以抑菌活性為指標(biāo)優(yōu)化清喉口含片浸膏的提取工藝

常 翠，楊宏圖，趙 奎，鄭杭生，陳思思

(1.深圳市人民醫(yī)院暨南大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院藥學(xué)部，廣東深圳 518020;2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，浙江杭州 310053)

急性咽炎多由細(xì)菌、病毒感染所致，細(xì)菌感染多由溶血性鏈球菌引起，其次為流感嗜血桿菌、肺炎球菌、葡萄球菌等［1］。其臨床表現(xiàn)為突然發(fā)作的咽痛、扁桃體發(fā)黃、滲血及頸部腫大等，嚴(yán)重時(shí)有發(fā)熱、頭痛、全身不適等癥狀［2］。運(yùn)用中醫(yī)藥治療該病，具有療效好，副作用小且劑型多樣，適應(yīng)臨床需要的特點(diǎn)［3-4］。中醫(yī)藥治療急性咽炎的劑型主要包括口含片、湯劑、顆粒劑、丸劑、合劑等［5］。清喉口含片［6-7］由崗梅根、板藍(lán)根、甘草等中藥組成，是在臨床應(yīng)用多年的醫(yī)院制劑。清喉口含片具有涼血利咽，清熱解毒，消炎消腫作用，臨床主要用于咽喉腫痛、風(fēng)熱癥急性咽炎，經(jīng)多年應(yīng)用，療效確切，未見明顯不良反應(yīng)。口含片可以局部發(fā)揮作用，提高局部療效。以藥效為評價(jià)指標(biāo)優(yōu)化中藥材提取工藝已在實(shí)踐中逐步推廣［8-12］，該方法使中藥提取產(chǎn)物突出其某方面療效，能反映中藥中多成分的綜合作用，為中藥提取工藝的優(yōu)化提供了一種新的思路。本實(shí)驗(yàn)按中醫(yī)藥理論和臨床對治療作用的要求，以瓊脂擴(kuò)散法測得乙型溶血性鏈球菌的抑菌圈直徑為評價(jià)指標(biāo)，采用均勻設(shè)計(jì)法優(yōu)化清喉口含片浸膏的水提醇沉工藝，并以最低抑菌質(zhì)量濃度 (MIC)、最低殺菌質(zhì)量濃度 (MBC)評價(jià)清喉口含片浸膏的抑菌作用。

1 藥品與儀器

藥材均購于深圳市藥材公司，經(jīng)本院中藥庫鑒定為正品。BZY150K型自動(dòng)煎藥機(jī) (天津三延精密機(jī)械有限公司);比重計(jì) (沈陽玻璃計(jì)器廠);抗生素藥敏紙片 (中國藥品生物制品檢定所);微量加樣器 (上海求精生化儀器有限公司)。

綠膿桿菌 ATCCT 27853、金黃色葡萄球菌 ATCCT 25923(中國食品藥品檢定研究院)，乙型溶血性鏈球菌、甲型溶血性鏈球菌、肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌、大腸桿菌 (深圳市人民醫(yī)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)部臨床收集、鑒定并提供)。水解酪蛋白肉湯 (MHB)(批號20120310，規(guī)格250 g，杭州天和微生物試劑有限公司提供，臨用時(shí)配制，121℃、15 min滅菌)。流感嗜血桿菌實(shí)驗(yàn)時(shí)加X、V因子，鏈球菌實(shí)驗(yàn)時(shí)加5%溶解的羊血。營養(yǎng)肉湯 (批號120213，中國食品藥品檢定研究院提供，按說明書配制)。

2 方法與結(jié)果

2.1 擬定提取工藝 根據(jù)前期研究結(jié)果［6］與片劑服用量限制的要求，暫擬定如下水提醇沉的工藝路線及部分參數(shù):按清喉口含片的處方組成比例，崗梅根-板藍(lán)根-蒲公英-甘草 (5∶5∶5∶1)，共取1920 g生藥，每次加6倍量水，按規(guī)定的提取時(shí)間、提取次數(shù)煎煮提取后，濾過，合并濾液，濾液濃縮至與生藥量之比為1∶1(mL∶g)，加乙醇使達(dá)到一定的含醇量，于25℃下靜置24 h，濾過，濾液濃縮至相對密度為1.2，即得浸膏，該浸膏用作清喉口含片的主藥及用于藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)。

2.2 抑菌圈直徑的測定［13-14］采用瓊脂擴(kuò)散法測定抑菌圈直徑。取濃度為1.5×108CFU/mL的標(biāo)準(zhǔn)菌 (乙型溶血性鏈球菌)，均勻涂布于培養(yǎng)基上，打孔，取50 μL質(zhì)量濃度為50 mg/mL的浸膏，加入孔中。以等體積滅菌注射用水作為對照。再將培養(yǎng)皿置于35℃恒溫箱中，培養(yǎng)24 h后，用卡尺測量抑菌圈的直徑。

2.3 提取工藝條件的優(yōu)化

2.3.1 試驗(yàn)方法 根據(jù)前期試驗(yàn)結(jié)果［6］，選取提取時(shí)間、提取次數(shù)及醇沉體積分?jǐn)?shù)3個(gè)影響因素，通過均勻設(shè)計(jì)法優(yōu)選最佳提取工藝條件。均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)選用U7(76)表，根據(jù)其使用表規(guī)則，選取第1、2、3列構(gòu)成U7(73)表。以擬水平法安排提取次數(shù)的水平，因?yàn)橹兴幪崛∫话悴怀^3次，故將原表中的1、2水平歸為1次，3、4水平歸為2次，5、6、7水平歸為3次。同時(shí)，為了避免兩個(gè)高檔次水平相遇，對提取時(shí)間的水平進(jìn)行了調(diào)整。因素及其水平安排詳見表1。分別按照“2.1”項(xiàng)下的擬定提取工藝方法完成表1中的各號試驗(yàn)，制得浸膏，再分別按“2.2”項(xiàng)下的方法測量乙型溶血性鏈球菌的抑菌圈直徑，作為浸膏抑菌活性的評價(jià)指標(biāo)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果列于表1。

表1 均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)因素及其水平與結(jié)果

2.3.2 結(jié)果分析 用沈陽藥科大學(xué)開發(fā)的均勻設(shè)計(jì)回歸分析及優(yōu)化系統(tǒng) (UROS)處理試驗(yàn)數(shù)據(jù)，引入或剔除自變量的F臨界值設(shè)定為0.1，可得如下回歸方程:

復(fù)相關(guān)系數(shù)R=0.9993，Q=0.6549，F(xiàn)=338.2297，查F檢驗(yàn)臨界值表得=99.2，故 F ＞，F(xiàn) 檢驗(yàn)通過，說明回歸方程具有顯著意義，置信度達(dá)99%以上。通過回歸方程可以看出提取次數(shù)對抑菌圈直徑的影響為非線性，且與提取時(shí)間和醇沉體積分?jǐn)?shù)均存在交互作用。按抑菌圈直徑最大得到優(yōu)選條件:每次煎煮60.1 min，提取3次，醇沉體積分?jǐn)?shù)40.2%，預(yù)測抑菌圈直徑為40.6 mm，區(qū)間估計(jì)為 (38.891 mm，42.294 mm)，優(yōu)于以上所有實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

2.3.3 結(jié)果驗(yàn)證 按照處方組成比例，共取1920 g生藥，按照“2.1”項(xiàng)下的提取工藝方法，結(jié)合優(yōu)化得到的最佳條件進(jìn)行提取試驗(yàn)，重復(fù)3次，所得浸膏取一部分水浴蒸干，105℃干燥3 h，計(jì)算出膏率為 (8.65±0.29)%。剩余浸膏分別按“2.2”項(xiàng)下測定抑菌圈直徑，測得結(jié)果為(40.5±0.7)mm，與預(yù)測結(jié)果一致，故優(yōu)化結(jié)果可信。

2.4 體外抑菌試驗(yàn)［7］

2.4.1 MIC測定 以標(biāo)準(zhǔn)試管二倍稀釋法測定MIC，將清喉口含片浸膏 (相當(dāng)于1 g生藥/mL)用營養(yǎng)肉湯按二倍稀釋法配制成系列濃度稀釋液。將各試驗(yàn)液分別置于玻璃試管中 (1.0 mL/管)，每一支管加入1.0 mL新鮮菌液(1.5×106CFU/mL)，混勻，均行雙管法試驗(yàn)，在生化培養(yǎng)箱中于 (35±1)℃培養(yǎng)24 h，觀察細(xì)菌生長情況。上層液渾濁 (或有溶血者)為有菌生長，上層液澄清 (或血球沉降、無溶血者)為無菌生長，肉眼看不到細(xì)菌生長對應(yīng)的藥液最低質(zhì)量濃度為MIC。同時(shí)做空白樣品對照、空白對照、空白菌株對照。

2.4.2 MBC測定 采用肉湯對倍稀釋平板活菌計(jì)數(shù)法，即用測定MIC的無細(xì)菌生長的培養(yǎng)基，將各管培養(yǎng)基用0.01 mL定量接種環(huán)接種于相應(yīng)的培養(yǎng)基平皿上，在生化培養(yǎng)箱中于 (35±1)℃培養(yǎng)24 h，此后觀察細(xì)菌生長情況，培養(yǎng)基平皿上無細(xì)菌生長的平板對應(yīng)的藥液最低質(zhì)量濃度為MBC。

2.4.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 實(shí)驗(yàn)用各菌株生長良好，各空白管、空白樣品對照管均未見細(xì)菌生長。清喉口含片、雙黃連口服液 (陽性對照藥)對大多與急性咽喉炎有關(guān)的細(xì)菌均有比較顯著的抑制和殺滅作用，特別是對乙型溶血性鏈球菌、金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌、甲型溶血性鏈球菌和流感嗜血桿菌，其MIC為0.0312～0.125 g(生藥)/mL，MBC為0.125～0.5 g(生藥)/mL，結(jié)果詳見表2。

表2 清喉口含片體外抑菌試驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)論與討論

本實(shí)驗(yàn)以抑菌活性為指標(biāo)所得優(yōu)化工藝與本課題組前期以出膏率、損失率為指標(biāo)的優(yōu)化工藝［6］對比，提取次數(shù)、時(shí)間基本一致，醇沉后的出膏率在合理范圍內(nèi)，但是醇沉體積分?jǐn)?shù)降低近20%，故工藝更具經(jīng)濟(jì)性;且以抑菌活性為指標(biāo)，所得的優(yōu)化結(jié)果更合理、更有針對性。清喉口含片浸膏的體外抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示其抑菌率也有顯著提高，與前期本課題組其他提取工藝所得浸膏的抑菌試驗(yàn)結(jié)果［7］對比，對于陽性菌，MIC、MBC一般提高一倍，對于陰性菌大多數(shù)都提高了3倍;與陽性對照藥雙黃連口服液相比，清喉口含片對于金黃色葡萄球菌、乙型溶血性鏈球菌、肺炎鏈球菌、大腸桿菌、綠膿桿菌的MIC和MBC值均比雙黃連口服液低，說明有較優(yōu)的抑菌、殺菌作用，且提示本品可能在治療陰性菌引起的牙痛方面有應(yīng)用價(jià)值，可以進(jìn)行進(jìn)一步的研究。

從均勻設(shè)計(jì)回歸方程的各項(xiàng)對比可見，B、C項(xiàng)的系數(shù)占比重較大，說明提取次數(shù)與醇沉濃度具有較大交互作用。

本制劑采用水提醇沉工藝能保留有效成分，又可除去雜質(zhì)。本實(shí)驗(yàn)采用均勻設(shè)計(jì)并對因素、水平進(jìn)行調(diào)整盡量避免各因素在高水平重合，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)回歸處理，得回歸方程，結(jié)合實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)選擇優(yōu)化條件，結(jié)果確切，建議在中藥提取研究中推廣使用。

本實(shí)驗(yàn)優(yōu)化工藝所得浸膏將作為清喉口含片的主藥與蔗糖粉 (50%)、甘露醇 (20%)、乳糖 (30%)等輔料混合，再加上冰片、薄荷制成口含片。清喉口含片在咽喉局部的停留時(shí)間較長，局部濃度高，可以達(dá)到局部給藥、提高療效的作用。

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