以抑菌活性為指標優化清喉口含片浸膏的提取工藝

常 翠，楊宏圖，趙 奎，鄭杭生，陳思思

(1.深圳市人民醫院暨南大學第二臨床醫學院藥學部，廣東深圳 518020;2.浙江中醫藥大學藥學院，浙江杭州 310053)

急性咽炎多由細菌、病毒感染所致，細菌感染多由溶血性鏈球菌引起，其次為流感嗜血桿菌、肺炎球菌、葡萄球菌等［1］。其臨床表現為突然發作的咽痛、扁桃體發黃、滲血及頸部腫大等，嚴重時有發熱、頭痛、全身不適等癥狀［2］。運用中醫藥治療該病，具有療效好，副作用小且劑型多樣，適應臨床需要的特點［3-4］。中醫藥治療急性咽炎的劑型主要包括口含片、湯劑、顆粒劑、丸劑、合劑等［5］。清喉口含片［6-7］由崗梅根、板藍根、甘草等中藥組成，是在臨床應用多年的醫院制劑。清喉口含片具有涼血利咽，清熱解毒，消炎消腫作用，臨床主要用于咽喉腫痛、風熱癥急性咽炎，經多年應用，療效確切，未見明顯不良反應。口含片可以局部發揮作用，提高局部療效。以藥效為評價指標優化中藥材提取工藝已在實踐中逐步推廣［8-12］，該方法使中藥提取產物突出其某方面療效，能反映中藥中多成分的綜合作用，為中藥提取工藝的優化提供了一種新的思路。本實驗按中醫藥理論和臨床對治療作用的要求，以瓊脂擴散法測得乙型溶血性鏈球菌的抑菌圈直徑為評價指標，采用均勻設計法優化清喉口含片浸膏的水提醇沉工藝，并以最低抑菌質量濃度 (MIC)、最低殺菌質量濃度 (MBC)評價清喉口含片浸膏的抑菌作用。

1 藥品與儀器

藥材均購于深圳市藥材公司，經本院中藥庫鑒定為正品。BZY150K型自動煎藥機 (天津三延精密機械有限公司);比重計 (沈陽玻璃計器廠);抗生素藥敏紙片 (中國藥品生物制品檢定所);微量加樣器 (上海求精生化儀器有限公司)。

綠膿桿菌 ATCCT 27853、金黃色葡萄球菌 ATCCT 25923(中國食品藥品檢定研究院)，乙型溶血性鏈球菌、甲型溶血性鏈球菌、肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌、大腸桿菌 (深圳市人民醫院檢驗醫學部臨床收集、鑒定并提供)。水解酪蛋白肉湯 (MHB)(批號20120310，規格250 g，杭州天和微生物試劑有限公司提供，臨用時配制，121℃、15 min滅菌)。流感嗜血桿菌實驗時加X、V因子，鏈球菌實驗時加5%溶解的羊血。營養肉湯 (批號120213，中國食品藥品檢定研究院提供，按說明書配制)。

2 方法與結果

2.1 擬定提取工藝 根據前期研究結果［6］與片劑服用量限制的要求，暫擬定如下水提醇沉的工藝路線及部分參數:按清喉口含片的處方組成比例，崗梅根-板藍根-蒲公英-甘草 (5∶5∶5∶1)，共取1920 g生藥，每次加6倍量水，按規定的提取時間、提取次數煎煮提取后，濾過，合并濾液，濾液濃縮至與生藥量之比為1∶1(mL∶g)，加乙醇使達到一定的含醇量，于25℃下靜置24 h，濾過，濾液濃縮至相對密度為1.2，即得浸膏，該浸膏用作清喉口含片的主藥及用于藥效學實驗。

2.2 抑菌圈直徑的測定［13-14］采用瓊脂擴散法測定抑菌圈直徑。取濃度為1.5×108CFU/mL的標準菌 (乙型溶血性鏈球菌)，均勻涂布于培養基上，打孔，取50 μL質量濃度為50 mg/mL的浸膏，加入孔中。以等體積滅菌注射用水作為對照。再將培養皿置于35℃恒溫箱中，培養24 h后，用卡尺測量抑菌圈的直徑。

2.3 提取工藝條件的優化

2.3.1 試驗方法 根據前期試驗結果［6］，選取提取時間、提取次數及醇沉體積分數3個影響因素，通過均勻設計法優選最佳提取工藝條件。均勻設計試驗選用U7(76)表，根據其使用表規則，選取第1、2、3列構成U7(73)表。以擬水平法安排提取次數的水平，因為中藥提取一般不超過3次，故將原表中的1、2水平歸為1次，3、4水平歸為2次，5、6、7水平歸為3次。同時，為了避免兩個高檔次水平相遇，對提取時間的水平進行了調整。因素及其水平安排詳見表1。分別按照“2.1”項下的擬定提取工藝方法完成表1中的各號試驗，制得浸膏，再分別按“2.2”項下的方法測量乙型溶血性鏈球菌的抑菌圈直徑，作為浸膏抑菌活性的評價指標，實驗結果列于表1。

表1 均勻設計試驗因素及其水平與結果

2.3.2 結果分析 用沈陽藥科大學開發的均勻設計回歸分析及優化系統 (UROS)處理試驗數據，引入或剔除自變量的F臨界值設定為0.1，可得如下回歸方程:

復相關系數R=0.9993，Q=0.6549，F=338.2297，查F檢驗臨界值表得=99.2，故 F ＞，F 檢驗通過，說明回歸方程具有顯著意義，置信度達99%以上。通過回歸方程可以看出提取次數對抑菌圈直徑的影響為非線性，且與提取時間和醇沉體積分數均存在交互作用。按抑菌圈直徑最大得到優選條件:每次煎煮60.1 min，提取3次，醇沉體積分數40.2%，預測抑菌圈直徑為40.6 mm，區間估計為 (38.891 mm，42.294 mm)，優于以上所有實驗結果。

2.3.3 結果驗證 按照處方組成比例，共取1920 g生藥，按照“2.1”項下的提取工藝方法，結合優化得到的最佳條件進行提取試驗，重復3次，所得浸膏取一部分水浴蒸干，105℃干燥3 h，計算出膏率為 (8.65±0.29)%。剩余浸膏分別按“2.2”項下測定抑菌圈直徑，測得結果為(40.5±0.7)mm，與預測結果一致，故優化結果可信。

2.4 體外抑菌試驗［7］

2.4.1 MIC測定 以標準試管二倍稀釋法測定MIC，將清喉口含片浸膏 (相當于1 g生藥/mL)用營養肉湯按二倍稀釋法配制成系列濃度稀釋液。將各試驗液分別置于玻璃試管中 (1.0 mL/管)，每一支管加入1.0 mL新鮮菌液(1.5×106CFU/mL)，混勻，均行雙管法試驗，在生化培養箱中于 (35±1)℃培養24 h，觀察細菌生長情況。上層液渾濁 (或有溶血者)為有菌生長，上層液澄清 (或血球沉降、無溶血者)為無菌生長，肉眼看不到細菌生長對應的藥液最低質量濃度為MIC。同時做空白樣品對照、空白對照、空白菌株對照。

2.4.2 MBC測定 采用肉湯對倍稀釋平板活菌計數法，即用測定MIC的無細菌生長的培養基，將各管培養基用0.01 mL定量接種環接種于相應的培養基平皿上，在生化培養箱中于 (35±1)℃培養24 h，此后觀察細菌生長情況，培養基平皿上無細菌生長的平板對應的藥液最低質量濃度為MBC。

2.4.3 實驗結果 實驗用各菌株生長良好，各空白管、空白樣品對照管均未見細菌生長。清喉口含片、雙黃連口服液 (陽性對照藥)對大多與急性咽喉炎有關的細菌均有比較顯著的抑制和殺滅作用，特別是對乙型溶血性鏈球菌、金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌、甲型溶血性鏈球菌和流感嗜血桿菌，其MIC為0.0312～0.125 g(生藥)/mL，MBC為0.125～0.5 g(生藥)/mL，結果詳見表2。

表2 清喉口含片體外抑菌試驗結果

3 結論與討論

本實驗以抑菌活性為指標所得優化工藝與本課題組前期以出膏率、損失率為指標的優化工藝［6］對比，提取次數、時間基本一致，醇沉后的出膏率在合理范圍內，但是醇沉體積分數降低近20%，故工藝更具經濟性;且以抑菌活性為指標，所得的優化結果更合理、更有針對性。清喉口含片浸膏的體外抑菌實驗結果顯示其抑菌率也有顯著提高，與前期本課題組其他提取工藝所得浸膏的抑菌試驗結果［7］對比，對于陽性菌，MIC、MBC一般提高一倍，對于陰性菌大多數都提高了3倍;與陽性對照藥雙黃連口服液相比，清喉口含片對于金黃色葡萄球菌、乙型溶血性鏈球菌、肺炎鏈球菌、大腸桿菌、綠膿桿菌的MIC和MBC值均比雙黃連口服液低，說明有較優的抑菌、殺菌作用，且提示本品可能在治療陰性菌引起的牙痛方面有應用價值，可以進行進一步的研究。

從均勻設計回歸方程的各項對比可見，B、C項的系數占比重較大，說明提取次數與醇沉濃度具有較大交互作用。

本制劑采用水提醇沉工藝能保留有效成分，又可除去雜質。本實驗采用均勻設計并對因素、水平進行調整盡量避免各因素在高水平重合，實驗數據經回歸處理，得回歸方程，結合實踐經驗選擇優化條件，結果確切，建議在中藥提取研究中推廣使用。

本實驗優化工藝所得浸膏將作為清喉口含片的主藥與蔗糖粉 (50%)、甘露醇 (20%)、乳糖 (30%)等輔料混合，再加上冰片、薄荷制成口含片。清喉口含片在咽喉局部的停留時間較長，局部濃度高，可以達到局部給藥、提高療效的作用。

［1］梁 璐，樸晉華，馬建麗.急性和慢性咽炎的發病機制與動物模型建立的研究現狀［J］.臨床醫藥實踐，2012，21(7):540-542.

［2］肖 碩，王宗喜.抗菌藥物在急性咽炎中的合理應用［J］.醫藥導報，2013，32(5):641-643.

［3］周 凌，馬 莉，劉曉華.近年來中醫藥治療急性咽炎的進展［J］.中醫藥學報，2007，34(1):37-39.

［4］周 凌，張競飛.中醫藥治療急性咽炎的臨床研究進展［J］.中醫藥學報，2012，40(4):135-137.

［5］林 慧，梅全喜.中藥制劑治療急性咽炎的研究進展［J］.時珍國醫國藥，2007，18(10):2448-2449.

［6］寧德俄，董 淳，楊宏圖，等.清喉口含片提取工藝的優化［J］.中國藥師，2004，7(9):703-705.

［7］常 翠，董 淳，楊宏圖，等.清喉口含片動物體內外抑菌實驗研究［J］.中國藥房，2006，17(5):336-338.

［8］鐘小群，張建榮，張俊明，等.精制六味安消膠囊提取工藝研究［J］.中成藥，2012，34(5):959-961.

［9］王耀文，孟憲生，包永睿，等.人參提取工藝的優化及其有效成分與藥效學相關性分析［J］.中成藥，2012，34(11):2240-2242.

［10］黎 迎，杜守穎，陸 洋，等.正交試驗結合藥效學實驗優選復方南星止痛膏處方提取工藝［J］.中國中藥雜志，2013，38(16):2590-2593.

［11］饒小勇，何雙鳳，吳志鵬，等.抗流感口服液的提取工藝優選［J］.中國實驗方劑學雜志，2013，19(4):31-34.

［12］陳 武，周洪亮，王海丹，等.多藥效學指標評價烏鱉顆粒中黃狗腎提取工藝［J］.中國中醫藥信息雜志，2010，17(8):49-50.

［13］王 鋒，左國營，韓 峻，等.37種滇產中草藥體外抗菌活性篩選［J］.中國臨床藥理學雜志，2013，29(7):523-526.

［14］Meng F Y，Zuo G Y，Hao X Y，et al.Antifungal activity of the benzo phenanthridine alkaloids from Chelidonium majus Linn against resistant clinical yeast isolates［J］.J Ethnopharmacol，2009，125(3):494-496.