抗人甲胎蛋白單克隆抗體的制備及雙抗體夾心ELISA檢測技術的建立

孫一帆，楊全利，黃建芳，趙鳳芝，向軍儉

?

抗人甲胎蛋白單克隆抗體的制備及雙抗體夾心ELISA檢測技術的建立

孫一帆，楊全利，黃建芳，趙鳳芝，向軍儉

510632 廣州，廣東省分子免疫與抗體工程重點實驗室/暨南大學抗體工程研究中心

制備、篩選多株具有商用價值的可配對的高特異性、高親和力的抗人甲胎蛋白（hAFP）單克隆抗體，初步建立雙抗體夾心 ELISA 檢測方法。

通過經典的淋巴細胞雜交瘤技術篩選分泌抗 hAFP 單抗的雜交瘤細胞株；對篩選所得單抗的特性進行鑒定分析；雙抗體夾心 ELISA 法篩選最佳配對抗體；初步建立 DAS-ELISA 檢測方法并檢測血樣，繪制其標準檢測曲線并與進口試劑盒比較。

共獲得 12 株穩定分泌抗 hAFP 單抗的雜交瘤細胞株，其中 Ab 1 ~ Ab 5 5 株單抗的腹水效價均高于 600 萬，Ab 5 的效價高達 3000 萬；特異性鑒定結果表明 Ab 1 ~ Ab 5 均能夠特異識別天然 hAFP 分子，但 Ab 5 與人血清白蛋白（HSA）存在較強交叉反應；抗體配對實驗共篩選出 5 對（Ab 1/HRP-Ab 2、Ab 1/HRP-Ab 4、Ab 3/HRP-Ab 2、Ab 3/HRP-Ab 4 和 Ab 4/HRP-Ab 1）能夠滿足 hAFP 檢測要求且無交叉反應的配對抗體，最終確定 Ab 1 + Ab 3/ HRP-Ab 2 和 Ab 1 + Ab 3/HRP-Ab 4 為最佳配對組合；利用最佳配對抗體組合建立標準檢測曲線，其線性檢測范圍為 5 ~ 250 ng/ml，最低檢測限 2 ng/ml，檢測上限 400 ng/ml，優于進口試劑盒的線性范圍 5 ~ 200 ng/ml 和最低檢測限 5 ng/ml；樣檢結果顯示自制試劑盒的陽性血清檢測準確率 99.2%（119/120 例），陰性血清準確率 100%（40/40 例）。

篩選獲得的 4 株高親和力、高特異性抗 hAFP 單抗均可應用于 DAS-ELISA 試劑盒的研制，Ab 1和 Ab 3 適合作為捕獲抗體，Ab 2 和 Ab 4 適合作檢測抗體；自制試劑盒的線性檢測范圍和最低檢測限均優于進口試劑盒，表明具有商用價值。

甲胎蛋白類； 抗體，單克隆； 雙抗體夾心ELISA

人甲胎蛋白（human alpha fetoprotein，hAFP）是一種由胎兒肝細胞和卵黃囊合成出的胚胎性糖蛋白，其功能與人血清白蛋白（human serum albumin，HSA）相似，可視其為胎兒發育時期的 HSA替代物[1-2]。正常情況下，hAFP 僅存在于胎兒血清中，胎兒出生一年后 hAFP 濃度降回正常人水平（< 5 ng/ml），正常人血清中的濃度一般不高于20 ng/ml。當身體發生原發性肝癌時，肝癌細胞可大量分泌 hAFP 于外周血中，引發血液 hAFP 濃度的異常升高。

hAFP 是最早發現的腫瘤標志物之一，其長期以來被作為肝癌、胎兒缺陷以及胚胎相關癌的重要血清分子標記物，是血液檢驗中的重要評價指標分子[3-4]。除應用于產前診斷和肝細胞癌診斷外，hAFP 的血液檢測對肝損傷、肝硬化、肝炎、腸胃癌、神經管損傷、內胚竇瘤、生殖系統癌癥等疾病的診斷及病情監控也具有重要意義[5-6]。

中國是個人口大國，產前診斷與每個家庭都息息相關；同時，中國又是一個肝癌高發地區，每年死于肝癌的人數占全世界死亡人數的40% 以上[7]，由于中晚期肝癌基本無有效治療方法，所以對原發性肝癌特異性腫瘤抗原 hAFP 血液濃度的全民普查和早期診斷是解決肝癌高死亡率的最有效措施[8]。因此，靈敏、特異、準確、簡便、低成本的血清 hAFP 檢測方法的建立迎合了社會的迫切需要。

本研究通過制備多株特異性、高親和力的抗 hAFP 單克隆抗體，從中篩選出具有商用價值的配對抗體，為研制雙抗體夾心 ELISA（DAS-ELISA）試劑盒奠定堅實的基礎。

1 材料與方法

1.1 主要材料

6 周齡 SPF 級雌性 BALB/c 小鼠購自南方醫科大學動物中心；hAFP 和 HSA 購自美國Fitzgerald 公司；患者血清取自廣州華僑醫院；標準抗體（AFP-01、AFP-11）和進口 DAS-ELISA 試劑盒均購自英國ABCam 公司。

1.2 方法

1.2.1 抗 hAFP 單克隆抗體的制備 免疫BALB/c 小鼠，通過常規的細胞融合方法和有限稀釋法克隆化，篩選能夠穩定分泌抗 hAFP 單克隆抗體的雜交瘤細胞株，并制備其腹水型單抗。

1.2.2 單抗的特性鑒定 用間接 ELISA 法分別測定篩選所得單抗的 IgG 亞類、腹水效價及與HSA 的交叉反應。利用篩選所得的 5 株高親和力單抗，對 HepG2 人肝癌細胞進行免疫熒光染色（FITC 和 DAPI 雙染，400 倍顯微鏡下觀察），以鑒定單抗與天然 hAFP 分子特異性結合的能力。

1.2.3 雙抗體夾心法配對實驗 HRP 標記單抗后，使用 DAS-ELISA 棋盤法篩選配對抗體對。以400 ng/ml 的 hAFP 作為檢測原，4 mg/ml 的 HSA 作為交叉反應對照，PBS 作空白對照。

1.2.4 雙抗體夾心 ELISA 法的建立 以 Ab 1 和 Ab 3 為捕獲抗體，以 HRP-Ab 2 或 HRP-Ab 4為檢測抗體，建立 DAS-ELISA 檢測方法。經檢測條件優化，繪制其標準檢測曲線，并與進口試劑盒的標準曲線比較。

1.2.5 樣品檢測 使用已優化的自制雙抗體夾心試劑盒（Ab 1 + Ab 3/HRP-Ab 2）檢測血清樣品，并與醫院檢測結果和 ABCam 雙抗體夾心檢測試劑盒的檢測結果比較。

2 結果

2.1 單克隆抗體的制備與特性鑒定

共篩選得到 12 株能夠穩定分泌抗 hAFP 單抗的雜交瘤細胞株，其特性鑒定結果如表 1 所示。Ab 1 ~ Ab 8 的單抗亞類均為IgG1 型，Ab 9 ~Ab 12 為 IgG2 型。Ab 1、Ab 2、Ab 3、Ab 5 均具有較高腹水效價且明顯高于其他細胞株，其中Ab 5 的腹水效價最高，滴度為 1:3 × 107，Ab 1~ Ab 3 的腹水滴度為 1:6.5 × 106~ 1:9 × 106；Ab 4 的細胞株不能產生腹水，但其細胞上清也具有較高效價，滴度達 1:16 000。通過間接 ELISA 測定單抗與高濃度交叉反應原 HSA 的交叉反應性，發現 Ab 2、Ab 3、Ab 4、Ab 10 和 Ab 12 具有很好的 hAFP 特異性，無交叉反應；Ab 1 和 Ab 6 在效價稀釋倍數時與 HSA 有輕微交叉反應，Ab 5、Ab 7、Ab 8 和 Ab 9 的交叉反應較強。

結果表明，Ab 1 ~ Ab 4 這 4 株單抗具有親和力高、特異性好的特性，Ab 5 的特異性較差，但效價極高，提示其可能具有極高親和力。

2.2 單抗特異性鑒定

為驗證篩選所得單抗是否能夠與天然存在的 hAFP 分子特異性結合，使用 Ab 1 ~ Ab 5 這 5 株高親和力單抗進行了 HepG2 人肝癌細胞免疫熒光染色，無關單抗作陰性對照組。結果顯示，在 5 株單抗對應的實驗組中，HepG2 細胞內均呈現明顯綠色熒光，而無關抗體對照組細胞未觀察到綠色熒光，說明 Ab 1 ~ Ab 5 單抗特異性識別了人肝癌細胞胞漿內的 hAFP 分子，證明該 5 株單抗均能夠特異識別天然產生的人源 AFP 分子（圖 1）。

表 1 單抗的特性鑒定

注：“–”表示與HSA 無交叉反應；“+”表示與HSA 有交叉反應，“+”數量越多表示交叉反應越強。

Notes: “-”indicates no cross-reaction with HSA; “+” indicates a cross-reaction with HSA, more “+” indicates stronger cross reaction.

圖 1 HepG2 細胞的免疫熒光染色（400 ×）

Figure 1 Immunofluorescence staining of the HepG2 cells

2.3 DAS-ELISA 棋盤法配對實驗

純化并用 HRP 標記 7 株親和力較高的單抗（Ab 1、Ab 2、Ab 3、Ab 4、Ab 5、Ab 6、Ab 10），以用于抗體配對實驗。配對結果顯示（表 2），在 49（7 × 7）種抗體配對組合中，有 13 種組合可形成雙抗體夾心配對，其中，與 HSA 完全無交叉反應且具有較好配對效果的共有 5 種組合：Ab 1/ HRP-Ab 2、Ab 1/HRP-Ab 4、Ab 3/HRP-Ab 2、Ab 3/ HRP-Ab 4和 Ab 4/HRP-Ab 1。

表 2 雙抗體夾心法篩選配對抗體

注：“+”數量代表450值的高低：“+”> 1.0，“++”> 2.0，“+++”> 3.0；“–”代表450值< 0.5；紅色“+”代表無交叉反應，“+*”代表有或略有交叉。

Notes: The quantity of “+” indicates the valve of450: “+” > 1.0, “++” > 2.0, “+++” > 3.0; “–”< 0.5; The red “+” indicates no cross-reaction, “+*” indicates a cross-reaction with HSA was observed.

2.4 DAS-ELISA 檢測方法的建立及比較

通過一系列檢測方法優化，最終確定以 Ab 1 + Ab 3/HRP-Ab 2 和 Ab 1 + Ab 3/HRP-Ab 4 為最佳配對組合建立 DAS-ELISA 檢測方法，兩組配對組合的檢測范圍及靈敏度相同，建立其標準檢測曲線，并與進口試劑盒的標準曲線比較。

結果顯示，自制 DAS-ELISA 檢測方法與進口試劑盒的完整檢測曲線非常相近，檢測范圍和檢測靈敏度大致相同；但自制 DAS-ELISA 檢測方法在 hAFP 濃度 0 ~ 300 ng/ml 范圍內的線性檢測曲線優于進口試劑盒，進口試劑盒的線性標準曲線頂部彎曲程度較大（圖 2）。

雖然進口試劑盒說明書中指出該試劑盒的線性檢測范圍為 2 ~ 300 ng/ml，但實際測得的線性范圍只有 5 ~ 200 ng/ml，檢測下限 5 ng/ml；而自建檢測方法的線性檢測范圍為 5 ~ 250 ng/ml，檢測下限 2 ng/ml，檢測上限 400 ng/ml，略優于進口產品。

2.5 樣品檢測

共收集了 hAFP 陽性患者血清 120 例（孕婦118 例，原發性肝癌 2 例），陰性正常人血清40 例，分別用自建的 DAS-ELISA 檢測方法和進口試劑盒檢測血樣，并統計樣檢準確率。結果顯示，兩試劑盒均能有效檢測人血清中 AFP 的濃度。其中，進口試劑盒對陰、陽性血清樣品的檢測準確率均為100%，檢測穩定、準確；自建的檢測方法在對120 份陽性血清檢測時檢出 1 例陰性，準確率 99.2%，在對 40 份陰性血清檢測時，準確率 100%，同樣得出較準確結果（表 3）。證明該初步建立的 DAS-ELISA 試劑盒檢測方法能夠應用于實際血清樣品的檢測。

OD4503.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0 OD4503.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0 1 10 100 1000 100 200 300 400 自制 AFP 標準溶液（ng/ml）Self-made standard AFP solutions（ng/ml）A 試劑盒 AFP 標準溶液（ng/ml）Standard AFP solutions from the kit（ng/ml）B

Figure 2 Comparison between hAFP ELISA kit (ABCam) and the homemade one (A: Standard curves ; B: Linear standard curves)

表 3 樣品檢測結果

3 討論

自 1975 年淋巴細胞雜交瘤技術誕生以來，單抗制備技術迅猛發展，開啟了檢測試劑盒研發和靶向治療的新時代，成為了現代科技轉化為實際應用的最重要代表之一[9]。人甲胎蛋白作為原發性肝癌最特異的腫瘤標志物和產前診斷檢測分子，其單克隆抗體具有極其重要的實際應用意義。雖然國內外均已成功制備了抗 hAFP 單抗并應用于試劑盒生產[10-11]，但不斷開發具有更高靈敏度、更好線性檢測范圍的雙抗體夾心配對抗體仍是試劑盒研發的努力方向，也是臨床檢測的需要。

目前，血清 hAFP 的檢測方法主要是雙抗體夾心 ELISA 試劑盒法，該方法對其使用的配對抗體具有較高要求，兩個配對抗體不僅需要高特異性、高親和力，還需要具有穩定的抗原結合活性，其對應抗原結合位點之間的空間位置關系也同樣直接影響該抗體對的檢測靈敏度和檢測范圍。本研究從制備所得的 12 株抗 hAFP 單克隆抗體中成功篩選出 5 對有應用價值的配對抗體，并最終建立了以 Ab 1 + Ab 3 為捕獲抗體、Ab 2 或 Ab 4 為檢測抗體的 DAS-ELISA 檢測方法，其線性檢測范圍為 5 ~ 250 ng/ml，檢測下限 2 ng/ml，均優于 ABCam 進口試劑盒，且血樣檢測結果顯示其具有很好的檢測準確度，表明該初步建立的 DAS-ELISA 檢測方法具有較好的臨床應用價值。

[1] Mizejewski GJ. New insights into AFP structure and function: potential biomedical applications. Orlando: Academic Press, 1985: 5-34.

[2] Deutsch HF. Chemistry and biology of alpha-fetoprotein. Adv Cancer Res, 1991, 56:253-312.

[3] Tatarinov YS. Content of embryo-specific alpha-globulin in the blood serum of the human fetus, newborn, and adult man in primary cancer of the liver. Vop Khim SSR, 1965, 11:20-24.

[4] Brock DJ, Sutcliffe RG. Alpha-fetoprotein in the antenatal diagnosis of anencephaly and spina bifida. Lancet, 1972, 2(7770):197-199.

[5] Mizejewski GJ. Levels of alpha-fetoprotein during pregnancy and early infancy in normal and disease states. Obstet Gynecol Surv, 2003, 58(12):804-826.

[6] Mizejewski GJ. Biological role of alpha-fetoprotein in cancer: prospects for anticancer therapy. Expert Rev Anticancer Ther, 2002, 2(6):709-735.

[7] Tang ZQ. Progress in clinical research of liver cancer and the prospects of 21st century. ACAT Academiae Med Shanghai, 1997, 24(3):323-326. (in Chinese)

湯釗猷. 肝癌臨床研究的進展與21世紀的展望. 上海醫科大學學報, 1997, 24(3):323-326.

[8] Bruix J, Llovet JM. Prognostic prediction and treatment strategy in hepatocellular carcinoma. Hepatology, 2002, 35(3):519-524.

[9] Kong J, Liu Q, Han YW, et al. The advances and application prospects of monoclonal antibody preparation technology. Immunol J, 2011, 27(2):170-173. (in Chinese)

孔君, 劉箐, 韓躍武, 等. 單克隆抗體制備技術的最新進展及應用前景. 免疫學雜志, 2011, 27(2):170-173.

[10] Porstmann B, Avrameas S, Ternynck T, et al. An antibody chimera technique applied to enzyme immunoassay for human alpha-1- fetoprotein with monoclonal and polyclonal antibodies. J Immunol Methods, 1984, 66(1):179-185.

[11] Han Y, Li L, Zhang PY, et al. Preparation of monoclonal antibody against alpha fetoprotein and its nature research. Norman Bethune Med Univ J, 1984, 10(8):237-241. (in Chinese)

翰儀, 李俐, 張培因, 等. 抗甲胎蛋白單克隆抗體的制備及其性質的研究. 白求恩醫科大學學報, 1984, 10(8):237-241.

Preparation of monoclonal antibodies against hAFP and development of mAb-based sandwich ELISA

SUN Yi-fan, YANG Quan-li, HUANG Jian-fang, ZHAO Feng-zhi, XIANG Jun-jian

To prepare several hAFP-specific monoclonal antibodies with high specificity and high affinity. To screen antibody pairs with potential commercial value from these mAbs and to develop a sandwich enzyme-linked immunosorbent assay (DAS-ELISA) for the detection of hAFP.

mAbs were prepared using the classic hybridoma fusion method, and the specificity of mAb was identified and analyzed. Using DAS-ELISA, the best antibody pair was selected from the mAbs. DAS-ELISA was optimized and compared to an ABCam ELISA kit. Then the initially self-made kit was used to detect a total of 160 samples (including 120 positive and 40 negative serums).

A total of 12 mAbs was prepared and 5 of them had very high affinities. The titers of ascites of both Ab 1 - Ab 5 were less than 1: 6 million and Ab 5 had the best titer: 1:30 million. Both Ab 1 - Ab 5 could recognize the natural hAFP specifically, but Ab 5 had cross-reaction with HSA. In the selected antibody pairs, Ab 1/HRP-Ab 2, Ab 1/HRP-Ab 4, Ab 3/HRP-Ab 2, Ab 3/HRP-Ab 4 and Ab 4/HRP-Ab 1 were identified to be capable of application. Ab 1 + Ab 3/HRP-Ab 2 and Ab 1 + Ab 3/HRP-Ab 4 were identified as the best antibody pairs to establish the DAS-ELISA kit. The self-made kit had better linear scale of detection (5 - 250 ng/ml) than that of ABCam kit (5 - 200 ng/ml), and better limitation of detection (2 ng/ml) than that of ABCam (5 ng/ml). The self-made kit also showed good results in detecting the samples with accuracies of 99.2% (119/120) in positive serums and 100% (40/40) in negative serums.

4 mAbs ( including capture mAbs Ab 1 and Ab 3 and detection mAbs Ab 2 and Ab 4) with high affinity and specificity are used in developing the DAS-ELISA kit. The better linear scale and limitation of detection also suggest that this kit would have good commercial value.

Alpha-fetoproteins; Antibodies, monoclonal; Sandwich enzyme-linked immunosorbent assay

XIANG Jun-jian, Email: txjj@jnu.edu.cn

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2014.04.004

廣東省戰略性新興產業核心技術攻關項目“免疫熒光定量快速檢測技術在重大疾病檢測中的應用”（2012A080800007）

向軍儉，Email：txjj@jnu.edu.cn

2014-06-09

Author Affiliation: Guangdong Province Key Laboratory of Molecular Immunology and Antibody Engineering/ Research Center for Antibody Engineering, Jinan University,Guangzhou 510632, China