連翹酯苷A對全身內毒素血癥小鼠調節性T細胞的影響

苑 偉，楊 慧，謝 勇，傅穎珺*

(1.南昌大學藥學院，江西南昌 330006;2.江西省醫學科學研究院，江西南昌 330006;3.南昌大學第一附屬醫院消化科，江西南昌 330006)

細菌內毒素又稱脂多糖 (Lipopolysaccharide，LPS)，為革蘭氏陰性菌細胞壁外膜的主要結構成分，是創傷、感染等引起的全身炎癥反應綜合征的重要致病因子［1］。在嚴重感染機體中，機體免疫功能的紊亂是導致感染患者死亡的重要原因［2］。研究發現免疫系統內存在一類CD4+CD25+調節性T淋巴細胞 (Treg)，不僅能抑制自身反應性T細胞，還能參與免疫調節，分為天然的和誘生的，均能夠抑制體外CD4+T細胞的增值和體內免疫應答，與自身免疫活動的異常密切相關［3］。

連翹酯苷A(Forsythoside A)是從連翹中提取的苯乙醇苷類中藥單體，具有抗菌、抗病毒、抗氧化和免疫調節等作用［4］。近年來有學者研究發現，中藥連翹具有很強的摧毀細菌內毒素和免疫調節等作用［5-6］，其開發利用的前景十分廣闊。但目前連翹酯苷A確切的作用機制還不清楚，對Treg的影響也尚未見報道。本實驗通過探討連翹酯苷A對內毒素血癥小鼠外周血Treg和脾臟Foxp3的影響，闡明連翹酯苷A的免疫調節作用及機制，為連翹防治內毒素血癥提供新的思路和靶點。

1 材料與方法

1.1 材料 清潔級雄性BABL/C小鼠，6～8周齡，體質量 (18±2)g，購自南昌大學動科部。連翹酯苷A(20mg，批號L28-110506)購于江西本草天工科技有限公司;LPS(Escherichia coli，026:B6)購自Sigma公司。熒光標記抗體Anti-Mouse CD4 FITC，Anti-Mouse CD25 PE，Anti-Mouse CD3e PE-Cy5均購自美國eBioscience公司;流式細胞儀為美國BD公司產品。抗小鼠CD25單克隆抗體 (PC61)購自Biolegend;兔抗Foxp3單克隆抗體購自英國Abcame公司;β-actin鼠抗單克隆抗體購自中山金橋。總RNA提取試劑盒和逆轉錄試劑盒購于美國Omega公司;SYBR@Premix Ex TaqTMII熒光定量PCR試劑盒購自日本Takara公司;StepOneTM實時熒光定量PCR儀為美國ABI公司產品;PCR引物由上海生工生物技術服務公司合成。紅細胞裂解液購自天根生物技術有限公司;小鼠白細胞介素 (IL)-10、轉化生長因子 (TGF)-β1酶聯免疫吸附測定 (ELISA)檢測試劑盒均購自武漢優爾生科技股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組、造模及標本留取 將BABL/C小鼠隨機分成正常對照組，模型對照組，抗體對照組，連翹酯苷A高、中、低3個劑量組，每組8只。正常組、模型組、抗體組腹腔注射 (Intraperitoneal injection，ip)生理鹽水0.5 mL/d，連續7 d;其中抗體組第2天腹腔注射Anti-CD251.2 mg/kg來耗竭Treg;3個藥物組分別腹腔注射連翹酯苷A 80 mg/kg、20 mg/kg、5 mg/kg，連續7 d;第8天正常對照組腹腔注射生理鹽水0.5 mL，其他組均腹腔注射LPS 10 mg/kg。4 h后無菌取血，并取脾組織置液氮冷凍后-80℃保存。用流式細胞術測外周血Treg比例變化;實時PCR和Western blot法測定脾臟組織Foxp3表達。

1.2.2 一般情況觀察 觀察腹腔注射LPS后小鼠飲食飲水、排便、行為活動等，記錄小鼠死亡情況。

1.2.3 流式細胞儀檢測Treg 流式上樣管中加入肝素鈉抗凝血100μL，加入 FITC-anti-CD4，PE-anti-CD25，PE-Cy5-anti-CD3e各5 μL，并設立同型對照管。充分震蕩混勻，室溫避光孵育15 min，加入1 mL紅細胞裂解液，混勻，室溫避光孵育10 min，然后1000 r/min離心5 min，棄去上清液。加2 mL PBS洗1次，最后加500 μL PBS重懸，應用 BD公司FACS Calibur流式細胞分析儀上機檢測。用BD FACS Diva軟件分析數據，并減去非特異性對照，以FSC/SSC和SSC/CD3+設門，檢測門內10000個細胞中CD4+CD25+雙陽性細胞與FITC標記的CD4+細胞的比率，即為Treg百分率。

1.2.4 Real-time PCR檢測Foxp3 mRNA 取50～100 mg脾組織提取總RNA，以紫外分光光度計測定吸光度值，-80℃保存。逆轉錄并進行real time PCR，引物序列如下:Foxp3正向:5-CTCATGATAGTGCCTGTGTCCTCAA-3，反向:5-AGGGCCAGCATAGGTGCAAG-3，擴增片段93 bp;以 β-actin為內參，正向:5-CATCCGTAAAGACCTCTATGCCAAC-3，反 向:5-ATGGAGCCACCGATCCACA-3，擴增片段171 bp。反應體系20 μL，每個樣本均重復3個復孔，采用兩步法PCR擴增標準程序:預變性95℃ 30 s，變性95℃ 5 s共40個循環，退火60℃34 s。所有擴增產物用融解曲線和瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物單一性。數據由熒光定量PCR儀收集并計算CT值。CT(Threshold Cycle)值的含義:每個反應管內熒光強度達到系統能夠辨認的目的DNA合成時的循環數，cDNA含量越低，所對應的CT值越高。采用2-ΔΔCT相對定量的方法表示Foxp3 mRNA的相對表達水平。公式如下:

ΔΔCT= (CTFoxp3-CTβ-actin) 實 驗 組 -(CTFoxp3-CTβ-actin)正常組 (平均值)

mRNA 相對表達量 =2-ΔΔCT×100%。

1.2.5 脾臟Foxp3蛋白表達的測定 組織稱定質量，放入含有蛋白酶抑制劑的裂解緩沖液中冰浴裂解，-20℃保存。采用BCA法測蛋白濃度，通過Western印跡法進行分析。取各待測樣品以4X上樣緩沖液煮沸5 min，經12%聚丙烯酰胺凝膠電泳，采用半干電轉移法，將蛋白轉移至NC膜上。5%脫脂牛仔封閉1.5 h后，經一抗 (鼠源抗β-actin 1∶2000;兔源抗Foxp31∶1000)孵育4℃過夜，辣根過氧化物酶標記的二抗 (山羊抗小鼠1∶5000，山羊抗兔1∶10000)孵育4 h及ECL顯色。Bio-Rad軟件分析圖像，讀取A值，Foxp3蛋白的相對表達量=AFoxp3/Aβ-actin。

1.2.6 ELISA法檢測血清IL-10、TGF-β1 小鼠摘眼球取血，室溫凝固4 h，3500 r/min離心15 min，收集上清，待測。以雙抗體夾心法檢測血清IL-10、TGF-β1水平，具體步驟參照試劑盒說明書。

1.2.7 統計學分析 所有數據采用SPASS 16.0統計軟件進行方差分析處理。結果以表示，單因素方差分析進行顯著性檢驗，多組間比較采用LSD檢驗，以P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 各組小鼠一般表現情況 正常對照組小鼠飲食活動正常，反應機敏，生理狀態未見明顯改變。模型組小鼠造模后與正常組相比，精神不振，皮毛豎立無光澤，畏寒顫抖且卷縮抱團;自主活動減少嗜睡，抓取時反應遲鈍。抗體和藥物干預組小鼠無明顯異常變化。整體無死亡現象。

2.2 各組小鼠外周血CD4+CD25+/CD4+T比例變化 通過流式細胞術檢測發現，與正常對照組相比，模型組小鼠外周血CD4+CD25+/CD4+T比例顯著上升 (P＜0.01);與模型組相比，連翹酯苷A高劑量組能夠達到與抗體組相似的療效，即明顯降低小鼠外周血CD4+CD25+/CD4+T比例 (P＜0.01)，且雙陽性細胞比例隨連翹酯苷A劑量增加而相應降低，呈明顯的劑量-效應關系 (P＜0.05)(見表1)。

表1 各組小鼠外周血CD4+CD25+/CD4+T比例的變化(%，)Tab.1 Changes of perpheral blood CD4+CD25+/CD4+T ratio in each group of mice(%，)

表1 各組小鼠外周血CD4+CD25+/CD4+T比例的變化(%，)Tab.1 Changes of perpheral blood CD4+CD25+/CD4+T ratio in each group of mice(%，)

注:與正常對照組比較，＊＊P＜0.01;與內毒素模型組比較，##P ＜0.01，#P ＜0.05

組別 動物數/只 CD4+CD25+/CD4+T正常對照組89.8±0.72內毒素模型組 8 37.9 ±2.10＊＊抗體組 8 11.9±0.80##連翹酯苷A高劑量組 8 12.6±1.04##連翹酯苷A中劑量組 8 21.1±1.13#連翹酯苷A低劑量組 8 30.9±1.22#

圖1 流式細胞術檢測小鼠外周血CD4+CD25+/CD4+T細胞比例Fig.1 Peripheral blood CD4+CD25+/CD4+T cell ratios in mice measured by flow cytometry

流式結果圖 (圖1)中，Q4象限表示CD4+T細胞，Q2象限表示CD4+CD25+雙陽性細胞。由圖可見，內毒素模型組Q2象限的雙陽性細胞比例與Q4象限的總CD4+T細胞相差不大，而正常對照組和連翹酯苷A高劑量組的Q2細胞比例明顯少于Q4。

2.3 各組小鼠脾組織Foxp3 mRNA和蛋白的表達 Foxp3 mRNA在正常小鼠脾組織內均有一定程度的表達，與正常對照組比較，模型組小鼠Foxp3 mRNA表達上調非常顯著，差異有統計學意義(P＜0.01);用抗體以及連翹酯苷A干預后Foxp3 mRNA表達明顯下降且呈劑量依賴關系，與模型組比較，差異有統計學意義 (P＜0.01，P＜0.05);各組Foxp3蛋白的表達變化與Foxp3 mRNA相似。見表2，圖2。

表2 各組小鼠脾組織中Foxp3 mRNA及蛋白表達的變化(IOD值，)Tab.2 Changes of Foxp3 mRNA and protein expression on spleen tissue in each group of mice(%，)

表2 各組小鼠脾組織中Foxp3 mRNA及蛋白表達的變化(IOD值，)Tab.2 Changes of Foxp3 mRNA and protein expression on spleen tissue in each group of mice(%，)

注:與正常對照組比較，＊＊P＜0.01;與內毒素模型組比較，##P ＜0.01，#P ＜0.05

Foxp3 mRNA正常對照組組別 動物數/只 Foxp3蛋白8 0.27±0.03 0.24±0.03內毒素模型組 8 0.83 ±0.04＊＊ 0.93 ±0.05＊＊抗體組 8 0.25±0.03##0.31±0.03##連翹酯苷A高劑量組 8 0.22±0.03##0.29±0.02##連翹酯苷A中劑量組 8 0.50±0.05# 0.44±0.03#連翹酯苷A低劑量組 8 0.63±0.04# 0.73±0.03#

圖2 Western blot檢測LPS對小鼠脾組織Foxp3蛋白表達的影響Fig.2 Effect of Foxp3 protein expression from LPS on spleen tissue in mice by Western blot

2.4 各組小鼠血清IL-10和TGF-β1的變化 內毒素模型組小鼠血清IL-10水平顯著高于正常對照組(P＜0.01);抗體以及藥物干預后，能有效降低小鼠血清IL-10分泌，且隨藥物劑量降低作用減弱(P＜0.01，P＜0.05)。TGF-β1變化水平不如 IL-10明顯，與正常對照組相比，模型組表達升高 (P＜0.01);抗體和高、中劑量藥物干預后均能降低該變化 (P＜0.05);但藥物低劑量組與模型組相比，差異不顯著 (P＞0.05)無統計學意義。見表3。

表3 各組小鼠外周血血清中IL-10及TGF-β1的水平變化(pg/mL，)Tab.3 Changes of IL-10 and TGF-β1 levels in peripheral blood serum of each group of mice(pg/mL，)

表3 各組小鼠外周血血清中IL-10及TGF-β1的水平變化(pg/mL，)Tab.3 Changes of IL-10 and TGF-β1 levels in peripheral blood serum of each group of mice(pg/mL，)

注:與正常對照組比較，＊＊P＜0.01;與內毒素模型組比較，##P＜0.01，#P ＜0.05

組別 動物數/只IL-10/(pg·mL-1)TGF-β1/(pg·mL-1)1471.65±158.698 45.91±5.37 805.44±95.52內毒素模型組 8 142.22 ±16.39＊＊ 1530.81 ±184.83＊＊抗體組 8 59.50±5.29## 872.39±90.53#連翹酯苷A高劑量組 8 51.68±7.63## 942.20±77.27#連翹酯苷A中劑量組 8 75.84±5.04# 1304.78±71.30#連翹酯苷A低劑量組 8 104.45±6.83#正常對照組

3 討論

中藥由于資源廣闊，藥性溫和，毒副作用小且較少出現耐藥性，而越來越受到關注。近年來研究發現，中藥某些有效成分對內毒素血癥導致的免疫調節異常作用顯著。內毒素血癥是由于血液受到細菌或外源內毒素污染而引起的病理生理表現，屬于全身性感染的一種癥狀。在內毒素致病過程中，產生的各種生物學效應引起機體免疫調節異常，以及產生一系列炎癥介質和細胞因子等均參與疾病的發生［2］。Treg是一種表型與功能特異的T淋巴細胞亞群，在機體免疫平衡中起重要作用。Caramalho等［7］報道，LPS能與暴露于Treg上的TLR4受體結合，提高Treg的生存與增殖能力，并10倍增強Treg的免疫抑制功能。因此，本研究從Treg的免疫學角度，通過建立小鼠內毒素血癥模型，觀察小鼠外周血Treg和脾臟Foxp3的變化等來探討受試藥物連翹酯苷A對Treg的影響。

Treg能有效預防和消除病原體感染，抑制過強的免疫應答來維持機體免疫平衡，與自身免疫性疾病、移植耐受以及腫瘤免疫等方面密切相關［8］。Treg在自然狀態下表現免疫無能性，對IL-2等特異性抗原的刺激呈無反應狀態;Treg活化后，其免疫抑制性是抗原非特異的，能夠通過直接接觸或分泌抑制性細胞因子如IL-10和TGF-β1等來抑制效應性CD4+、CD8+T細胞的生物活性［9］。本研究中通過流式細胞術檢測發現，內毒素模型組小鼠的外周血Treg比例明顯升高 (P＜0.01)，提示小鼠感染內毒素后，機體的免疫功能明顯受抑，可能是由于LPS引起Treg過度活化，從而抑制了CD4+、CD8+T細胞的增殖。而用連翹酯苷A干預后，小鼠外周血Treg比例明顯下降，且隨藥物劑量的增加而程度更加明顯，呈劑量-效應關系 (P＜0.05)，其中高劑量藥物組與正常對照組比較差異無統計學意義 (P＞0.05)，說明連翹酯苷A可以通過抑制Treg活化來糾正內毒素所致的機體免疫受抑狀態。

細胞因子IL-10、TGF-β1是免疫細胞功能上相互聯絡的重要因素之一，IL-10具有多功能性，能阻止抗原遞呈細胞功能或下調共刺激分子表達，以及作用于T淋巴細胞，誘導其無能，使機體細胞免疫減弱。轉化生長因子TGF-β1可作為免疫應答調節器，能夠增強或抑制效應T細胞增生，調節T細胞反應，并能促進外周CD4+CD25-T細胞轉化為調節性細胞，來維持免疫平衡［10］。本研究中發現高劑量連翹酯苷A能使Treg分泌的細胞因子IL-10、TGF-β1明顯減少，因此連翹酯苷A減少Treg分泌抑制性細胞因子，可能是通過以上兩種機制來增強機體的免疫功能。

叉頭狀螺旋轉錄因子Foxp3是賦予Treg細胞免疫抑制功能的主要分子，介導Treg的發育與表達，是其最特異的標記分子［11］。Foxp3基因異常會導致Treg細胞數量及功能的變化，并影響其調控機制，最終導致免疫功能紊亂，因此Foxp3對機體免疫自穩起著決定性作用。在正常人和小鼠的外周血及脾臟組織的CD4+T細胞中約有5%～10%的細胞持續表達CD25+分子，并在CD4+CD25+分子中高表達轉錄因子 Foxp3［12-13］。本研究結果顯示，經過LPS刺激的模型組小鼠Foxp3的表達升高十分顯著 (P＜0.01)，連翹酯苷A干預后能明顯降低患病小鼠脾臟Foxp3的表達，提示連翹酯苷A可以通過抑制Foxp3的升高而減弱Treg的功能。

綜上所述，內毒素可以引起全身性炎癥反應，使機體免疫功能異常，表現為患病小鼠外周血Treg比例、Treg特異性標志分子Foxp3的表達、以及抑炎因子IL-10、TGF-β1的分泌均升高。而本研究發現連翹酯苷A作用后可有效緩解LPS所致的機體免疫功能紊亂，通過減少Treg數、IL-10和TGF-β1的分泌，以及降低Foxp3的表達水平，抑制了Treg的功能，增強機體免疫能力。本研究闡述了連翹酯苷A對全身內毒素血癥小鼠的免疫調節作用，進一步發揮了中藥抗感染的特色與優勢，以期為內毒素血癥的治療提供幫助。

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