中華絨螯蟹幼蟹對亮氨酸和異亮氨酸的需要量

楊 霞 葉金云 周志金 張易祥 吳成龍 明建華

(1. 湖州師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院, 浙江省水生生物資源養(yǎng)護(hù)與開發(fā)技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 湖州 313000;2. 湖州市水產(chǎn)技術(shù)推廣站, 湖州 313000)

亮氨酸(Leu)和異亮氨酸(Ile)是水產(chǎn)動(dòng)物體內(nèi)不能合成而必須從飼糧中獲取的氨基酸, 即必需氨基酸(EAA), 都屬于脂肪族氨基酸, 同時(shí)也都是支鏈氨基酸(BCAA)。它們特殊的結(jié)構(gòu)和功能在生命代謝中占有特別重要的地位。亮氨酸是BCAA中唯一的生酮氨基酸, 刺激胰島細(xì)胞釋放胰島素[1,2], 和纈氨酸、異亮氨酸一起可以起到保護(hù)肌肉的作用。亮氨酸的主要氧化部位在肌肉, 是合成機(jī)體蛋白質(zhì)的原料, 可以抑制蛋白降解和促進(jìn)肌肉蛋白合成[3—5];對血紅蛋白合成和維持血糖水平以及激素的增加有重要作用; 亮氨酸的缺乏可能引起嚴(yán)重的缺乏癥狀如生長的阻滯[6,7]。而異亮氨酸是合成動(dòng)物體激素和酶類的原料, 具有促進(jìn)蛋白質(zhì)合成和抑制其分解的作用。目前, 國內(nèi)外學(xué)者已經(jīng)開展了一些水產(chǎn)動(dòng)物對 Leu和 Ile營養(yǎng)需求的研究, 確定了虱目魚(Chanos chanos Forsskal)[8]、斑節(jié)對蝦(Penaeus monodon)[9]、印度鯪(Cirrhinus mrigala)[10]、草魚(Cenopharyngodon idellus)[11]、建鯉(Cyprinus carpio var.Jian)[12]、凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei)[13]等多種魚蝦的亮氨酸和異亮氨酸需求量。

中華絨螯蟹(Eriocheir sinensis), 俗稱河蟹、大閘蟹, 屬節(jié)肢動(dòng)物門甲殼綱, 是我國特有的淡水珍品。目前, 關(guān)于中華絨螯蟹對氨基酸需求的研究僅限于賴氨酸、蛋氨酸和精氨酸[14,15]。本試驗(yàn)以中華絨螯蟹幼蟹為研究對象, 以幼蟹的生長性能及肌肉必需氨基酸含量等為評價(jià)指標(biāo), 研究飼料中不同水平的Leu或 Ile對中華絨螯蟹生長的影響, 旨在獲得中華絨螯蟹幼蟹對Leu和Ile的需要量, 以期完善中華絨螯蟹對十種必需氨基酸需要量的數(shù)據(jù)庫, 為研制中華絨螯蟹營養(yǎng)平衡的人工配合飼料提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)用蟹

試驗(yàn)蟹苗購自上海市崇明島長江口中華絨螯蟹養(yǎng)殖基地, 采用經(jīng)過沉淀、過濾后的天然池塘水進(jìn)行養(yǎng)殖。水泥池中暫養(yǎng)一周, 挑取體重均一、附肢完整的幼蟹作為試驗(yàn)對象。采用底面為長方形(60 cm×85 cm, 水容量 300 L)的白色塑料水箱, 箱內(nèi)水深約30 cm, 每箱40只幼蟹, 初始體重為(0.90±0.02) g, 水箱內(nèi)放置足夠數(shù)量的網(wǎng)片及圓形PVC管作為隱蔽物。

1.2 試驗(yàn)飼料

采用單因子試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法, 為了使基礎(chǔ)飼料中目標(biāo)氨基酸(Leu或 Ile)含量盡可能低, 因此分別采用不同的飼料配方, 以酪蛋白、明膠、魚粉為蛋白源, 糊精、玉米淀粉為糖源, 魚油、豆油、卵磷脂為脂肪源制成基礎(chǔ)飼料。基礎(chǔ)飼料配方和營養(yǎng)組成見表 1, 氨基酸組成模式參照王樹英和陳輝[16]測定的河蟹肌肉氨基酸含量(表2)。每個(gè)試驗(yàn)分別設(shè)6個(gè)氨基酸濃度梯度, 每個(gè)濃度3重復(fù)。飼料中Leu添加梯度為0、0.4%、0.8%、1.2%、1.6%、2.0%, 實(shí)測各組飼料Leu含量為0.87%、1.26%、1.64%、2.03%、2.39%和2.81%; 飼料中Ile添加梯度為0、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%和2.5 %, 實(shí)測各組飼料Ile含量為0.69%、1.21%、1.70%、2.19%、2.70%和3.21% (表3)。

在試驗(yàn)飼料制作時(shí), 先將原料粉碎, 使原料粉末能全部通過60目試驗(yàn)篩, 再按比例充分混勻后加適量水?dāng)嚢? 通過絞肉機(jī)擠成直徑 1.5 mm的長條,風(fēng)干后, 破碎成粒徑為(1—2) mm 的破碎料, 置于4℃冰箱內(nèi)密封保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 基礎(chǔ)飼料配方及其營養(yǎng)組成Tab. 1 Formulation and nutritional composition of the basal diets (%)

表2 飼料配方中氨基酸混合物組成Tab. 2 Composition of amino acid mixtures in formulation (%)

1.3 飼養(yǎng)管理

采用表觀飽食投喂法, 每天于上午八點(diǎn)和下午五點(diǎn)投喂兩次, 次日吸污并補(bǔ)充養(yǎng)殖用水。此外, 每周定期測定水質(zhì)情況, 水溫(28—32)℃、溶解氧>5 mg/L、氨氮<0.1mg /L、pH 6.8—7.2, 連續(xù)充氣增氧, 實(shí)驗(yàn)周期60d。

1.4 樣品采集與分析

試驗(yàn)期間, 河蟹因脫殼或相互殘殺死亡后及時(shí)撈出, 并精確稱重, 其增重部分不計(jì)入試驗(yàn)結(jié)果。試驗(yàn)結(jié)束后, 停食24h, 撈出全部河蟹, 盡量瀝干水分,稱重。一部分烘干后作全蟹樣品, 用于常規(guī)生化分析; 一部分提取肌肉樣品, 濾紙吸干水分后用于氨基酸含量的測定。測定指標(biāo)包括水分、粗蛋白質(zhì)、粗脂肪、灰分以及氨基酸含量, 分別采用105℃恒重法、凱式定氮法、索氏抽提法、550℃馬福爐灼燒法以及氨基酸自動(dòng)分析儀。

計(jì)算公式: 特定生長率(SGR, %/d)＝(Ln結(jié)束時(shí)平均體重–Ln開始時(shí)平均體重) /試驗(yàn)天數(shù)×100; 成活率(SR, %)=實(shí)驗(yàn)結(jié)束后試驗(yàn)蟹數(shù)目/實(shí)驗(yàn)開始時(shí)試驗(yàn)蟹數(shù)目×100。

1.5 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示,采用 SPSS 20.0軟件包對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANOVA), 若有顯著差異, 再做Duncan’s多重比較, 檢驗(yàn)組間差異的顯著性(P<0.05)。

2 結(jié)果

2.1 不同氨基酸水平對中華絨螯蟹幼蟹生長性能的影響

飼料亮氨酸水平對中華絨螯蟹幼蟹末均重和特定生長率有顯著影響(P<0.05), 但對成活率影響不顯著(P>0.05) (表4)。河蟹的末均重和特定生長率隨飼料中亮氨酸含量的升高呈先上升后下降的趨勢。當(dāng)飼料中亮氨酸含量為2.39% (Leu-5組)時(shí), 河蟹幼蟹的末均重和特定生長率均達(dá)到最大值, 與 Leu-4和Leu-6組差異不顯著(P>0.05), 但顯著高于Leu-1、Leu-2和 Leu-3組(P<0.05)。

飼料中異亮氨酸水平對中華絨螯蟹幼蟹末均重和特定生長率均有顯著影響(P<0.05), 對成活率影響不顯著(P>0.05) (表5)。幼蟹的末均重和特定生長率隨飼料中異亮氨酸含量的升高呈先上升后下降的趨勢。當(dāng)飼料中異亮氨酸含量為2.19% (Ile-4組)時(shí),末均重和特定生長率均達(dá)到最大值, 顯著高于Ile-1、Ile-2、Ile-3和 Ile-6 組(P<0.05)。

表3 試驗(yàn)飼料中的氨基酸組成(實(shí)測值)Tab. 3 Composition of amino acid in test diets (measured value) (%)

表4 飼料Leu水平對中華絨螯蟹幼蟹生長性能的影響Tab. 4 Effect of dietary leucine levels on growth performance of juvenile E. sinensis

表5 飼料Ile水平對中華絨螯蟹幼蟹生長性能的影響Tab. 5 Effect of dietary isoleucine levels on growth performance of juvenile E. sinensis

2.2 中華絨螯蟹幼蟹對亮氨酸和異亮氨酸的需要量

以氨基酸水平(x)為橫坐標(biāo), 特定生長率(y)為縱坐標(biāo), 根據(jù)折線模型得出中華絨螯蟹幼蟹飼料中亮氨酸最適需要量為 2.36% (圖 1), 占蛋白含量的5.88%; 飼料中異亮氨酸最適需要量為2.25% (圖2),占蛋白含量的5.72%。

圖1 飼料亮氨酸水平對中華絨螯蟹幼蟹特定生長率的影響Fig. 1 Effect of dietary Leu level on SGR of the crab

圖2 飼料異亮氨酸水平對中華絨螯蟹幼蟹特定生長率的影響Fig. 2 Effect of dietary Ile level on SGR of the crab

2.3 亮氨酸水平對中華絨螯蟹幼蟹體組成的影響

由表 6可知, 飼料中亮氨酸水平對中華絨螯蟹全蟹水分、粗脂肪和灰分沒有顯著影響(P>0.05)。粗蛋白含量隨著飼料中亮氨酸水平的增加呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢, 當(dāng)飼料中亮氨酸含量為 2.39%(Leu-5組)時(shí), 河蟹粗蛋白含量達(dá)到最大值12.49%。

2.4 異亮氨酸水平對中華絨螯蟹幼蟹體組成的影響

由表7可知, 飼料中異亮氨酸水平對中華絨螯蟹全蟹水分、粗脂肪和灰分沒有顯著性差異(P>0.05)。粗蛋白含量隨著飼料中異亮氨酸水平的增加呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢, 當(dāng)飼料中異亮氨酸含量為2.19%(Ile-4組)時(shí), 河蟹粗蛋白含量達(dá)到最大值12.43%。

2.5 亮氨酸水平對中華絨螯蟹幼蟹肌肉氨基酸組成的影響

由表 8可知, 亮氨酸水平對河蟹肌肉谷氨酸、纈氨酸、半胱氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、絲氨酸、脯氨酸以及必需氨基酸總量(∑EAA)、非必需氨基酸總量(∑NEAA)、氨基酸總量(TAA)有顯著性影響(P<0.05), 對其他氨基酸影響不顯著(P>0.05)。當(dāng)飼料中亮氨酸含量大于2.39% (Leu-5和Leu-6組)時(shí),河蟹肌肉中的Leu含量、必需氨基酸總量和氨基酸總量均顯著高于其他各試驗(yàn)組(P<0.05)。

2.6 異亮氨酸水平對中華絨螯蟹幼蟹肌肉氨基酸組成的影響

由表9可知, 異亮氨酸水平對河蟹肌肉谷氨酸、纈氨酸、組氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、絲氨酸、脯氨酸以及∑EAA、∑NEAA、TAA有顯著影響(P<0.05),對其他氨基酸無顯著影響(P>0.05)。河蟹肌肉中的Ile含量、必需氨基酸總量和氨基酸總量隨飼料中異亮氨酸含量的增加呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢, 最大值均出現(xiàn)在 Ile-5組(2.70% Ile), 但 Ile-5組與 Ile-4組(2.19% Ile)差異不顯著(P>0.05)。

表6 飼料Leu水平對中華絨螯蟹幼蟹體組成的影響Tab. 6 Effect of dietary leucine levels on body composition of juvenile E. sinensis (%)

表7 飼料Ile水平對中華絨螯蟹幼蟹體組成的影響Tab. 7 Effect of dietary isoleucine levels on body composition of juvenile E. sinensis (%)

表8 飼料Leu水平對中華絨螯蟹肌肉氨基酸組成的影響Tab. 8 Effect of dietary leucine levels on AA composition in muscles of E. sinensis (%)

表9 飼料Ile水平對中華絨螯蟹肌肉氨基酸組成的影響Tab. 9 Effect of dietary isoleucine levels on amino acid composition in muscles of E. sinensis (%)

3 討論

亮氨酸是甲殼動(dòng)物的必需氨基酸之一, 與異亮氨酸和纈氨酸被稱為 BCAA。Leu是合成機(jī)體蛋白質(zhì)的原料, 具有許多重要的生物學(xué)功能。在本試驗(yàn)中, 飼料 Leu含量不足時(shí), 河蟹表現(xiàn)出顯著的生長抑制, 隨著飼料中 Leu水平逐漸增加, 河蟹幼蟹的生長性能明顯得到改善。這說明Leu可以為幼蟹的生長提供營養(yǎng), 中華絨螯蟹能夠利用晶體 Leu。以SGR為評價(jià)指標(biāo), 通過折線模型得到中華絨螯蟹對Leu的需要量為 2.36%的飼料干物質(zhì), 即占飼料蛋白的 5.88%。此需要量高于以往報(bào)道的甲殼動(dòng)物對Leu的營養(yǎng)需求(占飼料蛋白百分比), 如斑節(jié)對蝦4.3%[9]、凡納濱對蝦 5.71%[13]、日本對蝦(Marsupenaeus japonicus) 3.4%[17]和南美白對蝦(Penaeus vannamei) 5.45%[18]。與其他水生動(dòng)物相比, 高于南亞野鯪(Labeo rohita) (3.75—3.92)%[6]、建鯉 3.7%[7]、大西洋鮭(Salmo salar) 5.2%[19]、大菱鲆(Psetta maxima)4.6%[20]、白鱘(Acipenser transmontanus) 4.3%[21]、印度鯪 3.9%[10]、鱸魚(Lateolabrax japonicus) 5.67%[22]等的亮氨酸需要量; 低于虹鱒(Oncorhynchus mykiss)9.2%[23]、團(tuán)頭魴(Megalobrama amblycephala) 6.98%[24]和大黃魚(Pseudosciaena crocea) 6.79%[25]的研究結(jié)果。這說明不同種類的動(dòng)物對亮氨酸需要量的差異較大, 可能與實(shí)驗(yàn)對象、個(gè)體大小、飼養(yǎng)管理、實(shí)驗(yàn)條件以及飼料組成和適口性等有關(guān)。另外, 本試驗(yàn)使用的是晶體氨基酸, 溶出問題也可能會對試驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響。這些影響因素有待進(jìn)一步研究完善。

適宜的Leu水平能夠提高中華絨螯蟹幼蟹生長,隨著飼料中Leu水平的升高, 河蟹幼蟹SGR和全蟹粗蛋白質(zhì)含量均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。當(dāng)飼料中Leu的含量為2.39% (Leu-5組)時(shí), SGR和機(jī)體粗蛋白含量達(dá)最大值, 但 Leu-5組與 Leu-6組的 SGR和機(jī)體粗蛋白質(zhì)含量差異不顯著, 說明過多的 Leu并沒有明顯限制河蟹幼蟹生長, 這與之前的研究結(jié)果略有不同[7,13,22], 或者飼料中Leu水平還可以繼續(xù)增加, 說明河蟹幼蟹對Leu的需要量較高。

異亮氨酸屬于脂肪族中性氨基酸, 也是生物體必需氨基酸之一, 與結(jié)構(gòu)類似的亮氨酸、纈氨酸在營養(yǎng)上有相關(guān)性, 因其特殊的結(jié)構(gòu)和功能, 在生命代謝中占有特別重要的地位。目前有關(guān)甲殼動(dòng)物對異亮氨酸需要量的研究較少, 只確定了斑節(jié)對蝦[9]和南美白對蝦[13]對Ile的需要量分別為 2.7%和4.33% (占飼料蛋白百分比)。本試驗(yàn)通過折線回歸模型得到中華絨螯蟹對Ile的需要量為2.25%的飼料干物質(zhì), 即占飼料蛋白的5.72%。由此可見不同種類甲殼動(dòng)物對Ile的需要量存在較大差異。而且, 鑒于相關(guān)研究文獻(xiàn)極少, 實(shí)驗(yàn)結(jié)果有待進(jìn)一步證實(shí)。

另外, 3種支鏈氨基酸之間的拮抗作用也會影響某種支鏈氨基酸的需求量[26], 但這種拮抗作用在甲殼動(dòng)物中還未見闡明。在本試驗(yàn)中, 飼料氨基酸組成模式是參照中華絨螯蟹肌肉氨基酸模式設(shè)計(jì)而得,使其滿足除實(shí)驗(yàn)氨基酸外其他兩種氨基酸的需求,以期減小因支鏈氨基酸間的拮抗對實(shí)驗(yàn)氨基酸需求量結(jié)果的影響。通過檢測中華絨螯蟹肌肉氨基酸的組成, 發(fā)現(xiàn)飼料中亮氨酸或異亮氨酸的含量對肌肉中三種支鏈氨基酸的含量具有顯著影響, 而且與全蟹粗蛋白的變化趨勢極其相似, 均呈先增加后降低的趨勢。但是滿足需求后, 飼料中實(shí)驗(yàn)氨基酸水平對肌肉中三種支鏈氨基酸含量的影響也隨之減小。有報(bào)道也認(rèn)為, 當(dāng)飼料中其他支鏈氨基酸含量滿足其最低需求時(shí), 其拮抗作用對實(shí)驗(yàn)氨基酸需求量結(jié)果的影響較小[27]。此外, 亮氨酸對全蟹蛋白和肌肉TAA測定結(jié)果表明, Leu需求滿足后, 繼續(xù)升高飼料Leu水平對蛋白質(zhì)合成無影響。Garlick研究發(fā)現(xiàn), 高濃度的亮氨酸對除骨骼肌以外的機(jī)體組織蛋白質(zhì)的降解有抑制作用[28]。因此, 當(dāng)Leu水平升高時(shí)并未對蛋白質(zhì)的合成和降解產(chǎn)生顯著影響。而在異亮氨酸實(shí)驗(yàn)中, 飼料中Ile水平過高(Ile-6)時(shí), 全蟹蛋白和肌肉TAA顯著下降, 說明過量的Ile可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)合成代謝下降, 分解代謝增強(qiáng), 從而抑制蛋白質(zhì)沉積及幼蟹生長。

綜上所述, 根據(jù)特定生長率和飼料氨基酸水平進(jìn)行折線回歸模型, 得到中華絨螯蟹幼蟹對亮氨酸的最適需要量為飼料干物質(zhì)的 2.36% (占飼料蛋白5.88%), 異亮氨酸的最適需要量為飼料干物質(zhì)的2.25% (占飼料蛋白5.72%)。