星點設計-效應面法優選黃連的提取工藝△

趙文龍,周昌妮,王佳樂,歐麗婷,賈永艷

(河南中醫學院 藥學院，河南 鄭州 450046)

中藥工業

河南中醫學院創新性學習項目(yxcx2012-1)

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賈永艷，教授，碩士生導師，研究方向：藥物制劑新技術與新劑型，E-mail：hnzyjyy@126.com

星點設計-效應面法優選黃連的提取工藝△

趙文龍,周昌妮,王佳樂,歐麗婷,賈永艷*

(河南中醫學院 藥學院，河南 鄭州 450046)

目的優選黃連的提取工藝。方法以總生物堿的含量為指標，采用星點設計-效應面法對乙醇體積分數、乙醇用量、提取時間進行考察。結果最優提取工藝為12倍量含80﹪乙醇回流提取3次，每次0.5 h。結論優化后的工藝穩定可行，可用于黃連的提取。

黃連；星點設計；總生物堿；工藝優選

糖尿病是由遺傳因素、免疫功能紊亂等各種致病因子作用于機體導致胰島素功能減退、胰島素抵抗等而引發的一系列代謝紊亂綜合征，病程較長，并發癥多，難以根治。復方葛黃制劑由葛根、黃連等藥味組成，具有生津、瀉火、養陰清熱之功效，是治療糖尿病的臨床驗方。為提高藥物療效、延長藥物作用時間，現欲將其制成滲透泵片，筆者對方中黃連進行了提取工藝研究。黃連為多年生草本毛茛科植物黃連、三角葉黃連、云連的干燥根莖，性寒,味苦,具有清熱燥濕,瀉火解毒功能[1]。現代研究表明，黃連中的主要有效成分是以鹽酸小檗堿為代表的生物堿類，其具有抗病原微生物、抗腹瀉、抗炎和免疫促進以及降血壓、抗心律失常、降血糖等藥理作用，用于急性腸胃炎、口舌生瘡、燒燙傷、心率失常、高血壓、糖尿病等疾病的治療[2-3]。本研究采用星點設計-效應面法，以黃連總生物堿含量為指標，對復方葛黃方劑中黃連的提取工藝進行優化。

1 儀器與試藥

PIHW型調溫電熱套(鞏義市英峪予華電熱儀器廠)；RE52-99旋轉蒸發儀(上海亞榮生化儀器廠)；SHZ-D(Ⅲ)循環水式真空泵(鞏義市英峪予華電熱儀器廠)；恒溫水浴鍋(北京市長風儀器儀表公司)；METTLERAE240十萬分之一天平(德國梅特勒公司)；KQ-100型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；DZF-250小型真空干燥箱(鄭州長城科工貿有限公司)；UV-2201紫外分光光度儀(日本島津公司)。

鹽酸小檗堿對照品 (中國食品藥品檢定研究院，批號：110713-20091)；復方葛黃方劑(自制，批號：20121205，20121217，20121218，20121219)；黃連(購自河南中原正信藥材有限公司)，經河南中醫學院陳隨清教授鑒定符合《中國藥典》2010版黃連項下要求；所用試劑均為分析純。

2 方法

2.1 黃連總生物堿的測定方法

2.1.1 對照品溶液的制備 精密稱取鹽酸小檗堿對照品3.07 mg，置于25 mL量瓶中，加蒸餾水溶解并稀釋至刻度，即得濃度為122.8 μg·mL-1的鹽酸小檗堿對照品溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備 精密量取相當于1 g生藥的藥液，水浴蒸干，用蒸餾水溶解定容至25 mL。

2.1.3 吸收波長的選擇 精密量取供試品溶液和對照品溶液各1.0 mL，分別置于25 mL量瓶中，加蒸餾水稀釋定容至刻度，以蒸餾水為空白，照紫外-可見分光光度法(《中國藥典》2010版附錄VA)，在200～700 nm進行掃描，確定最大吸收波長為346 nm。

2.1.4 測定方法 照2.1.2項下方法制備供試品溶液，精密量取供試品溶液1.0 mL，置于25 mL量瓶中，加蒸餾水稀釋定容至刻度，以蒸餾水為空白，采用紫外分光光度法，在346 nm處測定吸光度，計算黃連總生物堿含量。

2.1.5 線性關系的考察 分別精密量取對照品溶液0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 mL，分別置于25 mL量瓶中，加蒸餾水稀釋并定容至刻度，測定吸光度，繪制標準曲線。得到回歸方程：Y=0.061 8X-0.007 3，(r=0.999 9)，實驗表明，鹽酸小檗堿濃度在2.46～12.28 μg·mL-1與吸光度呈良好的線性關系。

2.1.6 重復性試驗 精密量取同一批樣品(批號：20121205)5份，按2.1.4項下方法測定吸光度，計算樣品中黃連總生物堿含量，依次為14.87%，14.66%，14.74%，15.14%，14.79%，平均含量為14.84%，RSD=0.89%，表明重復性良好。

2.1.7 加樣回收率試驗 精密量取已知含量的供試品溶液0.5 mL(鹽酸小檗堿含量：5.94 mg·mL-1)5份，分別置25 mL量瓶中，分別精密加入鹽酸小檗堿對照品溶液(0.30 mg·mL-1)10.0 mL，按2.1.4項下方法測定吸光度，計算樣品中黃連總生物堿含量，計算回收率。回收率依次為97.33%，98.21%，95.48%，96.67%，101.54%，平均回收率為97.85%，RSD=1.66%。

2.2 星點設計-效應面法優化提取工藝

目前，在中藥提取工藝優化研究中多采用正交設計、均勻試驗設計、星點設計等方法，其中星點設計通過多元非線性模型的擬合，能建立擬合度好、相關性高、預測性較好的回歸模型，同時結合效應面優化法分析優化工藝條件更加簡單、直觀[4]，為此，筆者采用星點設計-效應面法對黃連的提取工藝進行優化。

根據單因素考察結果，以水為提取溶劑時，提取物中黃連總生物堿的含量為11.26%；以80%乙醇為提取溶劑時，黃連總生物堿的含量可達13.69%，結果表明，醇提效果明顯好于水提，故選用乙醇為提取溶劑。

以黃連總生物堿的含量為指標，選取乙醇體積分數、乙醇用量、提取時間和提取次數為考察因素，其中提取次數為非連續變量，回歸處理較困難，結合預試驗結果及相關文獻，暫定為3次。每因素設5個水平，用代碼值-α，-1，0，1，+α表示(因素中心復合設計的α=1.732)[5-7]。因素水平見表1，試驗安排及結果見表2，方差分析見表3。

表1 復方葛黃方劑中黃連提取星點設計試驗因素水平表

表2 復方葛黃方劑中黃連提取星點設計試驗安排及結果

續表2

表3 方差分析

以黃連總生物堿的含量為指標，使用Minitab 15.0軟件對數據進行分析處理，該軟件對數據分別進行了線性、兩因素相互作用、完全二次多項式模型擬合，得出的最佳擬合模型為完全二次多項擬合，其擬合方程及相應r2值如下：

Y=-10.094 4+0.207 4X1+2.714 3X2+0.205 2X3-0.001 4X12-0.108 5X22-0.000 4X32+0.003 6X1X2-0.000 8X1X3-0.010 8X2X3,r2=0.939 8。

二次多項擬合模型的r2已經達到了0.939 8，同時，由表3可知，對含量的方差分析，其線性、平方、以及交互項的差異具有統計學意義(P<0.05)，回歸達到顯著水平，說明效應值與各因素之間存在顯著的回歸關系。失擬項用來檢測回歸模型與實際實驗設計的擬合程度的好壞，如果失擬項顯著，說明對效應值有影響的還有其他因素。失擬項P=0.079>0.05，失擬項不顯著，從而表明該模型能夠對黃連總生物堿的提取進行準確的預測和分析[8]。

根據所擬合的回歸方程，作效應曲面圖，考察所擬合的效應曲面形狀，分析乙醇體積分數、溶劑用量、提取時間對黃連總生物堿含量的影響。其等值線圖和效應曲面圖如圖1～3。

圖1 含量與乙醇用量、乙醇體積分數的等值線圖及曲面圖

圖2 含量與提取時間、乙醇體積分數的等值線圖及效應面圖

圖3 含量與提取時間、乙醇用量的等值線圖及曲面圖

以上3組圖直觀地反映了各因素對效應值的影響。由圖1可知，當乙醇體積分數達到80%，乙醇用量為10倍量左右時，黃連總生物堿含量達到最大值，隨著醇用量增加和醇濃度的升高，黃連總生物堿含量呈下降趨勢。由圖2可知，隨乙醇體積分數的升高，黃連總生物堿含量先升高后逐漸降低，隨提取時間的延長含量變化不明顯。由圖3可知，隨醇用量的升高，黃連總生物堿含量逐漸升高，提取時間的延長對含量影響不明顯。

運用Minitab軟件的效應優化器對實驗結果進行優化，得到模型的最優條件：乙醇體積分數為80%，乙醇用量為12倍量，提取時間為30 min，預測的黃連總生物堿含量為17.97%。

為驗證效應面法分析結果的可靠性，采用上述優化條件對黃連總生物堿提取實驗進行3次重復驗證實驗，在此條件下，驗證實驗的黃連總生物堿平均含量為17.88%，與理論預測值相比，其相對誤差約為0.78%。說明建立的數學模型具有良好的預測效果，優化工藝參數準確可靠，結果見表4。

表4 復方葛黃方劑中黃連提取工藝驗證實驗 /%

3 討論

黃連中的主要有效成分為小檗堿型總生物堿，小檗堿難溶于水，溶于熱水，故常用水、乙醇為溶劑提取黃連中的小檗堿。本實驗中對提取溶劑進行簡單考察，表明適宜濃度的乙醇對黃連的提取率要高于水提取。黃連中總生物堿類含量較大，使用紫外可見分光光度法可對總生物堿含量進行準確測定，并且UV法較其他檢測方法簡單便捷。

星點設計-效應面法相對于正交設計、均勻設計能夠擬合更加準確的二次多項式擬合模型，模型的預測精度和準確度相對較高，能夠為中藥的提取工藝優化提供可靠依據，其在藥學領域中的應用也越來越廣泛。

[1] 李家實.中藥鑒定學[M].上海：上海科學技術出版社，2000：88.

[2] 徐錦堂,王立群,徐蓓.黃連研究進展[J].中國醫學科學院學報，2004,26(6)：705.

[3] 馮穎,吳德榮.黃連、小檗堿及其復方在抗糖尿病方面的藥理學研究及臨床應用[J].中國中醫藥信息雜志，2003,10(4)：80-82.

[4] 王躍生,歐陽旭.數學模式試驗設計方法的優缺點比較及其在中藥研究應用中的適宜性分析[J].中藥新藥與臨床藥理，2010,21(2)：207-210.

[5] 吳偉,崔光華.星點設計-效應面法及其在藥學中的應用[J].國外醫學·藥學分冊，2000,27(5)：292-297.

[6] 丁黎艷,郭晏華,黃婷,等.星點設計-效應面法優化補骨脂炮制工藝[J].中國現代中藥,2013,15(1)：56-59.

[7] 劉穎新,劉利利,喻祖文,等.星點設計-響應面法優化厚樸提取工藝[J].中國實驗方劑學雜志,2013,19(7)：27-30.

[8] 張霜,李燕.響應曲面法優化蘆薈蒽醌提取工藝的研究[J].食品工業科技,2012,33(8)：326-329.

OptimizationofExtractionfromCoptidisRhizomabyCentralCompositeDesignandResponseSurfaceMethod

ZHAOWenlong,ZHOUChangni，WANGJiale，OLiting,JIAYongyan*

(Collegeofpharmacy,HenanUniversityofTraditionalChineseMedicine,Zhengzhou450046,China)

Objective：To optimize the extraction process of Coptidis Rhizoma.MethodsUsing central composite design and response surface method to investigate the Fufang Gehuang osmotic pump tablet extraction with ethanol concentration,dosage of ethanol,extraction time.ResultsThe optimal extraction process of Fufang Gehuang osmotic pump tablet is：12 times the amount of 80% ethanol,extracted three times,each time for 0.5 hours.ConclusionThe optimized process is stable and feasible,and can be used for extracting Fufang Gehuang osmotic pump tablet.

Coptidis Rhizoma;Central composite design;Total alkaloids;Process optimization

10.13313/j.issn.1673-4890.2014.04.013

2013-09-13)