鼻腦通鼻用噴霧劑抑制過氧化氫致SH-SY5Y神經細胞損傷的研究△

侯虹麗，孫芳玲，咸明慧，趙潤懷，肖蘇萍，艾厚喜，張麗，王文*

(1.首都醫科大學 宣武醫院，北京 100053；2.北京祈福瑞草醫藥科技有限公司，北京 100094；3.中國藥材公司，北京 100195)

“重大新藥創制”科技重大專項(2011ZX09102-003-05)

*

王文，主要研究方向：神經藥理、中藥藥理；Tel：(010)83198881，E-mail：lzwwang@163.com

鼻腦通鼻用噴霧劑抑制過氧化氫致SH-SY5Y神經細胞損傷的研究△

侯虹麗1，孫芳玲1，咸明慧2，趙潤懷3，肖蘇萍3，艾厚喜1，張麗1，王文1*

(1.首都醫科大學 宣武醫院，北京 100053；2.北京祈福瑞草醫藥科技有限公司，北京 100094；3.中國藥材公司，北京 100195)

目的研究鼻腦通對H2O2誘導的人神經母細胞瘤細胞系SH-SY5Y細胞損傷的影響。方法培養的人神經母細胞瘤細胞系SH-SY5Y細胞給予鼻腦通(0.04，0.4，4 μg·mL-1)預孵育24 h后，加入H2O21 000 μmol·L-1作用18 h誘導產生損傷，測定細胞上清液中血管活性肽內皮素-1(ET-1)、降鈣素基因相關肽(CGRP)；炎癥因子白細胞介素-1α(IL-1α)、白細胞介素-8(IL-8)；致痛物質P物質(SP)、5-羥色胺(5-HT)、一氧化氮(NO)的含量。結果與對照組相比，損傷組細胞上清液血管活性肽ET-1、CGRP含量顯著增多(P<0.01，P<0.05)；炎癥因子IL-8含量顯著增多(P<0.01)；致痛物質SP、5-HT、NO含量顯著增多(P<0.01，P<0.01，P<0.05)。而與損傷組相比，鼻腦通中、高劑量組細胞上清液血管活性肽ET-1含量降低(P<0.05，P<0.001)，且炎癥因子IL-8含量也降低(P<0.05，P<0.01)；鼻腦通中、高劑量組致痛物質SP含量比損傷組減少(P<0.05，P<0.05)，高劑量組5-HT、NO含量比損傷組減少(P<0.05，P<0.05)。結論鼻腦通治療偏頭痛的機制可能與降低H2O2誘導的SH-SY5Y細胞損傷后血管活性肽ET-1、炎癥因子IL-8釋放以及抑制致痛物質SP、5-HT、NO的釋放有關。

鼻腦通；SH-SY5Y神經細胞；ET-1；CGRP；IL-1α；IL-8；SP；5-HT；NO

國內外研究表明，多種心血管疾病和神經系統疾病在一定程度上歸咎于炎癥反應，而活性氧(ROS)則是炎癥反應的重要誘發因素之一[1]。過氧化氫(H2O2)常用作細胞氧化損傷的誘導劑，通過誘導ROS產生，引發炎癥反應，從而參與多種神經系統等疾病的發病機制。文獻報道顯示，在心肌細胞H2O2誘導損傷模型上，觀察到細胞內TNF-α、TGF-β1、NF-κB等炎癥因子的表達[2]；在小鼠皮層神經元H2O2誘導損傷模型和SH-SY5Y細胞氧化損傷模型上，檢測親環蛋白A(CypA)的表達[3]；在人臍靜脈內皮細胞H2O2誘導損傷模型，來檢測IL-6、NF-ΚB-P65炎癥因子的表達[4]；以及在支氣管上皮細胞H2O2誘導損傷模型，檢測白細胞介素-8與谷胱甘肽的表達[5]。可見H2O2損傷細胞模型已成為研究心血管和神經系統疾病炎性機制及抗炎治療的常用模型。

偏頭痛是一種臨床常見的慢性神經血管紊亂性疾病，其特點是反復發作并伴有惡心、嘔吐、畏光、畏聲的單側頭痛。盡管偏頭痛的病理生理機制尚未被完全闡明，目前認為三叉神經血管學說在偏頭痛發病機制中占主導地位，神經源性炎癥是其中的關鍵環節[6]。最新研究顯示，非甾體抗炎藥可有效治療偏頭痛及其發作過程中顱內炎癥介質水平的升高，并據此提出了新的假說，即偏頭痛是一種炎性疾病[7]。

鼻腦通鼻用噴霧劑是根據中醫“腦竅通于鼻”、“納鼻而通十二經”理論研發，集川芎、冰片、大果木姜子等中藥辛溫活血、通竅止痛的組方，一部分中藥經水提、濃縮、醇沉、回收乙醇得浸膏；一部分中藥經醇提、水提和直接溶解，再經β-環糊精包合、配液等現代工藝精制而成的鼻用噴霧劑。本藥采用液相、氣相色譜法對處方中川芎、冰片的質量進行測定，對川芎、大果木姜子等進行薄層色譜鑒別，對每噴劑量、pH值、微生物限量等進行了規定。經動物藥效、毒理試驗研究和藥物穩定性研究證明，本藥物具有速效止痛的藥效，無明顯毒副作用，且質量穩定可控，目前已獲得國家藥物臨床批件。本實驗在SH-SY5Y細胞損傷模型上，檢測鼻腦通對血管肽內皮素-1(ET-1)、降鈣素基因相關肽(CGRP)和相關炎癥因子白介素-1α(IL-1α)、白介素-8(IL-8)以及致痛物質P物質(SP)、5-羥色胺(5-HT)、一氧化氮(NO)的影響，以探討鼻腦通治療偏頭痛的可能機制，為尋找預防和治療偏頭痛的有效藥物提供依據。

1 材料

1.1 藥品與試劑

鼻腦通鼻用噴霧劑(中國藥材公司提供，規格：0.8 mg·mL-1，即1 mL溶液中含有0.8 mg生藥量)。人神經母細胞瘤SY5Y細胞株(瑞典卡羅林斯卡研究所Bengt Winblad 教授和裴進京博士贈送)。DMEM-F12(Gibco，Cat No:12400-024，Lot No:984278)。胎牛血清(浙江天杭生物科技有限公司，批號：121017)。二甲基亞砜(DMSO)(Amresco，Lot No:12A0219。30%H2O2(北京化工廠，批號：20120331)。5-HT試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號：LOT#M20130331，生產日期：20130331)。NO試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號：20130318，有效日期：20130617)。SP試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號：LOT#M20130331)。ET-1試劑盒(南京建成生物工程所，批號：LOT#M20130402)。CGRP試劑盒(南京建成生物工程所，批號：LOT#M20130402)。IL-1α試劑盒：南京建成生物工程研究所，批號：LOT#M20130330)。IL-8試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號：LOT#M20130330)。

1.2 儀器與設備

IX71倒置顯微鏡(OLYMPOS)，CO2培養箱(SANYO)，全波長酶標儀(Thermofisher Multiskan Spectrum)。BY-R320低溫高速離心機(北京白洋醫用離心機有限責任公司),HP8453紫外-可見分光光度計(美國惠普)。

2 方法

2.1 細胞培養及樣品處理

SH-SY5Y細胞于DMEM-F12培養基中加入體積分數為10%的滅活胎牛血清、青霉素1×105U·L-1、鏈霉素1×105U·L-1，在體積分數為5% 、37 ℃的CO2培養箱中培養，每周換液3次，傳代2次。

細胞以1×104·mL-1密度接種在96孔培養板中，每孔加入150 μL完全培養基，37 ℃、5% CO2培養24 h，吸棄原完全培養基后，空白組和損傷組分別加入70 μL無血清培養基，損傷加藥組分別加入終濃度為0.04，0.4，4 μg·mL-1的70 μL無血清培養基，37 ℃、5%CO2培養24 h，吸棄培養基后，空白組加入70 μL無血清培養基，其余各組加入70 μL 1 000 μmol·L-1H2O2損傷18 h，吸取上清液。

按照試劑盒的說明進行血管肽ET-1、CGRP和炎癥因子 IL-1α、IL-8以及致痛物質SP、5-HT、NO各項指標的測定。

2.2 統計學處理

3 結果

3.1 鼻腦通對H2O2損傷誘導血管肽ET-1、CGRP升高的影響

與對照組相比，損傷組細胞上清液ET-1含量升高(P<0.01)。給藥組(中、高劑量)細胞上清液ET-1含量比損傷組降低(P<0.05，P<0.001)，表明鼻腦通能降低H2O2誘導SH-SY5Y細胞氧化損傷后ET-1的含量，見圖1。與對照組相比，損傷組細胞上清液CGRP含量升高(P<0.05)，而鼻腦通給藥組細胞上清液CGRP含量與損傷組相比無明顯差別，見圖2。

3.2 鼻腦通對H2O2損傷誘導炎癥因子IL-8、IL-1α升高的影響

與對照組相比，損傷組細胞上清液IL-8含量升高(P<0.01)。給藥組(中、高劑量)細胞上清液IL-8含量比損傷組降低(P<0.05，P<0.01)，表明鼻腦通能降低H2O2誘導SH-SY5Y細胞氧化損傷后IL-8的含量，見圖 3。同時檢測IL-1α的含量，與對照組相比，損傷組細胞上清液IL-1α有升高趨勢，但鼻腦通給藥組細胞上清液IL-1α含量與損傷組相比無明顯差異，見圖 4。

3.3 鼻腦通對H2O2損傷誘導致痛物質SP、5-HT、NO升高的影響

與對照組相比，損傷組細胞上清液SP含量升高(P<0.01)。給藥組(中、高劑量)細胞上清液SP含量比損傷組降低(P<0.05，P<0.01)，表明鼻腦通能降低H2O2誘導SH-SY5Y細胞氧化損傷后SP的含量，見圖5。

與對照組相比，損傷組細胞上清液5-HT含量明顯升高(P<0.01)。給藥組(高劑量)細胞上清液5-HT含量比損傷組降低(P<0.05)，表明鼻腦通能降低H2O2誘導SH-SY5Y細胞氧化損傷后5-HT的含量，見圖6。

與對照組相比，損傷組細胞上清液NO含量升高(P<0.05)。給藥組(高劑量)細胞上清液NO含量比損傷組降低(P<0.05)，表明鼻腦通能降低H2O2誘導SH-SY5Y細胞氧化損傷后NO的含量，見圖7。

注：與對照組比較，## P<0.01；與損傷組比較，* P<0.05，***P<0.001圖1 鼻腦通對細胞上清液ET-1含量的影響

注：與對照組比較，#P<0.05圖2 鼻腦通對細胞上清液CGRP含量的影響

注：與對照組比較，##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01圖3 鼻腦通對細胞上清液IL-8含量的影響

圖4 鼻腦通對細胞上清液IL-1α含量的影響

注：與對照組比較，#P<0.01；與模型組比較，*P<0.05圖5 鼻腦通對損傷組細胞上清液SP含量的影響

注：與對照組比較，##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05圖6 鼻腦通對損傷組細胞上清液5-HT含量的影響

注：與對照組比較，#P<0.05；與模型組比較，*P<0.05圖7 鼻腦通對損傷組細胞上清液NO含量的影響

4 討論

根據WHO全球疾病負擔調查，2000年結果顯示，偏頭痛被列為世界第19種致殘原因，占全年殘疾的1.4%；2010年結果顯示，偏頭痛則上升為全球第7種致殘原因[8]。雖然偏頭痛病理生理學的確切機制仍不清楚，但近年對其病理機制的研究有了很大的進展，認為其涉及5-HT、CGRP、NO等多種因素[9]。偏頭痛的發作涉及中樞神經系統的主要活動，可能牽涉到離子通道和環境的變化，進而導致皮層擴布性抑制[10]，由于腦功能障礙而激活三叉神經血管系統，進一步激活三叉神經血管反射，導致腦膜血管過度擴張，血漿蛋白滲出，肥大細胞釋放組胺，血管周圍神經釋放血管活性肽如CGRP、ET等引起神經源性炎癥，釋放許多炎性細胞因子如白介素-1、白介素-2、白介素-6、白介素-8、白介素-10和腫瘤壞死因子，以及血管致痛物質SP、5-HT、His、NO等[11]。在體外實驗研究中，H2O2損傷細胞模型被廣泛用于炎癥機制以及藥物干預作用的研究。大量研究表明[12-13]，氧化應激可導致機體產生內源性的損傷，激活炎性相關信號通路，通過促進如NF-κB核因子的表達，進一步增加細胞因子如IL-1、IL-6等的釋放，介導炎癥反應。據報道[14]，NF-κB/crel家族的某些轉錄因子可以直接被過氧化氫或電離輻射激活。陳花[15]在細胞過氧化氫模型上研究了辛伐他汀對炎癥因子血管黏附蛋白-1、核因子-κB表達的影響，證明辛伐他汀可抑制過氧化氫誘導的兔血管平滑肌細胞核因子-κB的表達，具有抗炎抗氧化的作用；Schreck等[16]研究顯示，過氧化氫損傷Jurkat T細胞，可以激活NF-κB，從而介導炎癥因子的釋放。本文在過氧化氫損傷SH-SY5Y細胞模型上檢測IL-1、IL-8、NO等多種炎癥反應相關因子的含量，表明鼻腦通噴霧劑可以抑制炎癥相關因子的釋放。

CGRP是三叉神經疼痛信號的主要介質[17]，在三叉神經的衛星細胞中檢測到功能性CGRP受體，具有一定的促炎效應，能顯著增加IL-1β的作用，增加COX-2酶的表達和激活以及NO合酶和IL-1β的表達。CGRP在皮層的星型膠質細胞中也能產生輕微的促炎效應。偏頭痛發作時在血清、腦脊液和唾液中CGRP水平升高。在神經源性炎癥中，硬腦膜上的受體促進細胞因子和炎癥介質的釋放，促進血管擴張和血管通透性的增加，CGRP介導長期持久的血管擴張，增加腦血流量，這些效應可以通過選擇性CGRP受體拮抗劑來阻斷。ET為強烈的腦動脈收縮劑，可能通過ETA和ETB受體介導神經的輸入和輸出。正常生理狀態下，ET合成釋放很低，偏頭痛發作時ET釋放增加，引發皮層擴布性抑制，ET通過血管平滑肌細胞膜上的受體與靶細胞膜結合，激活鳥苷酸環化酶、磷酸肌醇系統和Ca2+通道，增高細胞質中Ca2+濃度而影響血管張力，觸發偏頭痛[18-19]。在我們前期研究中顯示[20]，鼻腦通能降低硝酸甘油所致偏頭痛動物血漿ET-1、CGRP含量，但對正常動物給予鼻腦通噴霧劑后，其對血漿炎癥相關介質的釋放無影響。本實驗結果顯示，提前加入鼻腦通預孵育24 h后，能降低H2O2誘導的細胞損傷組上清液ET-1含量，表明鼻腦通能抑制氧化損傷后神經細胞血管活性肽的釋放。

偏頭痛可以刺激細胞因子的釋放，從而介導疼痛和免疫功能。研究表明細胞因子可能介導了偏頭痛疼痛產生的神經血管炎癥[21]，腫瘤壞死因子(TNF-α)、IL-6均可以導致超痛覺。偏頭痛發作時釋放的5-HT能夠引起毛細血管通透性增加，血漿成分滲出，導致頭顱血管舒縮改變、腦缺血及血管性炎癥，游離出疼痛介質緩激肽、前列腺素等，從而增強痛覺。目前臨床應用治療急性偏頭痛的有效藥物曲坦類就是5-HT1B/1D受體激動劑[6]。另外，P物質和NO也可傳遞痛覺信息、產生疼痛，在偏頭痛的痛覺信息傳遞中起著重要的作用[22-23]。基于NO在偏頭痛中作用的研究，最近提出了“偏頭痛的NO假說”[9]：NO在偏頭痛中發揮著一個顯著的作用，不僅可以促進偏頭痛的發作，而且涉及到發作的整個持續時間。它不僅參與痛覺的產生，而且與CGRP等重要分子之間存在一定關系。抑制NO產生或阻斷NO-cGMP途徑或者清除NO可能是治療偏頭痛新藥物的靶標。目前n-NOS和i-NOS抑制劑已經進入早期的臨床開發，用L-NMMA抑制NOS可望有效治療急性偏頭痛的發作。本實驗結果顯示，H2O2損傷SH-SY5Y細胞后，上清液內的IL-8、SP、5-HT、NO含量均顯著增加，而給予鼻腦通提前孵育24 h可使上述幾種因子含量降低，表明鼻腦通能抑制神經細胞氧化損傷后炎癥因子以及致痛物質的釋放。

隨著對偏頭痛神經生物學機制的深入研究，CGRP受體拮抗劑、前列腺類受體拮抗劑、離子通道拮抗劑等肽類受體拮抗劑已成為治療偏頭痛藥物開發的新靶標[24-25]。但偏頭痛患者對于此類藥物的依賴性逐漸凸顯，常導致藥物依賴性頭痛，加重原來的病情，使病情復雜化。而傳統中藥如天麻素、川芎嗪等都對偏頭痛有一定的治療作用，且中藥作用溫和，毒副作用小，將很好地改善上述藥物依賴現象。本實驗為鼻腦通治療偏頭痛的抗炎機制提供依據，也為中藥治療偏頭痛提供了現代藥理學研究基礎，為偏頭痛臨床治療提供更大選擇空間[26]。

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BinaotongInhibitsH2O2-inducedInjuryinSH-SY5YNeuroblastomaCells

HOUHongli1，SUNFangling1，XIANMinghui2，ZHAORunhuai3，XIAOSuping3，AIHouxi1，ZHANGLi1，WANGWen1*

(1.XuanwuHospitalofCapitalMedicalUniversity，Beijing100053，China;2.BeijingQiFuRuiCaoPharm-TechCo.，Ltd.，Beijing100094，China;3.ChinaNationalGroupCorp.ofTraditional&HerbalMedicine，Beijing100195，China)

Objective：To study the effects of binaotong on H2O2-induced oxidative injury in SH-SY5Y neuroblastoma cells.MethodsSH-SY5Y cells were pre-incubated with binaotong(0.04，0.4，4 μg·mL-1) for 24 h prior to exposure to H2O2(1 000 μmol·L-1) for 18 h.The content of vasoactive petide endothelin-1(ET-1)，calcitonin gene-related peptide(CGRP);inflammatory cytokines interleukin-1α(IL-1α)，interleukin-8(IL-8);pain producing substance substance P(SP)，5-hydroxy-tryptamine(5-HT)，nitric oxide(NO) were determined through supernatant.ResultsPretreatment the cells with binaotong(0.04，0.4，4 μg·mL-1)，supernatant of each injury group of vasoactive petide ET-1，CGRP were increased significantly compared with control group(P<0.01，P<0.05);supernatant of injury group of inflammatory cytokine IL-8 was increased significantly compared with control group(P<0.01);supernatant of each injury group of pain producing substance SP，5-HT，NO were increased compared with control group(P<0.01，P<0.01，P<0.05).However，supernatant vasoactive petide ET-1 level was decreased in the binaotong treated group with middle dose and high dose(P<0.05，P<0.001)，and supernatant inflammatory cytokine IL-8 level was also decreased(P<0.05，P<0.01);supernatant pain producing substance SP level was decreased in the binaotong treated group with middle dose and high dose(P<0.05，P<0.05)，supernatant pain producing substance 5-HT，NO level were decreased in the binaotong treated group of high dose(P<0.05，P<0.05).ConclusionDecreased supernatant vasoactive petide ET-1 level and inflammatory cytokine IL-8 level and pain producing substance SP，5-HT，NO levels after H2O2-induced injury in SH-SY5Y neuroblastoma cells were the possible mechanisms of binaotong in treating migraine.

Binaotong;SH-SY5Y neuroblastoma cells;ET-1;CGRP;IL-1α;IL-8;SP;5-HT;NO

10.13313/j.issn.1673-4890.2014.05.007

2013-1

1-05)