顯微組織化學定位在中藥研究中的應用

林麗，施曉龍，高素芳，陳紅剛

(1.甘肅中醫學院，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅省高校中藏藥化學與質量研究省級重點實驗室，甘肅 蘭州 730000)

*

林麗，高級實驗師，研究方向：中藥鑒定及中藥資源可持續利用；Tel：(0931)8765304，E-mail：xrhlin@sina.com

顯微組織化學定位在中藥研究中的應用

林麗1，2*，施曉龍1，高素芳1，陳紅剛1

(1.甘肅中醫學院，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅省高校中藏藥化學與質量研究省級重點實驗室，甘肅 蘭州 730000)

以中藥顯微鑒定和組織化學動態定位的相關研究為基礎，從顯微組織化學前沿研究、顯微組織化學特征性反應、顯微組織化學定位等方面進行詳細綜合論述，指出顯微化學定位在組織結構研究中的優勢，為中藥資源的開發利用提供方法學技術指導，同時也為中藥品質鑒定提供新的研究思路和方法。

顯微化學；組織定位；中藥材

顯微組織定位是在中藥有效成分鑒定明確的條件下，有針對性地選擇能與有效成分產生沉淀、結晶或特殊顏色的化學試劑進行染色反應，運用顯微鏡觀察來確定這些物質存在部位和分布情況。中藥有效成分是植物組織細胞自身代謝的產物，其中包括分泌細胞對一些物質的分泌和具有特殊功能細胞對一些物質的合成，使得顯微組織化學在植物組織中有效成分的定位研究發揮出獨特的優勢。目前顯微組織化學定位主要應用于臨床方面，它對精細病變組織切片進行定位觀察，以此來輔助診斷腫瘤細胞是否擴散，確定治療效果。顯微組織化學定位也可以用于藥用植物有效成分組織中的定位研究，確定其具體存在部位和動態轉移途徑，對中藥材品種的選育、栽培及其品質的鑒定提供科學指導。

科研人員嘗試借助先進的儀器設備，運用植物組織切片技術，在藥用植物組織定位取得相應的研究成就，從而促使該方法在分子研究領域的先進性不斷凸顯，可以預測其具有廣闊的發展前景。筆者通過檢索近期國內外相關研究文獻，綜合分析顯微化學定位在中藥研究中的應用，探索植物有效成分的合成途徑、代謝規律，為今后中藥品質鑒定提供科學依據。

1 顯微組織化學的發展歷程

顯微組織化學方法最早出現在化學研究領域的一些化學反應中，通過對化學反應的生成物進行染色處理制成裝片后借助顯微鏡觀察精細組織結構，特別在有機化學研究領域對有機物的研究做出巨大貢獻，從而推動了化學研究的發展。同時我們還通過資料可以找到顯微化學方法的顯微化學定位能夠對中藥中的一些特征性物質進行定位確定，探索植物有效成分的合成途徑、代謝規律，具有很大的發展潛能，為今后中藥品質鑒定提供科學依據。因為其分散凌亂并沒有形成一定的研究體系，因而也沒有引起其他學科科研人員的足夠重視。直到蘇聯科學家德日阿帕利捷的《顯微化學實驗指導手冊》出版[1]，使顯微化學研究有了明確的研究方向。隨著顯微組織化學方法的逐漸成熟，也逐步應用在組織細胞形態學方面的研究上，因為操作簡單、快捷，實驗結果可信度高等優勢，更好地完善了組織細胞形態學研究體系，形成組織化學研究方法。但是對一些生理、生命現象，組織化學不能更好地進行合理解釋。研究人員開始嘗試顯微化學從組織化學的學科主體進行分離，經過不斷發展完善，顯微組織化學在某些方面可以代替組織化學來研究組織或細胞中的化學組成、定位與定量以及代謝狀態，能夠更好地聯系細胞形態結構、化學成分、功能，來了解組織或細胞的代謝變化[2]，而且在一些新技術、新儀器的相繼出現后廣泛用于這一科研領域。藥用植物顯微組織定位在藥物鑒別研究方面取得相應成就，其應用最廣泛的是在組織結構基礎上對中藥材進行鑒定來辨別真偽，而隨著各項技術的不斷成熟和對藥用資源優化應用的要求，人們逐漸尋找有效成分積累部位和最大積累量之間的相關性規律，為藥材的采收、加工、種屬鑒定及質量評價提供依據。

2 顯微組織化學在藥用植物研究中的技術方法及應用

2.1 顯微組織化學在中藥不同組織及成分鑒別中常用的檢測方法

顯微組織化學方法是目前藥用植物研究中最常用的方法之一，常用間苯三酚-鹽酸(或硫酸)反應、苯胺反應、氯化鋅反應、氯化鋅碘反應、氫碘酸反應與碘液硫酸反應來鑒定木化、木栓化、角質化、纖維素化或半纖維素化的細胞壁；對樹脂和揮發油類可選擇醋酸銅反應、察列夫斯基反應以及染色法、鹽酸升華法和蒸發法等進行鑒定；對淀粉粒、不同的黏液質、糊粉粒、菊糖、鞣質、草酸鈣與碳酸鈣結晶等采用碘反應、蘇丹紅與紫草反應、釕紅反應、亞甲蘭反應、剛果紅反應、高鐵酸反應、鎢酸鈉反應、A-萘酚反應、麝香草酚反應、稀醋酸或稀鹽酸等反應進行鑒別；對蛋白質用碘反應、三硝基酚反應、硝酸汞反應、硝酸脫黃反應、氯化汞溴酚藍反應、硫酸銅反應進行鑒別[1，3-4]。

2.2 顯微組織化學定位在藥用植物研究的應用

有效藥用成分的顯微組織化學定位的研究，是研究次生代謝產物在植物組織器官分布規律和動態積累過程的重要方法。顯微組織化學已在糖類、蛋白質、脂類、樹脂和揮發油、分泌物、色素、細胞壁、苷類、鞣質、無機鹽等物質的鑒定上日趨完善，并在藥用植物的研究中得到成功運用，其中在對植物的次生代謝物進行組織化學定位研究過程中還發現不同植物器官中存在的類型及分布模式具有多樣性。

2.2.1 黃酮類化合物研究 葛楚源等[5]研究了黃酮組織化學定位，結果表明黃酮存在于表皮、厚角組織的分泌細胞中，葉中黃酮含量高于莖部。陳婧[6]在蕤核的形態解剖學及組織化學定位研究中發現黃酮多分布于葉片的柵欄組織和厚角組織。康杰芳等[7]通過組織化學定位實驗觀察，指出萜類和黃酮類化合物主要分布在根的皮層、莖的皮層和韌皮部細胞中。廖云海等[8]應用植物解剖學、組織化學和植物化學方法，對光果甘草各營養器官的結構、總黃酮的組織化學定位和含量差異進行了研究，發現每年可在果熟期和枯萎期之間采挖藥材，有效成分含量最高。李娜等[9]應用顯微組織化學定位出萜類和黃酮類化合物主要分布在金粟蘭根的皮層、莖的皮層及韌皮部細胞中。

2.2.2 皂苷類化合物研究 葉祖云等[10]在太子參微塊根發育的解剖學與組織化學定位研究中發現，在成熟的微塊根中太子參皂苷主要分布在次生木質部和韌皮部維管薄壁細胞中。林如等[11]通過組織結構研究發現，絞股藍莖葉內人參皂苷含量較根和根莖高。王桂芹等[12]對白頭翁藥用部位解剖結構和皂苷組織化學定位進行研究，指出皂苷類物質的形成和貯藏主要與次生韌皮部、分泌腔和分泌道有關。劉世彪等[13]應用組織化學定位技術及植物化學等方法對絞股藍進行研究，發現了不同發育階段莖葉的結構與其中人參皂苷分布積累和總皂苷含量具有相關性。譚玲玲等[14]對北柴胡的組織化學定位及其含量比較研究發現，柴胡皂普和黃酮類化合物在根、莖、葉中分布，且發現總黃酮在根、莖、葉中的含量變化規律為葉>莖>根。

2.2.3 生物堿研究 閆晉晉等[20]應用顯微組織化學定位觀察發現，生物堿主要分布在主根(川烏)次生韌皮部薄壁組織細胞與束間形成層的外側細胞、不定根(附子)和莖基部的內皮層、韌皮部外側薄壁細胞中。李玉萍等[21]對蛇根木根部生物堿積累的組織化學定位研究指出，蛇根木種植形成層當年根部就可以產生和積累生物堿。呂洪飛等[22]對不同年齡的石斛及其偽品(小葉石仙桃)的不同器官進行生物堿組織化學定位研究，明確有效部位和最佳采收期。史文靜等[23]采用石蠟切片和組織化學的方法對苦豆子營養器官進行研究，指出所測部位均含有生物總堿。

閆晉晉[24]對烏頭所形成的附子的形態結構、發育過程、藥用成分生物堿分布研究發現，生物堿的分布存在動態積累過程。彭斯文等[25]采用植物組織化學定位的方法大致測定杜鵑蘭營養器官中生物堿含量為假鱗莖>葉柄>葉片。劉文哲等[26]在喜樹幼枝的喜樹堿積累及其組織內定位研究中發現，喜樹堿的主要積累部位是幼莖和幼葉內部由1～2層細胞包圍而成的分泌道。杜亞填等[27]從紅豆杉藥用部位的結構及其與多酚類化合物積累研究中發現，南方紅豆杉紫杉醇存在于幼莖皮和莖形成層愈傷組織中，曼地亞紅豆杉紫杉醇則存在于莖形成層和頂端分生組織的愈傷組織中，且各自含量差別較大。

2.2.4 蒽醌類化合物研究 劉文哲等[28]對大黃蒽醌類化合物組織化學定位研究發現大黃根莖內蒽醌類化合物主要積累在次生木質部的木射線和次生韌皮部的韌皮射線細胞中。王貴智等[29]在唐古特大黃莖蒽醌類化合物組織化學定位研究中發現蒽醌類化合物在唐古特大黃莖中的分布是多位點的，主要分布在表皮、近表皮的皮層細胞、維管束中木質部和韌皮部的薄壁細胞及髓射線細胞中。譚凱麗等[30]應用顯微組織化學定位方法發現何首烏中的蒽醌類物質主要存在于塊根內。沈宗根等[31]對蒽醌類物質定位研究指出蒽醌類物質在蘆薈葉內的貯藏方式是呈多位點的，且貯水組織細胞中不貯存蒽醌類物質。

2.2.5 揮發油研究 穆靖[32]利用石蠟切片技術和蘇丹Ⅲ溶液對揮發油進行組織化學定位，發現揮發油主要分布在根莖的皮層、髓及根的皮層中。

2.2.6 其他有效成分研究 殷奎德等[33]在擬南芥葉片超氧自由基的組織化學定位研究中指出，在逆境條件下超氧自由基可能會發生變化。呂洪飛等[34]對元寶草葉的分泌結構與其次生產物研究指出，分泌細胞團分泌的金絲桃素主要分布于海綿組織中，其中分泌小管道分泌的揮發油分布于各器官的韌皮部中，分泌囊分泌的揮發油分布于上下表皮之間或海綿組織和柵欄組織中。包英華等[36]通過實驗研究優化了金釵石斛多糖組織化學定位方法，明確金釵石斛多糖主要分布在根的皮層薄壁細胞、莖的維管束周圍薄壁細胞內。張瑩等[36]指出分泌道是明黨參中香豆素積累的主要場所。李鵬等[37]利用石蠟切片法研究紫錐菊藥用部位的結構，利用組織化學的方法研究了多酚類化合物的分布。

3 討論

中藥材包含植物、動物、礦物、其他等類型，其中植物藥應用廣泛，約占中藥資源總量的80%。中藥的有效成分是藥物預防和治愈疾病的基礎，而這些有效成分存在中藥的組織細胞中，且大多是組織細胞的次生代謝產物。次生代謝產物包含黃酮類化合物、生物堿類化合物、多糖類化合物及油脂類化合物等，藥用植物的生理活性水平高低直接關系到中藥的品質優劣。因此，應用顯微組織化學方法對植物內部組織結構觀察，進而對藥用部位有效成分進行定位研究，尋找生長環境迫使有效成分動態積累規律，在中藥材栽培過程中使有效成分在有效部位大量積累，從而提升中藥材的品質，為中藥材的開發利用創造有利條件。

隨著顯微技術發展的逐步成熟，不僅可以用于對固定的死細胞與組織切片顯色的靜態觀察，還能對活的細胞組織中特征性物質進行動態觀察。可以把新鮮藥用植物有效部位切片假想成一個發生化學反應的“容器”，通過超微管道滴加試劑進行組織間的化學反應，可在細胞組織中直接觀察物質發生化學反應的全過程，顯微組織化學研究由單純的形態定位轉為結構與功能的結合研究，大大擴充了研究范圍，也是顯微組織化學定位今后發展的一個新方向。

[1] 德日阿帕利捷.植物顯微化學實驗指導[M].余名侖，譯.北京：北京人民教育出版社，1956.

[2] 鄭艷，徐珞珊，王崢濤.組織化學在藥用植物研究中的應用[J].現代中藥研究與實踐，2007，22(3)：61-64.

[3] 胡正海.藥用植物的結構、發育與其主要藥用成分積累關系的研究[J].中國野生植物資源，2005，24(1)：8-12.

[4] 樓之岑，李勝華.中草藥性狀和顯微鑒定法[M].北京：北京醫科大學 中國協和醫科大學聯合出版社，1997：21-22，112-123.

[5] 葛楚源，陳文列，李鉆芳，等.草珊瑚植物葉、莖顯微結構與黃酮組織化學定位研究[J].中國中藥雜志，2011，37(4)：438-440.

[6] 陳婧.蕤核的形態解剖學及組織化學定位研究[D].太原：山西師范大學，2012.

[7] 康杰芳，李娜，袁琴琴，等.銀線草營養器官結構及主要成分的組織化學定位[J].西北植物學報，2010，30(12)：2412-2416.

[8] 廖云海，陸嘉惠，李娜，等.光果甘草營養器官結構及其總黃酮的組織化學定位和含量研究[J].西北植物學報，2010，30(12)：2406-2411.

[9] 李娜，康杰芳，袁琴琴，等.多穗金粟蘭營養器官的形態結構及組織化學研究[J].武漢植物研究，2011，29(4)：507-511.

[10] 葉祖云，阮少江，王雅英，等.太子參微塊根發育的解剖學與組織化學定位[J].植物生理學通訊，2009，45(10)：981-985.

[11] 林如，曹玉芳，胡正海.絞股藍積累人參皂苷的組織結構的研究[J].中草藥，2002，33(10)：944-946.

[12] 王桂芹，努爾巴衣·阿布都沙勒克.野生與栽培白頭翁藥用部位解剖結構和皂苷組織化學定位[J].云南植物研究，2007，29(5)：492-496.

[13] 劉世彪，廖海民，胡正海.絞股藍營養器官各發育階段結構與總皂甙含量相關性的研究[J].武漢植物學研究，2005，23(2)：144-148.

[14] 譚玲玲，胡正海，陳瑩，等.北柴胡營養器官中主要化學成分的組織化學定位及其含量比較[J].分子細胞生物學報，2007，40(4)：214-222.

[15] 王桂芹，努爾巴衣·阿布都沙勒克，時維靜.不同生長年限白頭翁根的解剖結構與皂苷組織化學定位研究[J].激光生物學報，2008，17(3)：412-416.

[16] 高玲玲，劉文哲.遠志根的形態發生及組織化學研究[J].熱帶亞熱帶植物學報，2008，16(1)：1-9.

[17] 滕紅梅，房敏峰，胡正海.卵葉遠志營養器官的結構及遠志皂苷的組織化學定位和含量測定[J].分子細胞生物學報，2009，42(1)：61-69.

[18] 鐘霞軍，李雁群，黃榮韶.廬山石韋和柔軟石韋營養葉片組織化學定位研究[J].湖北農業科學，2012，51(16)：3540-3544.

[19] 喬琦，肖婭蘋，王喆之.山茱萸核果的解剖結構和組織化學定位[J].云南植物研究，2004，26(6)：651-655.

[20] 閆晉晉，慕小倩，崔宏安，等.烏頭營養器官中生物堿組織化學與積累動態研究[J].西北植物學報，2008，28(1)：85-89.

[21] 李玉萍，龍絳雪，曹福祥，等.蛇根木根部生物堿積累的組織化學定位研究[J].中南林業科技大學學報(自然科學版)，2010，30(9)：157-161.

[22] 呂洪飛，羅文姬，盛仙永，等.二種石斛屬植物和小葉石仙桃生物堿的組織化學定位[J].中國藥學雜志，2006，41(16)：824-826.

[23] 史文靜，蔡霞.苦豆子營養器官的發育解剖學及組織化學研究[J].武漢植物學研究，2008，26(1)：21-30.

[24] 閆晉晉.附子發育解剖學及生物堿積累規律研究[D].楊凌：西北林業科技大學，2008.

[25] 彭斯文，張明生，王玉芳.杜鵑蘭生物堿組織化學定位初步研究[J].世界科學技術—中醫藥現代化，2009，11(5)：728-730.

[26] 劉文哲，王自芬.喜樹幼枝的喜樹堿積累及其組織內定位[J].植物生理與分子生物學學報，2004，30(4)：405-412.

[27] 杜亞填，周樸華，許建宇，等.組織培養和HPLC法研究紅豆杉生物合成紫杉醇的組織化學定位[J].生物技術，2005，15(4)：45-48.

[28] 劉文哲，張愛新.大黃蒽醌類化合物的組織化學定位研究[J].西北植物學報，2000，20(6)：1082-1085，T007.

[29] 王貴智，楊軍，章英才.唐古特大黃莖蒽醌類化合物組織化學定位的研究[J].農業科學研究，2010，31(4)：56-58，112.

[30] 譚凱麗，廖海民.何首烏營養器官的解剖學與蒽醌類物質組織化學研究[J].貴州農業科學，2010，38(2)：32-35.

[31] 沈宗根，呂洪飛，胡正海.蘆薈屬植物葉內蒽醌類物質的組織化學定位研究[J].西北植物學報，2002，22(6)：T001-T002.

[32] 穆靖，袁強，吳秀菊.北細辛(Asarumheterotropoides)營養器官的形態結構及其揮發油的組織化學定位[J].東北農業大學學報，2009，40(2)：51-56.

[33] 殷奎德，黃海.擬南芥葉片超氧自由基的組織化學定位[J].生物學雜志，2003，20(2)：41-44.

[34] 呂洪飛，劉文哲，胡正海.元寶草的分泌結構與其次生產物的研究[J].西北植物學報，1999，19(6)：111-115.

[35] 包英華，白音，石海英.金釵石斛多糖的組織化學定位研究[J].時珍國醫國藥，2012，23(12)：3026-3028.

[36] 張瑩，陳建偉，徐建亞，等.明黨參中香豆素成分的組織定位、分布和熒光相對定量研究[J].時珍國醫國藥，2011，22(3)：625-627.

[37] 李鵬，寧熙平，吳鴻.紫錐菊藥用部位的結構及其與多酚類化合物積累的關系[J].中草藥，2007，38(4)：606-610.

TheApplicationofMicroscopicHistochemicalLocalizationinTraditionalChineseMedicineStudy

LINLi1，2*，SHIXiaolong1，GAOSufang1，CHENHonggang1

(1.DepartmentofPharmacy，GansuCollegeofTraditionalChineseMedicne，Lanzhou730000China；2.KeylaboratoryofChemistryandQualityforTraditionalChineseMedicineandTibetMedicineCollegesinGansuProvince，Lanzhou730000，China)

Based on studies of microstructure identification and dynamic histochemical location of Traditional Chinese Medicine，Summarized the frontier of microscopic histochemical，characteristic reaction and microscopic histochemical localization，using of key techniques and high-end instruments，in order to offer methodology and technical guidance for development and utilization of Chinese Medicine Resources，meanwhile，provide new research ideas and methods .Through the collected，analyzed，induced and summed up the relative literatures both at domestic and abroad from Chinese HowNet，Wanfang database and Springer Link electronic journal database.The comprehensive analysis microscopic histochemical localization technology could locate characterized material in Traditional Chinese Medicine，explore the synthesis pathway and metabolic law.The technology had great development potential and provided new scientific basis for quality identification of Traditional Chinese Medicine.

Microscopic，Histochemical localization，Traditional Chinese Medicine

10.13313/j.issn.1673-4890.2014.06.019

2013-07-29)