磷脂組成對馬錢子總生物堿隱形脂質體體外抗腫瘤作用的影響

彭 佩，林愛華*，陳 軍，王 詠，顧 薇

(1.廣州中醫藥大學第二臨床醫學院，廣東廣州 510120;2.南京中醫藥大學藥學院，江蘇南京 210046)

馬錢子又名番木鱉，始載于《本草綱目·卷十八》，為馬錢科植物馬錢 (Strych nosnux-vomica L.)的干燥成熟種子，馬錢子具有明顯的體外抗腫瘤作用，總生物堿是馬錢子的有效部位，馬錢子總生物堿在體外對腫瘤細胞株均具有抑制作用［1］。

隱形脂質體是利用二硬脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(DSPE-PEG2000)對脂質體進行表面修飾來提高其親水性，其有效的避免了網狀內皮系統巨噬細胞的攝取，使脂質體具有了腫瘤靶向性從而改善藥效［2-3］，陳斯澤等的研究表明，DSPE-PEG2000修飾的抗腫瘤化療藥鹽酸洛拉曲克脂質體與普通脂質體相比顯示了較好的體外長效毒性［4］。而前期研究已經表明，采用復合磷脂組成能明顯的改善馬錢子總生物堿的藥劑學性質［5］，但不同磷脂組成的隱形脂質體的腫瘤細胞攝取特性與抗腫瘤作用還有待于進一步比較研究。

本實驗選取人肝癌SMMC-7721細胞為模型，考察不同磷脂組成的隱形脂質體對肝癌細胞的毒性和攝取影響，初步探討其作用機制，為肝癌靶向脂質體的設計提供實驗依據。

1 儀器與材料

LC-20AT高效液相色譜儀 (RF-10AXL熒光檢測器，紫外檢測器，日本島津);紫外分光光度計(上海菁華科技儀器有限責任公司);流式細胞儀(Becton Dickinson公司，美國);CO2培養箱(thermo scientificforma，美國);酶標儀 (Bio-Rad公司，美國);納米粒徑測定儀Zetasizer(PCS3000型，英國馬爾文公司);JY92-II超聲波細胞粉碎機(寧波新芝生物科技股份有限公司);旋轉蒸發儀(RE252AA型，上海亞榮生化儀器廠);TGL-16G高速離心機 (上海安亭科學儀器廠);BS124S電子天平 (德國賽多利斯公司);HL-2S恒流泵 (上海滬西分析儀器廠有限公司);THZ-82型水浴恒溫振蕩器 (江蘇金壇億通電子有限公司);DF-101SA集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 (南京科爾儀器設備有限公司)。

香豆素-6(美國Sigma-Aldrich，純度≥98.0%);膽固醇 (國藥集團化學試劑有限公司);大豆磷脂 (SPC)、氫化大豆磷脂 (HSPC)、二硬脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(DSPE-PEG2000，純度＞98%)均為德國 Lipoid公司提供;透析袋(USA，MW:8000～14000);SMMC-7721細胞(南京凱基生物科技發展有限公司);RPMI1640、胎牛血清、PBS、胰酶、青霉素和鏈霉素、MTT均為 (Gibco，美國);SephadexG-50(Pharmacia公司，進口分裝);其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 馬錢子總生物堿的提取與成分分析 稱取制馬錢子粉末100 g，15倍量的70%乙醇，回流提取3次，每次0.5 h，濾紙過濾后合并濾液，旋轉蒸發儀真空濃縮濾液，用200 mL的1 mol/L鹽酸超聲溶解，4000 r/min離心10 min，取上清液，然后用40%氫氧化鈉調節pH 12.0，再用二氯甲烷萃取后合并，減壓回收二氯甲烷，即得馬錢子總生物堿提取物，用氯仿溶解馬錢子總生物堿提取物配成1 mg/mL的溶液，稀釋到一定的質量濃度，按2010年版《中國藥典》一部規定的方法［6］采用HPLC測定馬錢子堿和士的寧的量，結果表明，在總生物堿提取物中，士的寧占36.9%，馬錢子堿占23.9%(n=10)。

2.2 馬錢子總生物堿隱形脂質體的制備 采用硫酸銨梯度法制備，按一定比例稱復合磷脂SPC/HSPC=3∶1(摩爾比)、膽固醇、隱形材料DSPEPEG2000(占磷脂總用量的5%摩爾比)，加入一定量的無水乙醇超聲溶解，注入到0.2 mol/L硫酸銨溶液中，60℃磁力攪拌45 min除去乙醇后用探頭超聲勻化，用pH 7.4 PBS(10倍體積，透析4次，每次1h)透析除去外水相硫酸銨，既得空白隱形脂質體。按1∶6藥脂質量比取馬錢子總生物堿與空白復合磷脂隱形脂質體混合，60℃恒溫水浴振蕩20 min載藥，即得。同法制得大豆磷脂、氫化大豆磷脂單一磷脂脂質體。

2.3 粒徑與電位測定 取復合磷脂、大豆磷脂和氫化大豆磷脂脂質體，用pH7.4 PBS稀釋至適宜濃度，用Zetasizer測定儀測定粒徑與電位。復合磷脂馬錢子總生物堿隱形脂質體的平均粒徑明顯小于馬錢子總生物堿大豆磷脂隱形脂質體和馬錢子總生物堿氫化大豆磷脂隱形脂質體平均粒徑，并且3種不同磷脂組成脂質體表面電位均無明顯差異且都為中性。結果見表1。

表1 不同磷脂的馬錢子總生物堿脂質體的粒徑、多分散系數與電位 (n=3)Tab.1 Particle size and polydispersity index or potential of various phospholipids composition total alkaloid liposomes(n=3)

2.4 脂質體的包封率測定［7］

2.4.1 色譜條件 LichrospherC18色譜柱 (4.6 mm×250 mm，5 μm)(江蘇漢邦科技有限公司);流動相為乙腈-0.01mol/L庚烷磺酸鈉與0.02 mol/L磷酸二氫鉀等量混合液 (10%磷酸調pH 2.8)(24∶76);檢測波長254 nm;體積流量為1 mL/min;柱溫30℃;進樣量20μL。

2.4.2 馬錢子堿與士的寧標準曲線的建立 精密吸取馬錢子堿與士的寧貯備液適量，用甲醇配制成1.0、5、10.0、25.0、50.0、100.0 μg/mL 的系列溶液，在“2.4.1”項色譜條件下進樣，以馬錢子堿和士的寧質量濃度對峰面積進行線性回歸，分別得到回歸方程為:Y=17379X－210.75(r=0.9999)Y=17060X+80.478(R=0.9999)。結果表明，馬錢子堿與士的寧在質量濃度為1.0～100.0 μg/mL內與峰面積均具有良好的線性關系。

2.4.3 成分含量測定 分別精密吸取0.5 mL 3種以上不同磷脂組成馬錢子總生物堿隱形脂質體過SepHadexG-50柱 (1 cm×27 cm)，用 pH7.4 PBS洗脫，分離出脂質體部分和未包封的游離藥物，用甲醇稀釋脂質體部分破膜，4000 r/min離心，用“2.4.1”項的方法測定其中馬錢子堿和士的寧的量，用紫外分光光度法測定馬錢子總生物堿的量［8］。計算馬錢子堿和士的寧的包封率。結果見表2。3種不同磷脂組成脂質體中的士的寧成分與馬錢子堿成分的包封率均相差不大，并且與用紫外分光光度法測得的其馬錢子總生物堿包封率相差也不大。

包封率 =脂質體中藥物含量 /(脂質體中藥物含量 +游離藥物的量)×100%

表2 3種磷脂馬錢子總生物堿脂質體的包封率比較 (n=3)Tab.2 Encapsulating efficiency of various phospholipids composition total alkaloid liposomes(n=3)

2.5 不同磷脂組成馬錢子總生物堿隱形脂質體的體外抗腫瘤比較

2.5.1 細胞培養 SMMC-7721培養SMMC-7721細胞用含10%胎牛血清的RPMI1640培養液于37℃，5%CO2培養箱中維持培養。

2.5.2 種板與給藥 取對數期生長的細胞以4×103個/孔與96孔板中，放置24 h后，用紫外分光光度法測定上述3種除去游離藥物的馬錢子總生物堿隱形脂質體與馬錢子總生物堿溶液的藥物含有量，用培養基調整到藥物的質量濃度一致 (120、60、30、15、7.5 μg/mL)，分別加入與上述 3種馬錢子總生物堿隱形脂質體與馬錢子總生物堿溶液100 μL，每個藥物做4個復孔，放置24 h后加入5 mg/mL的MTT，放入培養箱中孵育4 h后加入150 μL的DMSO，振蕩溶解10 min，酶標儀中測定OD值，檢測波長為499 nm。實驗重復3次。結果見圖1，馬錢子總生物堿溶液、復合磷脂隱形脂質體、大豆磷脂隱形脂質體、氫化大豆磷脂隱形脂質體的IC50分別為64.4、17.8、29.6、40.9 μg/mL。3 種脂質體的體外抗肝癌效果都要高于馬錢子總生物堿溶液 (P＜0.05)，復合磷脂隱形脂質體的體外肝癌細胞抑制率明顯的高于大豆磷脂與氫化大豆磷脂隱形脂質體 (P＜0.05)。實驗數據采用t檢驗。

圖1 不同磷脂馬錢子總生物堿隱形脂質體對SMMC-7721的抑制率Fig.1 Antitumor of various phospholipids composition total alkaloid liposomes to SMMC-7721

2.6 SMMC-7721對香豆素-6不同磷脂組成隱形脂質體的攝取量比較

2.6.1 載香豆素-6不同磷脂組成脂質體的制備［9-10］按一定質量比稱取磷脂 (大豆磷脂、氫化大豆磷脂或復合磷脂大豆磷脂-氫化大豆磷脂為3∶1摩爾比)、膽固醇、隱形材料 DSPE-PEG2000(占磷脂總用量的5%摩爾比)和香豆素-6溶于適量氯仿中，55℃旋轉蒸發真空除去CHCl3得均勻薄膜，真空干燥過夜后加入pH 7.4的PBS緩沖液5 mL，37℃恒溫水合1 h后，探頭超聲50次，采用SephadexG-50柱 (1 cm×27 cm)將香豆素-6脂質體的脂質體部分和游離香豆素-6分離，即得。

2.6.2 香豆素-6標準曲線的建立色譜條件［11］Hibar C18色譜柱 (4.6 mm ×150 mm，5 μm);檢測器為RF-10AXL熒光檢測器;流動相為水-甲醇(5∶95);體積流量為0.8 mL/min;進樣量20 μL;激發波長Ex為466 nm，發射波長Em為504 nm。精密吸取香豆素-6貯備液適量，用甲醇稀釋成質量濃度0.50、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0 ng/mL的系列溶液。以香豆素-6質量濃度對峰面積進行線性回歸，得到回歸方程為:Y=121484.18X+20227.069(r=0.9994)。結果表明，香豆素-6在質量濃度在0.50～20.0 ng/mL內與峰面積具有良好的線性關系。

2.6.3 按“2.6.1”項下的方法制備香豆素-6不同磷脂組成脂質體，保證其初始脂質濃度和熒光強度一致，將SMMC-7721以每孔2.5×105個的密度接種于6孔板內，觀察細胞融合度在80%左右且細胞形態飽滿后，移去培養基，加入分離后的3種不同磷脂組成的香豆素-6隱形脂質體，用“2.6.2”項的方法測定其中香豆素-6的含有量，用不含血清培養基調整香豆素-6的含有量 (20 ng/mL)，每孔加入2 mL，放到37℃CO2孵箱中共同孵育1 h后，用冷 PBS沖洗細胞3次，吸出PBS，加入0.4 mL胰酶，消化1 min，加入1 mL的培養基終止消化，吹打下細胞，1000 r/min，離心10 min，去掉上清液后加入PBS吹打均勻，重復3次，最后用PBS調成單細胞懸浮液，用流式細胞儀分析細胞的平均熒光強度和轉染率。實驗重復3次。結果見圖2和圖3，3種脂質體的平均熒光強度和轉染率都有明顯的差異，其中香豆素-6 SPC隱形脂質體和香豆素-6復合磷脂隱形脂質體都與香豆素-6 HSPC隱形脂質體有極顯著差異P＜0.01，香豆素-6 SPC隱形脂質體與香豆素-6復合磷脂隱形脂質體有顯著性差異P＜0.05，說明復合磷脂隱形脂質體與SMMC-7721細胞的作用要明顯的強于前兩者，作為抗腫瘤藥物的載體的選擇能更快的發揮藥效。實驗數據采用t檢驗。

圖2 香豆素-6不同磷脂組成隱形脂質體在SMMC-7721中的熒光強度Fig.2 Fluorescence intensity of various phospholipids composition of coumarin-6 liposome in SMMC-7721

圖3 不同磷脂組成香豆素-6隱形脂質體的轉染率(n=3)Fig.3 Various phospholipids composition of coumarin-6 liposomes uptake rate(n=3)

3 討論

復合磷脂脂質體技術作為新型的脂質體技術，其特征是運用不同相變溫度的磷脂材料作為膜材。研究表明［12］馬錢子總生物堿復合磷脂隱形脂質體對荷瘤小鼠的抑制率明顯高于大豆磷脂脂質體，本實驗對復合磷脂脂質體的體外腫瘤細胞攝取和抗腫瘤效果進行了考察，結果表明復合磷脂脂質體作為中藥抗腫瘤有效部位馬錢子總生物堿的載體能夠顯著增強抗腫瘤效果，腫瘤細胞的攝取增加是其增加抗腫瘤效果的重要機制。

熒光探針香豆素-6為一種脂溶性較好的激光染料，熒光效率與靈敏度都非常高，文獻［13］報道不同脂質材料香豆素-6脂質體在不同的pH條件下的累積滲漏率均不高于0.8%，證明香豆素-6是一種較為理想的熒光探針，因此本實驗選擇香豆素-6作為熒光探針來用于脂質體的細胞內示蹤研究。

脂質體與細胞的作用過程分為吸附、脂交換、內吞、融合4個階段。其中，內吞是脂質體與細胞的主要作用機制，通過釋放藥物而影響細胞生長，本實驗發現不同磷脂脂質體對SMMC-7721的生長抑制率與細胞對其的攝取率趨勢一致，說明不同磷脂的選擇對抗腫瘤的作用影響有著關鍵的作用，而復合磷脂隱形脂質體的效果明顯優于大豆磷脂與氫化大豆磷脂隱形脂質體，這為其作為中藥馬錢子總生物堿抗腫瘤的載體的研究開發提供了實驗依據。

本實驗結果表明，氫化大豆磷脂脂質體的腫瘤細胞攝取率較低，其抗腫瘤效果也低于復合磷脂與大豆磷脂脂質體，氫化大豆磷脂脂質體的相變溫度在53℃［14］，在體溫下非常穩定，因此體內藥動學性質優于大豆磷脂脂質體。氫化大豆磷脂脂質體的攝取率偏低可能是由于氫化大豆磷脂在37℃處于膠晶相，膜的流動性低，不易與腫瘤細胞相互作用所致。

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