清咽利膈丸HPLC指紋圖譜建立及4種主要成分的測定

張 霓，趙秀莉

(鄭州大學附屬腫瘤醫院/河南省腫瘤醫院，河南鄭州 450008)

清咽利膈丸是由射干、黃芩、連翹、梔子、熟大黃、牛蒡子、薄荷、天花粉、玄參、荊芥穗、防風、桔梗、甘草十三味中藥組成的中藥成方制劑，具有清熱利咽、消腫止痛的功效、用于外感時毒、臟腑積熱、咽喉腫痛、胸膈不利、口苦舌干。由于組成復方的藥味較多，化學成分比較復雜，只采用單一或少數幾個指標成分進行質量評價，不能全面反映其內在質量。

目前，指紋圖譜已成為國內外公認的鑒別中藥品種和評價中藥質量的最有效手段［1-8］。中藥指紋圖譜可以很好地表征中藥復方的整體情況，且已廣泛應用于各種中藥復方制劑的質量控制［9-15］。本研究采用HPLC法建立清咽利膈丸的指紋圖譜，確定各共有峰的歸屬，并選取方中4種含有量較高且較穩定的成分牛蒡苷、黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素同時測定，實現從多成分的系統化角度控制清咽利膈丸的質量。

1 儀器與試藥

日本島津LC－10A高效液相色譜儀，DAD檢測器;高速粉碎機 (北京環亞天元機械技術有限公司);AL204電子天平 (梅特勒－托利多儀器有限公司);SB2200超聲儀 (上海必能超聲儀器公司)。

對照品黃芩苷 (110715-200212)、黃芩素(111595-200301)、漢黃芩素 (1514-200001)、牛蒡苷 (0819-9802)、次野鳶尾黃素 (557-200101)、對照藥材連翹 (120908-200613)、大黃 (121249-200402)、甘草 (120904-200511)均購自中國藥品與生物制品檢定所;清咽利膈丸10批 (批號5082001～5082010)均為北京同仁堂科技發展股份有限公司生產;甲醇為色譜純，水為純化水，其他試劑為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 Diamonsil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱;甲醇-0.2%磷酸為流動相線性梯度洗脫 (0→60 min，30%→90%甲醇);體積流量1 mL/min;檢測波長278 nm;柱溫40℃;進樣量10 μL;運行時間 65 min。

2.2 供試品溶液的制備 取本品適量，研細，取約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%乙醇50 mL，稱定質量，超聲處理1 h，放冷，再稱定質量，用50%乙醇補足減失質量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.3 方法學考察

2.3.1 標準曲線及線性關系 精密稱取對照品適量，加甲醇溶解并制成每1 mL含牛蒡苷0.12 mg、黃芩苷0.41 mg、黃芩素0.15 mg和漢黃芩素0.23 mg的混合對照品貯備液。分別精密量取對照品貯備液0.2、0.5、1.0、2.0、3.0、5.0 mL置于 10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻。分別精密吸取上述對照品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，按上述色譜條件測定，記錄峰面積，以質量濃度(mg/mL)為橫坐標X，峰面積為縱坐標 Y，繪制標準曲線。結果見表1。

2.3.2 穩定性試驗 取清咽利膈丸 (批號5082008)0.5 g，精密稱定，按“供試品溶液的制備”項下操作，在“2.1”項色譜條件下，分別在0、2、4、8、12、24 h點測定其指紋圖譜，以黃芩苷峰為內參比峰，計算指紋圖譜中各個峰的相對保留時間及相對峰面積，結果各共有峰的相對保留時間RSD為0.03%～0.41%，相對峰面積RSD為0.49%～2.97%，供試品溶液在24 h內穩定。

表1 牛蒡苷、黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素的線性關系測定Tab.1 Linearity of arctiin，baicalin，baicalein and wogonin

2.3.3 精密度試驗 取清咽利膈丸 (批號5082008)0.5 g，精密稱定，按“供試品溶液的制備”項下操作，在“2.1”項色譜條件下，連續進樣6次，測定其指紋圖譜，以黃芩苷峰為內參比峰，計算指紋圖譜中各個峰的相對保留時間及相對峰面積，結果各共有峰的相對保留時間RSD為0.57%，相對峰面積RSD為0.01% ～0.03%，精密度良好。

2.3.4 重復性試驗 取清咽利膈丸 (批號5082008)6份，每份約0.5 g，精密稱定，按“供試品溶液的制備”項下操作，在“2.1”項色譜條件下，測定其指紋圖譜，以黃芩苷峰為內參比峰，計算指紋圖譜中各個峰的相對保留時間及相對峰面積，結果各共有峰的相對保留時間RSD為0.01%～0.36%，相對峰面積RSD為0.19%～2.92%，重復性良好。

2.4 指紋圖譜的建立和相似度計算 取10批清咽利膈丸，按供試品的制備方法處理、測定，運用國家藥典委員會中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統2004A版軟件，建立清咽利膈丸指紋圖譜的共有模式，獲得了21個共有峰。以峰面積相對較大、較穩定的黃芩苷作為參照峰，計算各共有指紋峰的相對保留時間和峰面積比值。以共有模式為參照，計算樣品與共有模式之間的相似度，結果見表2。10批樣品的色譜疊加圖見圖1。

表2 10批樣品指紋圖譜間的相似度結果Tab.2 Similarity results of ten batches of samples

圖1 10批清咽利膈丸的HPLC指紋圖譜Fig.1 HPLC fingerprints of Qingyan Lige Pills of ten batches

2.5 清咽利膈丸樣品與各原料藥材的相關性及特征峰歸屬 按照供試品溶液制備方法，分別制備處方中各藥材供試品溶液，在清咽利膈丸指紋圖譜條件下分別測定與樣品相應量各藥材的指紋圖譜，將獲得的樣品、藥材和相應藥材的陰性色譜疊加、對比，從而確認樣品指紋圖譜各特征峰的歸屬。結果樣品指紋圖譜中18個特征峰可以找到明確歸屬，它們分別來自黃芩、牛蒡子、甘草、防風、射干、荊芥穗6味藥材。通過對照品試驗，對比其保留時間和紫外光譜，共鑒別了其中6個指紋峰。分別為10號牛蒡苷，11號黃芩苷、17號黃芩素、18號次野鳶尾黃素和20號漢黃芩素。對照品和樣品的HPLC色譜圖見圖2。

圖2 供試品溶液、對照品溶液色譜圖 (278 nm)Fig.2 HPLC chromatograms of Qingyan Lige Pills and reference substances(278 nm)

2.6 清咽利膈丸中4種成分的測定

2.6.1 加樣回收率試驗 取已知含有量的同一批清咽利膈丸樣品 (批號5082008)約0.25 g 6份，精密稱定，分別精密加入牛蒡苷、黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素對照品適量，按“供試品溶液的制備”項下操作，制備供試品溶液，按上述色譜條件，測定，計算回收率，結果見表3。

2.6.2 樣品測定 取清咽利膈丸樣品3批(5082001～5082003)，按照供試品溶液和對照品溶液的制備方法，在清咽利膈丸指紋圖譜條件下同時測定清咽利膈丸中牛蒡苷、黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素的量，結果見表4，色譜圖見圖3。

表4 3批樣品中牛蒡苷、黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素的測定結果Tab.4 Contents of arctiin，baicalin，baicalein and wogonin in three batches of samples

3 討論

3.1 檢測波長的選擇 利用DAD檢測數據，對200～400 nm波段的指紋圖譜進行分析，結合色譜蜂個數和峰強度綜合考察。結果在278 nm下，色譜峰個數和峰強度達到最大，因此選擇278 nm作為檢測波長。

圖3 清咽利膈丸HPLC色譜圖Fig.3 HPLC chromatograms of Qingyan Lige Pills

3.2 流動相的選擇 比較了等度洗脫和梯度洗脫，結果梯度洗脫對樣品的分離效果優于等度洗脫。比較了甲醇-水、甲醇-磷酸、乙腈-水、乙腈-磷酸四種溶劑系統，結果表明采用甲醇-磷酸系統樣品出峰最多且峰形最好，乙腈-磷酸系統雖洗脫能力強，運行時間短，但峰數明顯少于甲醇-磷酸系統。對梯度洗脫條件進行優化，最終確定了甲醇-0.2%磷酸線性梯度洗脫。

3.3 樣品前處理條件的選擇 在試驗中考察了超聲、浸泡和加熱回流的提取方法，結果采用超聲的方法提取較完全。采用超聲提取法，考察了不同體積分數甲醇和乙醇的提取效率，結果表明用50%乙醇作為提取溶劑時，4種成分的量最高且峰形較好。又考察了50%乙醇超聲提取0.5、0.75、1、1.5、2 h后成分含有量差異，結果表明，超聲處理1 h可使樣品提取完全。

3.4 本研究建立了清咽利膈丸的高效液相色譜指紋圖譜，根據10批清咽利膈丸的指紋圖譜建立了共有模式，獲得了21個共有峰。通過與組成藥材和對照品的對比分析，確認了指紋圖譜中18個特征峰在清咽利膈丸組成藥材中的來源。通過相似度分析，10批清咽利膈丸的相似度均大于0.99，表明樣品間質量存在較好的一致性。本研究可為清咽利膈丸類似的復方制劑質量控制研究提供思路。

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