溫敏原位凝膠組的血鈣濃度回升速度比注射劑緩慢，在 6 h 和 8 h 產生顯著性差異（< 0.05），且其24 h 時血鈣濃度明顯低于注射劑組，最終計算出溫敏原位凝膠組相對于普通注射劑組的相對藥理活性為 138.6%。結果表明，溫敏原位凝膠制劑維持降血鈣的作用時間長于普通注射劑，具有較好的緩釋效果，與普通注射液相比，可獲得更加平緩且持久的降血鈣效應。

圖 2 鮭魚降鈣素溫度敏感原位凝膠不同溫度下的質構特性曲線（A：25 ℃；B：37 ℃）

Figure 2 Texture profiling of thermosensitivegel loading salmon calcitonin at different temperatures (A: 25 ℃; B: 37 ℃)

圖 3 鮭魚降鈣素普通注射液組及溫度敏感原位凝膠組大鼠單劑量給藥（5.0 μg/kg）后的血鈣水平曲線（與普通注射劑組相比，*P < 0.05；**P < 0.01；nsP > 0.05）

Figure 3 Serum calcium level profiles after S.C. administration of salmon calcitonin (sCT) injection andgel to rats at a single dose of 5.0 μg/kg (n = 5) (Compared with sCT injection,*< 0.05;**< 0.01;ns> 0.05)

3 討論

膠凝溫度是衡量溫度敏感原位凝膠系統是否構建成功的關鍵指標之一。膠凝溫度是否適宜需從兩方面綜合考慮：在體外正常貯存條件下應為流動性較好的液體，以方便給藥和分劑量準確；而在體溫下又能夠迅速形成具有足夠膠凝強度的凝膠。溫敏原位凝膠的膠凝溫度 T 以略低于體溫（30 ~36 ℃）為宜。若 T 過低，則室溫較高時可能發生膠凝，從而給凝膠的制備和使用帶來困難；T 過高，則無法保證在體溫條件形成凝膠，或形成凝膠的速度過慢、強度過低等，從而導致緩釋效果不理想。單純泊洛沙姆 F127 水溶液的 T 偏低；泊洛沙姆 F68 本身不具有受熱反向膠凝性質，但 F68 的加入可顯著升高 F127 溶液的 T 值。因此，本文將泊洛沙姆 F127 與 F68 復合使用作為溫敏凝膠的載體材料，以調節適宜的膠凝溫度。泊洛沙姆 F127 是最常用的溫度敏感原位凝膠載體材料，當其濃度達 18% 以上時，才會出現受熱反向膠凝的現象，濃度進一步增加，可以提高其凝膠強度，從而提高緩釋效果。制劑中常用的 F127 濃度為 15% ~ 25%。文獻報道泊洛沙姆的毒性很低，因其易溶于水，生物相容性也大大優于不溶性的緩釋凝膠基質[14-15]。本文制劑中使用的泊洛沙姆 F127 濃度為 19%，推測其安全性和生物相容性良好。

測定膠凝時間的目的是考察溫敏原位凝膠在人體平均溫度下，從溶液狀態轉變為凝膠狀態所需要的時間。理想的注射用溫敏原位凝膠，在以溶液狀態進入人體后，應能夠迅速于給藥部位（原位）膠凝，形成半固體藥物儲庫。因此，膠凝時間越短越好。如果膠凝時間過長，則凝膠形成過程太慢，給藥后一段時間內，系統在給藥部位仍以液體狀態存在，往往會產生較為嚴重的初始突釋效應。由于試驗所測得的膠凝時間較短，且測定溫度的差異也會對膠凝時間產生影響，因此，為盡可能減小測量誤差，不同凝膠樣品測定前的起始溫度應一致，恒溫時應保持相同溫度，計時方法也應相同。

流變學特性是原位凝膠非常重要的評價指標[16]。對于注射用溫敏原位凝膠，希望其在體外時黏度較低，為流動性很好的液體，用細小針頭就能順利注射；而在體溫下黏度迅速增加，形成凝膠。本文所制備的 sCT 溫敏原位凝膠能夠較好地符合這一要求。目前，對注射用溫敏原位凝膠的黏度范圍尚無統一規定，根據經驗，溶液能夠被順利注射，且能夠有效形成凝膠即可。但隨著注射用溫敏原位凝膠研究的深入，必將會建立起統一的黏度范圍標準。

在大鼠血清鈣離子濃度測定試驗中，血液中存在的鎂離子可能干擾試驗結果，本文通過加入 8-羥喹啉的方法來掩蔽鎂離子的影響。干擾試驗表明，按照文中的 8-羥喹啉加入量，鎂離子的干擾可完全被掩蔽，測定結果不受鎂離子的影響。另外，動物試驗中，空白對照組（注射生理鹽水）的大鼠血鈣濃度也有一定波動，是因為血液中的鈣是內源性物質，鈣離子濃度隨時間波動屬動物的正常生理現象，該波動幅度較小，不影響對制劑降血鈣效應的測定和評價。

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Preparation and characterization of a novel injectable thermosensitivegel containing salmon calcitonin

DING Wei-ming, LI Yan-fang, LI Gui-ling

To prepare the thermosensitivegel of salmon calcitonin for injection and evaluate the characteristics and hypocalcemic effect.

Poloxamer F127 and poloxamer F68 were used to prepare the thermosensitive gel of samon calcitonin. The characteristics of the gel, such as gelation temperature, gelation time, rheological behavior and texture characteristics, were evaluated. Blood samples were drawn from orbit in rats, and coloration methods were used to monitor serum calcium ion concentration in order to studydrug release and the hypocalcemic effect.

The gelation temperature of the salmon calcitonin-loadedgel was (35.3 ± 1.3)℃, and the gelation time was (108.3 ± 5.5) s. Thegel, a fluid solution at 25 ℃, became semisolid quickly at 37 ℃ due to the fact the viscosity and mechanical parameters such as gel strength for gel was enhanced at 37 ℃. Thegel loading sCT clearly decreased serum calcium level in rats over a longer period of time as compared with the conventional injection indicating sustained characteristic, and produced 138.6% hypocalcemic efficacy relative to common injection.

The thermosensitivegel delivery system may be a promising candidate for injectable sustained delivery of salmon calcitonin.

Calcitonin; Poloxamer; Thermosensitive in situ gel

LI Gui-ling, Email: liguiling1999@163.com

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2014.03.007

“重大新藥創制”國家科技重大專項（2012ZX09301002-001）

李桂玲，Email：liguiling1999@163.com

2013-12-02

Author Affiliations:Formulation Laboratory, Institute of Medicinal Biotechnology, Chinese Academy of Medical Science & Peking Union Medical College, Beijing 100050, China (DING Wei-ming, LI Gui-ling); Medical Research Center, Peking University Third Hospital, Beijing 100191, China (LI Yan-fang)