人參皂苷M1異丁酸酯衍生物的合成及高效液相分析和制備△

肖景楠，李珂珂，李爭(zhēng)寧，陳麗榮，弓曉杰*

(1.大連大學(xué) 環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院，遼寧 大連 116622；2.大連大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，遼寧 大連 116622)

研究開(kāi)發(fā)

國(guó)家自然科學(xué)基金(81172949)；遼寧省教育廳科學(xué)技術(shù)研究一般研究項(xiàng)目(L2012439)；遼寧省優(yōu)秀人才支持計(jì)劃(LR2013058)；遼寧省科技廳科學(xué)技術(shù)計(jì)劃項(xiàng)目(2013204001)；大連市科技局科技計(jì)劃項(xiàng)目(2013E11SF055)

*

弓曉杰，男，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：中藥新藥開(kāi)發(fā)；E-mail：gxjclr@163.com

人參皂苷M1異丁酸酯衍生物的合成及高效液相分析和制備△

肖景楠1，李珂珂2，李爭(zhēng)寧1，陳麗榮1，弓曉杰2*

(1.大連大學(xué) 環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院，遼寧 大連 116622；2.大連大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，遼寧 大連 116622)

目的研究人參皂苷M1異丁酸酯合成過(guò)程中產(chǎn)物的高效液相分析及快速制備方法。方法采用保護(hù)-酯化-去保護(hù)的方法，定向修飾得到M1糖基3-位酯化的產(chǎn)物；利用反相高效液相色譜，采用DAD檢測(cè)器，通過(guò)對(duì)分析條件的優(yōu)化，建立人參皂苷M1異丁酸酯及其兩個(gè)中間產(chǎn)物的分析制備方法。結(jié)果人參皂苷M1異丁酸酯及其中間產(chǎn)物的分析和制備時(shí)間均在40 min以內(nèi)快速高效地獲得；綜合三步反應(yīng)和高效液相制備結(jié)果，合成人參皂苷M1異丁酸酯的得率為36.7%，純度為98.3%。結(jié)論采用HPLC法，在M1衍生物合成過(guò)程中可以快速高效地進(jìn)行人參皂苷M1衍生物的分析和制備。

人參皂苷M1；結(jié)構(gòu)修飾；高效液相；含量分析

人參皂苷是人參的主要活性成分，目前人參皂苷在動(dòng)物體內(nèi)的代謝已成為一個(gè)重要的研究方向，通過(guò)體內(nèi)代謝產(chǎn)物的分析來(lái)明確人參皂苷實(shí)際發(fā)揮藥效的成分[1-2]。大量的研究表明，口服人參后被腸道菌群代謝得到的人參皂苷M1是體內(nèi)的主要代謝產(chǎn)物，并且M1又進(jìn)一步在肝臟中與脂肪酸酯化轉(zhuǎn)化為EM1[3-5]，從而延長(zhǎng)其在體內(nèi)的存留時(shí)間，表現(xiàn)出更強(qiáng)的活性作用，如抗腫瘤活性[6]。在已完成的實(shí)驗(yàn)研究中，我們合成了不同碳鏈長(zhǎng)度、糖基上不同取代位置的多種人參皂苷M1脂肪酸酯衍生物，并研究了其抗腫瘤活性和構(gòu)效關(guān)系[7-8]。

在本研究中，我們采用保護(hù)-酯化-去保護(hù)的策略，有選擇性地合成3-位糖基酯化產(chǎn)物，并利用反相高效液相色譜方法，建立了中間產(chǎn)物、終產(chǎn)物的分析和制備方法，為快速、大量地分析和制備人參皂苷修飾物奠定了理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 儀器、試劑和材料

1.1 儀器

高效液相色譜儀：[分析型Agilent 1260，Agilent C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；制備型LC 3000，C18色譜柱(250 mm×10 mm，5 μm)，電子天平(上海梅特勒-托利多儀器有限公司)，ETS-D4加熱磁力攪拌器(德國(guó)IKA公司)。

1.2 試劑

甲醇為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。

1.3 材料

人參皂苷M1(大連富生天然藥物有限公司，批號(hào):20100321)，經(jīng)NMR及MS測(cè)定純度為98%。人參皂苷M1的硅醚衍生物、人參皂苷M1硅醚衍生物的異丁酸酯及人參皂苷M1的異丁酸酯，自制并鑒定結(jié)構(gòu)。

2 方法和結(jié)果

2.1 衍生物的合成

2.1.1 人參皂苷M1叔丁基二甲基硅醚的合成 人參皂苷M1與5倍量的叔丁基二甲基氯硅烷在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，以三乙胺為溶劑在室溫下反應(yīng)24 h后，加入飽和氯化銨溶液終止反應(yīng)。經(jīng)二氯甲烷(CH2Cl2)萃取、Brine洗有機(jī)相、無(wú)水Na2SO4干燥并濃縮溶劑[9]。

2.1.2 人參皂苷M1叔丁基二甲基硅醚異丁酸酯的合成 將第一步純化后的人參皂苷M1的叔丁基二甲基硅醚與5%當(dāng)量的DMAP在氮?dú)獗Ｗo(hù)、冰水浴下加入適量的CH2Cl2溶解，與三乙胺反應(yīng)10 min后，加入等當(dāng)量的異丁酰氯，反應(yīng)24 h，然后加入飽和氯化銨溶液停止反應(yīng)。經(jīng)CH2Cl2萃取，Brine洗有機(jī)相，無(wú)水Na2SO4干燥，濃縮溶劑[7]。

2.1.3 人參皂苷M1異丁酸酯的合成 將液相制備的人參皂苷M1硅醚衍生物的異丁酸酯加入到50 mL的圓底燒瓶中，用無(wú)水四氫呋喃溶解，加入1.5倍量的四丁基氟化銨，反應(yīng)2 h后停止。旋干無(wú)水四氫呋喃溶液，加入CH2Cl2溶解并用其萃取，Brine洗有機(jī)相，無(wú)水Na2SO4干燥，濃縮溶劑[10-11]。合成反應(yīng)如圖1所示。

圖1 人參皂苷M1異丁酸酯的合成路線

2.2 高效液相分析條件的確定

2.2.1 色譜柱的選擇 分別采用Agilent C18不同長(zhǎng)度及型號(hào)的色譜柱進(jìn)行合成產(chǎn)物的分離實(shí)驗(yàn)。綜合實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本實(shí)驗(yàn)選用Zorbax Eclipse XDB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱，可以達(dá)到較好的分離效果。

2.2.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 人參皂苷M1的單醚化衍生物采用DAD檢測(cè)器進(jìn)行190～400 nm檢測(cè)時(shí)，發(fā)現(xiàn)其單醚化衍生物在203 nm下有最大吸收[12]。因而在實(shí)驗(yàn)操作中采用203 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.2.3 流動(dòng)相的選擇 實(shí)驗(yàn)中根據(jù)人參皂苷M1合成衍生物的結(jié)構(gòu)特征，在乙腈-水體系和甲醇-水體系之間進(jìn)行了篩選。從分離度和峰形來(lái)看，95%甲醇-水體系較適合作為分離人參皂苷M1單醚化衍生物的流動(dòng)相。

2.2.4 流速的選擇 本實(shí)驗(yàn)參照文獻(xiàn)報(bào)道[13]對(duì)流動(dòng)相的流速也進(jìn)行了條件優(yōu)化，采用甲醇-水體系為流動(dòng)相，在流速為1.0 mL·min-1時(shí)，合成產(chǎn)物中雜質(zhì)峰與目標(biāo)峰分離效果較好，且目標(biāo)峰的出峰時(shí)間適宜，故流速定為1.0 mL·min-1。

2.2.5 柱溫的選擇 考查了不同溫度下的衍生物分離度，實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，柱溫為25 ℃時(shí)，分離效果較好。

2.3 中間產(chǎn)物及終產(chǎn)物高效液相分析和制備

2.3.1 人參皂苷M1叔丁基二甲基硅醚的測(cè)定 將合成產(chǎn)物制備成濃度為5.0 mg·mL-1的甲醇溶液，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，采用2.2的色譜條件，進(jìn)樣10 μL。得到的人參皂苷M1叔丁基二甲基硅醚的色譜圖見(jiàn)圖2。

圖2 人參皂苷M1叔丁基二甲基硅醚的液相色譜圖

從色譜圖中可以看出，連接上保護(hù)基后產(chǎn)物有4個(gè)，其中1號(hào)峰為人參皂苷M1叔丁基二甲基硅醚。根據(jù)峰面積百分比計(jì)算法，其占產(chǎn)物含量的84.06%，見(jiàn)表1。

2.3.2 人參皂苷M1叔丁基二甲基硅醚的制備 采用分析型高效液相色譜建立的色譜條件，經(jīng)制備型高效液相純化，得到的色譜圖見(jiàn)圖3。其中37.14 min(峰1)所出的色譜峰即為人參皂苷M1叔丁基二甲基硅醚。收集該處色譜峰流出液、濃縮，即得第一步反應(yīng)產(chǎn)物。

表1 人參皂苷M1叔丁基二甲基硅醚合成產(chǎn)物中化合物出峰時(shí)間及相應(yīng)峰面積百分比

圖3 人參皂苷M1叔丁基二甲基硅醚的制備液相色譜圖

2.3.3 人參皂苷M1叔丁基二甲基硅醚的異丁酸酯的測(cè)定 將合成產(chǎn)物制備成濃度為5.0 mg·mL-1的甲醇溶液，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，采用2.2的色譜條件，進(jìn)樣10 μL。得到的人參皂苷M1叔丁基二甲基硅醚的異丁酸酯的色譜圖見(jiàn)圖4。

圖4 人參皂苷M1叔丁基二甲基硅醚與異丁酰氯酯化產(chǎn)物的液相色譜圖

從色譜圖中可以看出，酯化后的產(chǎn)物有4個(gè)，其中1號(hào)峰為酯化產(chǎn)物。根據(jù)峰面積百分比計(jì)算法，其占產(chǎn)物含量的77.59%，見(jiàn)表2。

2.3.4 人參皂苷M1叔丁基二甲基硅醚的異丁酸酯的制備 采用分析型高效液相色譜建立的色譜條件，經(jīng)制備型高效液相純化，得到的色譜圖見(jiàn)圖5。其中36.95 min所出的色譜峰(峰1)即為人參皂苷M1叔丁基二甲基硅醚的異丁酸酯。收集該處色譜峰流出液，濃縮，即得第二步反應(yīng)產(chǎn)物。

表2 人參皂苷M1叔丁基二甲基硅醚異丁酸酯合成產(chǎn)物的出峰時(shí)間及相應(yīng)峰面積百分比

圖5 人參皂苷M1叔丁基二甲基硅醚與異丁酰氯酯化產(chǎn)物的制備液相色譜圖

2.3.5 人參皂苷M1異丁酸酯的測(cè)定 將脫去硅醚保護(hù)基的合成產(chǎn)物制備成濃度為5.0 mg·mL-1的甲醇溶液，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，采用2.2的色譜條件，進(jìn)樣10 μL。得到的人參皂苷M1異丁酸酯的色譜圖見(jiàn)圖6。

圖6 人參皂苷M1異丁酸酯的液相色譜圖

從色譜圖中可以看出，脫保護(hù)基后的產(chǎn)物有3個(gè)，其中1號(hào)峰為目標(biāo)產(chǎn)物。根據(jù)峰面積百分比計(jì)算法，其占產(chǎn)物含量的58.65%，見(jiàn)表3。

表3 人參皂苷M1異丁酸酯合成產(chǎn)物的出峰時(shí)間及相應(yīng)峰面積百分比

2.3.6 人參皂苷M1異丁酸酯的制備 采用分析型高效液相色譜建立的色譜條件，經(jīng)制備型高效液相純化，得到的色譜圖見(jiàn)圖7。其中34.59 min(峰1)所出的色譜峰即為人參皂苷M1異丁酸酯。收集該處色譜峰流出液、濃縮，即得反應(yīng)終產(chǎn)物。

圖7 人參皂苷M1異丁酸酯的制備液相色譜圖

2.4 人參皂苷M1異丁酸酯得率的計(jì)算

投入人參皂苷M1 100.0 mg，液相制備后得到純?nèi)藚⒃碥誐1叔丁基二甲基硅醚(M1-OTBS)98.4 mg，可以得出第一步反應(yīng)的產(chǎn)率為83.2%；第二步酯化反應(yīng)投入M1-OTBS總量為95.0 mg，液相制備后得到純的目標(biāo)產(chǎn)物為77.8 mg，酯化產(chǎn)率為74.8%；最后脫去硅醚保護(hù)基的反應(yīng)投入人參皂苷M1硅醚的異丁酸酯為75.0 mg，液相制備后得到純的人參皂苷M1異丁酸酯為37.5 mg，脫保護(hù)反應(yīng)產(chǎn)率為58.3%。由以上三步反應(yīng)的產(chǎn)率可以得到人參皂苷M1經(jīng)過(guò)保護(hù)-酯化-去保護(hù)策略生成人參皂苷M1異丁酸酯的得率為36.7%。

3 討論

3.1 人參皂苷M1叔丁基二甲基硅醚的液相結(jié)果分析

由于人參皂苷M1的糖苷基上的6位羥基最為活潑，所以人參皂苷M1與叔丁基二甲基氯硅烷反應(yīng)的主產(chǎn)物為糖苷基6位上的單硅醚，這個(gè)過(guò)程伴隨生成多種人參皂苷M1硅醚異構(gòu)體，這些副產(chǎn)物與糖苷基上6位硅醚的人參皂苷M1衍生物極性相似，難以分離提純，而我們?cè)诟咝е苽湟合嗌峡梢院芾硐氲貙⑵浞珠_(kāi)，液相色譜圖(見(jiàn)圖2)上主產(chǎn)物的出峰時(shí)間為19.89 min，整合合成人參皂苷M1的各硅醚衍生物的峰面積，可以得出糖苷基6位上人參皂苷M1單硅醚衍生物在醚化后樣品內(nèi)的含量為84.06%，并將優(yōu)化后的液相條件應(yīng)用于人參皂苷M1硅醚衍生物的液相制備。在制備過(guò)程中，未把2～4號(hào)峰全部分流收集，將其混入下一針的制備中流入廢液以節(jié)省時(shí)間、節(jié)約試劑。從結(jié)果來(lái)看，不影響人參皂苷M1叔丁基二甲基硅醚的純度，收集物純度為97.5%。

3.2 人參皂苷M1硅醚衍生物與異丁酰氯酯化產(chǎn)物的液相結(jié)果分析

人參皂苷M1的硅醚衍生物與等當(dāng)量的異丁酰氯酯化過(guò)程，根據(jù)位阻大小的影響，反應(yīng)的主產(chǎn)物為糖苷基3位上異丁酸酯的人參皂苷M1衍生物[14-15]，其出峰時(shí)間為19.61 min，其在酯化反應(yīng)后樣品內(nèi)的含量為77.59%，通過(guò)液相制備后純度達(dá)到96.8%。在制備過(guò)程中，圖4中的2～4號(hào)峰亦未收集流分，轉(zhuǎn)入下一針的廢液中，即制備色譜圖(圖5)中11.14、13.26、15.58 min的3個(gè)峰。

3.3 人參皂苷M1衍生物脫去硅烷保護(hù)基后的產(chǎn)物液相結(jié)果分析

人參皂苷M1衍生物脫去硅烷保護(hù)基的同時(shí)有部分酯基發(fā)生水解生成了人參皂苷M1，人參皂苷M1異丁酸酯的出峰時(shí)間為11.26 min，在脫去保護(hù)基后的樣品內(nèi)含量為58.65%，液相制備后人參皂苷M1異丁酸酯的純度為98.3%。

綜上，本文通過(guò)高效液相色譜法準(zhǔn)確分析得到人參皂苷M1合成衍生物中目標(biāo)產(chǎn)物的含量，探索出最佳的人參皂苷M1合成衍生物的液相制備條件，包括檢測(cè)波長(zhǎng)、流動(dòng)相組成、流速等，確定了樣品中各組分出峰時(shí)間，并將優(yōu)化后的條件應(yīng)用于液相制備，從而達(dá)到快速準(zhǔn)確分離的目的，解決了人參皂苷M1合成目標(biāo)衍生物與反應(yīng)過(guò)程中伴隨生成的異構(gòu)體之間所存在的分離提純難題，產(chǎn)物損失量小且方法簡(jiǎn)捷可行。

[1] Lee J，Lee E，Kim D，et al.Studies on absorption，distribution and metabolism of ginseng in humans after oral administration[J].J Ethnopharmacol，2009，122(1)： 143-148.

[2] Qian TX，Cai ZW.Biotransformation of ginsenosides Rb1，Rg3and Rh2in rat gastrointestinal tracts[J].Chin Med，2010，5：19-25.

[3] Hasegawa H，Lee KS，Nagaoka T，et al.Pharmacokinetics of ginsenoside deglycosylated by intestinal bacteria and its transformation to biologically to biologically active fatty acid esters[J].Biol Pharm Bull，2000，23(3)： 298-304.

[4] Bae EA，Choo M，Park EK，et al.Metabolism of ginsenoside Rc by human intestinal bacteria and its related antiallergic activity[J].Biol Pharm Bull，2002，25(6)：743-747.

[5] Tawab MA，Bahr U，Karas M，et al.Degradtion of ginsenosides in humans after oral administration[J].Drug Metab Dispos，2003，31(8)：1065-1071.

[6] Bae EA，Han MJ，Choo MK，et al.Metabolism of 20(S)-and 20(R)-ginsenoside Rg3by human intestinal bacteria and its relation to in vitro biological activities[J].Biol Pharm Bull，2002，25(1)：58-63.

[7] Li WF，Li ZN，Chen LR，et al.Synthesis and structural analysis of mono-dodecanoic acid esters of ginsenoside M1[J].Chin J Nat Med，2011，9(3)：199-203.

[8] Li WF，Chen LR，Gong XJ，et al.Synthesis of esters of ginsenoside metabolite M1 and their cytotoxicity on MGC80-3 cells[J].Molecules，2013，18(4)：3689-3702.

[9] Kawabata T，Muramatsu W，Nishio T，et al.A catalytic one-step process for the chemo-and regioselective acylation of monosaccharides[J].J Am Chem Soc，2007，129(42)：12890-12895.

[10] White JD，Amedio Jr JC，Gut S，et al.Synthesis of the macrolactone alkaloid(+)-usaramine via necic acid coupling to a pyrrolizidine borane[J].J Org Chem，1989，54(18)：4268-4270.

[11] Chen HL，Huang YM，Chang CT，et al.Dicarboxylic acid ester derivatives of ginsenoside，pharmacevical preparations containing the same，and preparation thereof： United States Patent，WO2006113495 A2[P].2006-10-26.

[12] 鄭長(zhǎng)龍，魚(yú)紅閃，金鳳燮.人參稀有皂苷C-K的分離與純化[J].大連工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2003，22(3)：167-169.

[13] 周偉，羅振時(shí).反相高效液相色譜法測(cè)定人參皂苷Compound-K的含量[J].色譜，2005，23(3)：270-272.

[14] 孫印石，劉政波，孫彥君，等.RP-HPLC法測(cè)定人參皂苷Compound K 的合成產(chǎn)物棕櫚酸酯PM1的轉(zhuǎn)化率[J].天然產(chǎn)物研發(fā)與開(kāi)發(fā)，2007，19(2)：309-312.

[15] Jansson PE，Kenne L，Schweda E.Nuclear magnetic resonance and conformational studies on monoacetylated methyl D-gluco-and D-galacto-pyranosides[J].J Chem Soc Perkin Trans，1987，1： 377-383.

SynthesisofGinsenosideM1IsobutyrateanditsAnalysisandPreparationbyHPLC

XIAOJingnan1，LIKeke2，LIZhengning1，CHENLirong1，GONGXiaojie2

(1.CollegeofEnvironmentalandChemicalEngineering，DalianUniversity，Dalian116622，China；2.CollegeofMedical，DalianUniversity，Dalian116622，China)

Objective：Ginsenoside M1 isobutyrate and the intermediate product in the process of synthesis were analyzed and prepared by HPLC.MethodsUsing the protection esterification-deprotection strategy，ginsenoside M1 3-sugar residues esterification product was synthesed.The analysis and preparation method of M1 isobutyrate and the intermediate product by RP-HPLC-DAD was established and optimized.ResultsThe analysis time of ginsenoside M1 isobutyrate and the intermediate product was all less than 40 minutes.Taking all the three steps of synthesis into account，the yield was 36.7%，and purity was 98.3%.ConclusionThe HPLC method put forward a rapid and efficient strategy to deal with the products through the process of ginsenoside M1 synthesis.

Ginsenoside M1；Structural modification；HPLC；Content analysis

10.13313/j.issn.1673-4890.2014.05.005

2014-04-01)