酸提香菇多糖的抗氧化活性研究

梅光明，張小軍，郝 強，郭遠明，朱敬萍

(1.浙江海洋學院海洋與漁業研究所,浙江省海洋水產研究所,浙江舟山 316021; 2.北京海燕藥業有限公司,北京 102206)

酸提香菇多糖的抗氧化活性研究

梅光明1，張小軍1，郝 強2，郭遠明1，朱敬萍1

(1.浙江海洋學院海洋與漁業研究所,浙江省海洋水產研究所,浙江舟山 316021; 2.北京海燕藥業有限公司,北京 102206)

以香菇柄為材料,利用稀鹽酸浸提得到粗香菇多糖SP和凈化分級后的香菇多糖SP2,在化學發光體系下研究兩種多糖在清除超氧陰離子、清除經基自由基、清除過氧化氫和抑制DNA氧化損傷方面的作用;用可見光比色法比較SP和SP2與VC和VE的還原能力大小;同時研究了兩種多糖對H2O2誘導小鼠紅細胞氧化溶血和小鼠紅細胞自氧化溶血的影響以及在小鼠體內抗氧化效果。結果表明香菇多糖SP和SP2對超氧陰離子、經基自由基和過氧化氫均具有清除作用和抑制DNA氧化損傷作用,從SC50值看出,香菇多糖經過純化后作用減弱,這可能是因為香菇多糖之間或與其它物質有協同作用有關;可見光比色法表明SP和SP2具有還原能力,為表現抗氧化活性的可能提供了基礎;SP和SP2對H2O2誘導小鼠紅細胞氧化溶血以及小鼠紅細胞自氧化溶血均有抑制效果;體內抗氧化試驗表明SP和SP2可以減少小鼠體內肝組織丙二醛的生成,提高血清中超氧化物歧化酶的活力。研究為開發酸提香菇多糖功能性食品和香菇柄資源綜合利用提供理論基礎。

香菇;多糖;抗氧化

香菇Lentinus edodes在分類上屬擔子菌綱,傘菌目,側耳科,香菇屬[1]。香菇味道鮮美,營養豐富,是著名的食用兼藥用真菌,其中主要成分為香菇多糖,研究證實香菇多糖具有抗腫瘤、抗氧化和提高人體免疫力等多種生理活性功能[2-5]。從1969年日本學者CHIHARA等[6]首先利用熱水浸提法從香菇子實體中分離出一種能抑制腫瘤的β-（1→3）葡聚糖多糖以來,香菇多糖就引起了各國科學家的研究興趣,因提取方式和純化方法的不同,得到的香菇多糖結構特點也不同[7-11]。目前研究較多的香菇多糖主要采用熱水浸提法、堿提取法、超聲波或微波輔助熱水提取法和酶解輔助提取法[12-14]。水浸提提取香菇多糖的得率較低,課題小組前期通過研究建立了從香菇加工廢棄物—香菇柄中用稀鹽酸溶液提取香菇多糖的方法[15],提高了香菇多糖的提取效率。本研究對得到的酸提香菇多糖進行抗氧化活性進行研究,考察其在化學模擬體系、體內及體外抗氧化活性大小,可為開辟一種新的活性香菇多糖來源和香菇資源的綜合利用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

香菇柄由湖北房縣華榕香菇加工廠提供;試驗小鼠為SPF級昆明種小白鼠,雌性,體重（20.0±2.0）g,湖北省實驗動物研究中心提供,生產許可證號SCXK（鄂）2003-0005,使用許可證號SYXK（鄂）2003-0014;VE、小牛胸腺DNA和魯米諾均為生化試劑,美國Sigma公司生產;牛血清蛋白為電泳純,中科院新疆化學所生化試劑廠生產;MDA、SOD試劑盒,南京建成生物工程研究所生產;其它試劑均為分析純,國藥集團化學試劑有限公司生產。

1.2 主要試劑配置

0.5 %小鼠紅細胞懸浮液:小鼠眼眶取血,加入EDTA抗凝劑(4%的EDTA水溶液)后,以3 000 r/min離心10 min,分離得到紅細胞,冷生理鹽水洗滌紅細胞3次,再以生理鹽水制備成0.5%小鼠紅細胞懸浮液,備用。

小鼠10%肝勻漿:取新鮮的小鼠肝組織以冰冷的生理鹽水洗凈血漬,用濾紙吸干水分后稱重,按1：9取相應體積的冷生理鹽水于冰浴中分步將肝組織剪碎、在玻璃組織勻漿器中勻漿制成勻漿液,以3 500 r/ min離心20min,上清液即為10%肝組織勻漿液。

小鼠肝線粒體懸浮液:取新鮮的小鼠肝組織以冷的生理鹽水洗凈血漬吸干表面水分后,按1：9的比例加冰冷的pH 7.4等滲磷酸鹽緩沖液(PBS)剪碎后用玻璃勻漿器在冰浴中勻漿制成10%肝組織勻漿液,然后在4℃下以1 000 r/min離心15min,收集上清液,再以10 000 r/min離心15min,收集沉淀并以等滲磷酸鹽緩沖液洗滌沉淀2次,接著以等滲磷酸鹽緩沖液將沉淀分散制成肝線粒體懸液,用考馬斯亮藍法[16]測定該懸浮液的蛋白質含量,調整成蛋白質含量為0.5mg/mL的線粒體懸浮液,備用。

1.3 主要試驗儀器

AL204分析天平,上海梅特勒公司;S22分光光度計,上海棱光技術有限公司;HH-系列恒溫水浴鍋,常州市國華儀器廠;BPCL-I型超微弱化學發光測量儀,中國科學院生物物理所;5424R型臺式微量高速冷凍離心機,Eppendorf公司;5810R型臺式高速冷凍離心機,Eppendorf公司;玻璃勻漿器,武漢市民權玻璃儀器廠。

1.4 實驗方法

1.4.1 酸提香菇多糖的制備

稱取烘干粉碎并經40～60目篩分后的香菇柄樣品100 g,經300mL石油醚（30～60℃沸程）提取3 h進行脫脂,用濾布過濾后,濾渣用80%乙醇300mL再回流提取2次,每次2 h,除酚類色素、單糖和低聚糖,過濾后固體殘渣經70℃烘干備用。參照文獻[15]中的方法提取得到酸提粗香菇多糖SP。粗多糖經鞣酸法脫蛋白[17]、雙氧水脫色[18]后,經醇沉、離心后純水復溶。利用不同分子量大小的多糖在乙醇-水溶液中溶解度不同的原理將其進一步分離純化。在乙醇-水溶液終濃度分別為50%、70%、90%的條件下,得到3個級分多糖,分別命名為SP1、SP2、SP3,三個級分多糖的得率分別為25.58%、64.77%、9.64%。

1.4.2 清除超氧陰離子

采用鄰苯三酚-魯米諾化學發光體系,魯米諾用0.05 M的NaOH溶液配成0.05 M濃度的溶液,在避光處保存,臨用前用雙蒸水稀釋成1mM的溶液,鄰苯三酚用1mM HCl配成0.01 M的溶液,4℃冰箱中保存,臨用前用雙蒸水稀釋16倍得6.25×10-4M溶液。0.05 M pH 10.2的Na2CO3-NaHCO3緩沖液(含0.1 mM EDTA)用前現配,實驗前與1mM魯米諾以體積比為2∶1混合成魯米諾和碳酸鹽緩沖液混合物。測量時,向發光池中注入10.0μL不同濃度的樣品(以樣品緩沖液為對照),然后注入6.25×10-4M鄰苯三酚0.05 mL,最后加入魯米諾和碳酸緩沖液混合物0.94 mL啟動反應(30℃),間隔2 s記數發光強度,測定300 s的總發光積分強度。本底發光強度為未添加鄰苯三酚時的發光值。以樣品濃度對的清除率作圖,就可以得到清除50%的時所需各樣品的SC50值。清除率計算公式為:清除率(%)=(對照組發光強度-樣品組發光強度)/對照組發光強度[19-22]。

1.4.3 清除經基自由基

采用CuSO4-Phen-Vc-H2O2化學發光體系,取50μL樣品于樣品池(以樣品緩沖液為對照)中,分別加入1.0 mM CuSO4溶液50μL,1.0 mM鄰菲啰啉溶液50μL,0.05 M硼砂溶液700μL（pH 9.0）,充分混勻,然后再加入100μL 1.0mM抗壞血酸溶液和50μL 0.15%H2O2溶液(本底不加雙氧水),立即啟動化學發光系統,間隔2 s記數,記錄300 s內化學發光動力學曲線[19-22]。

1.4.4 清除過氧化氫

采用雙氧水-魯米諾化學發光體系,取待測樣品各50μL于樣品池中,加入50μL 0.15%H2O2和900 μL 0.1mM魯米諾-pH 9.4 0.05M碳酸鹽緩沖液混合液(體積比為1：17),啟動發光系統,間隔2 s記數,記錄180 s內發光強度[19-22]。

1.4.5 抑制DNA氧化損傷

采用CuSO4-Phen-Vc-H2O2-DNA化學發光體系,分別用去離子水配制0.1 M CH3COOH-CH3COONa緩沖液,4.2×10-3M抗壞血酸溶液,3%H2O2,及DNA-Cu2+-Phen體系(DNA濃度為3μg/mL,CuSO4·5H2O濃度為7.5×10-5M,Phen 5.25×10-4M)。在發光池中依次加入100μL樣品溶液,800μL DNA-Cu2+-Phen體系溶液,100μL抗壞血酸溶液,輕輕振蕩混勻后,置于發光裝置中,打開記錄系統后,立刻注入200μL的雙氧水,立刻啟動發光裝置,每隔2 s記錄數據1次,記錄540 s內的動態發光過程[23-24]。

1.4.6 還原能力測定

取1 mL樣品溶液加入0.2 mL 0.2 M PBS（pH 6.6）和0.5 mL 1%K3[Fe（CN）6]于試管中50℃水浴20 min,取出后流水冷卻,加入1mL 10%三氯乙酸,以3 000 r/min離心10min,取1.5 mL上清液,加0.2mL 1%FeCl3和3 mL蒸餾水搖勻,放置5 min,以蒸餾水作為無還原能力的樣品對照調零,700 nm處測定吸光值。A700越大,表示還原能力越強。除VE用40%（v/v）乙醇溶解外,其他樣品均用蒸餾水溶解。VE及VC作為有還原能力的樣品對照[25-26]。

1.4.7 H2O2誘導小鼠紅細胞氧化溶血的影響

取1mL紅細胞懸浮液,加入0.2mL樣品溶液混勻后,加0.1 mL 100 mM H2O2溶液,混勻,37℃溫育1 h后,以生理鹽水稀釋6倍,1 000 r/min離心10min,取上清液,以生理鹽水調零,于415 nm處比色測定吸光度。正常對照組以等體積生理鹽水代替樣品液和H2O2溶液,其余同樣品組。H2O2誘導對照組以等體積生理鹽水代替樣品溶液,其余同樣品組。分別以吸光度計算溶血度和抑制率。溶血度（%）=(樣品管吸光度/H2O2誘導對照組吸光度)×100,抑制率（%）=1-溶血度（%）。

1.4.8 對小鼠紅細胞自氧化溶血的影響

取紅細胞懸浮液5 mL與0.2mL不同濃度的樣品混合,于37℃溫育24 h（對照管以蒸餾水代替樣品液）,然后以生理鹽水稀釋5倍,1 000 r/m離心10min取上清液,于540 nm處比色,根據吸光度計算抑制率,公式如下:溶血抑制率（%）=（1-樣品管吸光度/對照管吸光度）×100。

1.4.9 體內抗氧化

昆明種小鼠70只,小鼠隨機分成7組(正常對照組、SP和SP2試驗組),每組10只。正常對照組小鼠喂養按常規條件進行,SP和SP2試驗組分別以高、中、低三個樣品劑量（100、50、25mg/kg）每日定期灌胃1次,連續灌胃20 d后,眼眶取血處死小鼠,分離血清,按照試劑盒的方法測定血清的SOD;取新鮮小鼠肝組織制備成10%肝勻漿液,再按MDA測定試劑盒說明書測定A532,并計算MDA含量。

1.4.10 統計學分析

所有實驗數據采用SPSS17.0軟件進行統計學分析,并用均數±標準差±s）表示。單獨兩組計量數據比較采用t檢驗,多組計量數據比較采用方差分析（ANOVA）。

2 結果與分析

2.1 清除超氧陰離子測定

鄰苯三酚在堿性條件下自氧化產生超氧陰離子,以魯米諾為發光劑,超氧陰離子與化學發光劑魯米諾反應使之氧化,產生一個電子激發態的中間物,當其返回到基態時可發出化學冷光。從圖1可知,在1.25～20 mg/mL濃度范圍內,SP和SP2對超氧陰離子均有清除作用,并表現出一定的量效關系,且SP對超氧陰離子清除作用要好于SP2,SP、SP2清除率擬合曲線分別為y=25.203 ln（x）+30.57(相關系數R2=0.986)和y=24.777 ln（x）+ 14.304(相關系數R2=0.950),根據擬合曲線計算出SP、SP2的SC50值分別為2.5 mg/mL和10 mg/ mL。2.2清除羥基自由基測定

圖1 香菇多糖SP和SP2對超氧陰離子的清除作用Fig.1 The scavenging activity on superoxide anion of SP and SP2

體系中Cu2+被VC還原成Cu+，Cu+與H2O2在Fenton反應中產生·OH，·OH使鄰菲啰啉激發,鄰菲啰啉退激時產生化學發光。從圖2可知,在0.075～1.2 mg/mL濃度范圍內,粗多糖SP和香菇多糖SP2對經基自由基均有清除作用,并隨著其濃度的增加,對經基自由基的清除率增加。粗多糖SP對經基自由基的清除率從 24.77%增加到79.85%。香菇多糖SP2也表現出抑制該體系發光的趨勢,在濃度為1.25 mg/mL時,清除率為62.28%。SP、SP2清除率擬合曲線分別為 y= 33.432 ln（x）+23.023(相關系數R2=0.989)和y= 31.599 ln（x）+9.6344(相關系數R2=0.988),根據擬合曲線計算出SP、SP2的SC50值分別為0.15 mg/mL和0.3mg/mL。

圖2 香菇多糖SP和SP2對羥基自由基的清除作用Fig.2 The scavenging activity on hydroxyl radical of SP and SP2

2.3 清除過氧化氫測定

基于H2O2能在有氧和堿性條件下氧化魯米諾產生化學發光。從圖3可知,粗多糖SP和香菇多糖SP2在該體系中均表現出一定的清除過氧化氫作用,并隨著其濃度的增加,對過氧化氫的清除率增加。SP、SP2清除率擬合曲線分別為y=29.3 ln（x）+ 17.87(相關系數R2=0.968)和y=28.134 ln（x）+9.804(相關系數R2=0.970),根據擬合曲線計算出SP、SP2的SC50值分別為7.8 μg/mL和15.6μg/mL。

圖3 香菇多糖SP和SP2對過氧化氫的清除作用Fig.3 The scavenging activity on hydrogen peroxide of SP and SP2

2.4 抑制DNA氧化損傷測定

利用CuSO4-Phen-Vc-H2O2體系產生· OH,·OH引起DNA損傷斷裂,產生延遲于Phen本身氧化發光的滯后的化學發光。抗氧化劑的加入能夠明顯影響DNA損傷發光的形成。從圖4可知,粗多糖SP對DNA損傷的抑制率隨濃度增加,而成直線上升趨勢,當粗多糖SP濃度為1.25 mg/mL時,抑制率為90.45%。香菇多糖SP2同樣在0.078～1.25mg/ mL濃度范圍內呈上升趨勢抑制經基自由基引起DNA損傷斷裂,在濃度1.25mg/mL時,抑制率為66.08%,SC50為0.625 mg/mL。SP、SP2抑制率擬合曲線分別為y=46.67 ln（x）+ 11.512(相關系數R2=0.970)和y=34.385 ln（x）+ 3.630(相關系數R2=0.953),根據擬合曲線計算出SP、SP2的SC50值分別為0.312 5 mg/mL和0.625mg/mL。

圖4 香菇多糖SP和SP2抑制DNA氧化損傷的作用Fig.4 The inhibiting activity on DNA oxidative damage of SP and SP2

2.5 還原能力測定

從圖5可見,粗多糖SP的還原能力隨著多糖溶液濃度的增加呈增長趨勢,并表現出一定的量效關系,在0.5mg/mL的濃度以下,還原能力低于30μg/mL Vc體系和2μL/mL VE體系,在0.5 mg/mL濃度以上,還原能力超過30μg/mL Vc體系和2μL/mL VE體系。而香菇多糖SP2的還原能力明顯低于粗多糖,隨著濃度的增加,還原能力也呈較好的增長趨勢,也表現出一定的量效關系,在2 mg/mL的濃度,還原能力已超過30μg/ mL Vc體系和2μL/mL VE體系。推測其原因可能是因為脫蛋白的過程中粗多糖的某些氫鍵斷裂造成糖蛋白空間結構的改變,導致香菇多糖SP2的還原能力減弱。結果表明,香菇多糖具有還原能力,具有表現抗氧化活性的可能。

圖5 香菇多糖SP和SP2的還原能力Fig.5 The reducing power of SP and SP2

2.6 對H2O2誘導小鼠紅細胞氧化溶血的影響

實驗通過H2O2誘導氧化,根據體系中加入不同濃度的香菇多糖,抑制紅細胞誘導氧化溶血。香菇多糖對H2O2誘導小鼠紅細胞氧化溶血的影響見表1。

表1 香菇多糖對H2O2誘導的體外小鼠紅細胞溶血的影響（n=3）Tab.1 Effects of SP and SP2 onmice erythrocyte hemolysis caused by H2O2-induced oxidation（n=3）

由表1可知,隨著多糖濃度的增加,粗多糖SP和香菇多糖SP2在抑制H2O2誘導的小鼠紅細胞溶血時,都表現為一定的量效關系。但粗多糖SP在濃度0.05～2.00mg/mL范圍內是隨著濃度的增加,對于H2O2誘導小鼠紅細胞氧化溶血的抑制效果是逐步增加,但在濃度10.00mg/mL下,抑制小鼠紅細胞氧化溶血能力下降。可能是樣品不純凈或濃度過高,使反應體系滲透壓超出了紅細胞的生理滲透壓所致。香菇多糖SP2對H2O2誘導的小鼠紅細胞溶血的抑制效果要好于粗多糖SP,隨著濃度的增加,抑制效果也是逐步提高,有明顯的劑量-效應關系。由此可知,香菇多糖對與H2O2誘導小鼠紅細胞氧化溶血的抑制有一定效果。

2.7 對小鼠紅細胞自氧化溶血的影響

香菇多糖對小鼠紅細胞自氧化溶血的影響見表2。

表2 香菇多糖對小鼠紅細胞自氧化溶血的影響（n=3）Tab.2 Effects of SP and SP2 onmice erythrocyte hemolysis caused by autoxidation（n=3）

由表2可知,粗多糖SP隨著多糖濃度的增加,對小鼠紅細胞自氧化溶血有抑制作用,但沒有明顯的劑量-效應關系。香菇多糖SP2在濃度0.05～10.00mg/mL范圍內的最高抑制率低于粗多糖SP,但隨著濃度的增大,抑制率在逐步增加,表現出明顯的劑量-效應關系。在10.00 mg/mL的濃度時,香菇多糖SP2的抑制效果已接近粗多糖SP的最高抑制率。

2.8 體內抗氧化效果

香菇多糖SP和SP2在小白鼠體內抗氧化結果見表3。

表3 香菇多糖在小鼠體內抗氧化試驗結果Tab.3 Antioxidant results of SP and SP2 onmice in vivo

結果表明在肝勻漿MDA測定中,SP低劑量組與正常對照組相比較有顯著差別(P＜0.05),中劑量組和高劑量組MDA含量明顯降低,有極顯著差別(P＜0.01),SP2高中低3個劑量組與正常對照組相比較均有極顯著差別(P＜0.01),SP和SP2都表現出一定的量效關系;在血清SOD測定中,SP組中劑量和高劑量組與正常對照組相比較,SOD活力明顯提高,有極顯著差別(P＜0.01),SP2組中劑量組與正常對照組相比較有顯著差別(P＜0.05),高劑量組有極顯著差別(P＜0.01),SP和SP2也都表現出一定的量效關系。結果表明香菇多糖SP和SP2可以降低肝組織MDA的生成,提高小鼠血清SOD的活力。

3 結論

化學發光體系評價表明香菇多糖SP和SP2均具有抗氧化活性及DNA損傷保護作用,從SC50值看出,香菇多糖經過純化后,清除超氧陰離子、經基自由基、過氧化氫和抑制DNA損傷的作用減弱,這可能是因為香菇多糖之間或與其它物質有協同作用。化學模擬體系實驗表明,酸提香菇多糖具有還原能力,為表現抗氧化活性的可能提供了基礎。體外抗氧化試驗表明,酸提香菇多糖對與H2O2誘導小鼠紅細胞氧化溶血以及小鼠紅細胞自氧化溶血都有一定抑制效果。體內抗氧化動物試驗表明,酸提香菇多糖可以減少小鼠體內肝組織MDA的生成,提高超氧化物歧化酶的活力。本研究為開辟一種新的活性香菇多糖來源和香菇資源的綜合利用提供理論基礎。

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Antioxidant Activity of Polysaccharide from Lentinus edodes Extracted by Acid Solution

MEIGuang-ming1，ZHANG Xiao-jun1，HAO Qiang2，et al
（1.Marine and Fishery Research Institute of Zhejiang Ocean University，Marine Fishery Research Institute of Zhejiang Province，Zhoushan 316021；2.Beijing Haiyan Pharmaceutical Co Ltd，Beijing 102206，China）

In this research，the foot body of Lentinus edodes was used as experimentalmaterial to extract crude polysaccharide SP and purified polysaccharide SP2 by dilute hydrochloric acid.The ability of SP and SP2 in scavenging activity against superoxide anion，hydroxyl radical，hydrogen peroxide and inhibiting oxidative damage of DNA were studied under chemiluminescence system.The reducing power of SP and SP2 was detected using VIS spectrophotometry，compared with VCand VE.Influence of SP and SP2 on mice erythrocyte hemolysis caused by H2O2-induced oxidation and autoxidation and antioxidant effects onmice in vivo were also studied.The results showed that SP and SP2 had good effects on scavenging superoxide anion，hydroxyl radicalsand hydrogen peroxide and inhibiting DNA oxidative damage.From the SC50values，the above effects for SP2 were weaker than SP，probably because of synergistic effect between polysaccharides with other sustances. With the ability of reducing power，it provided a basis for SP and SP2 with the antioxidant activity.SP and SP2 had inhibitory effects on mice erythrocyte hemolysis caused by H2O2-induced oxidation and autoxidation. The experiments in vivo showed SP and SP2 could reduced forming ofmalondialdehyde in liver tissue and enhanced the activity of superoxide dismutase in serum.The results provided a theoretical basis for development of functional foods of polysaccharide and comprehensive utilization of L.edodes.

Lentinus edodes；polysaccharide；antioxidant

TS201.4

A

1008-830X（2014）05-0406-08

2014-06-04

浙江省科技計劃項目(2012F20026)

梅光明(1984-),男,湖北黃岡人,碩士,工程師,研究方向:食品加工與質量安全控制.