發(fā)酵對(duì)新鮮甜玉米秸稈生產(chǎn)乙醇的影響

高瑞芳，張建國(guó)

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院 農(nóng)業(yè)部能源植物資源與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510642)

隨著經(jīng)濟(jì)發(fā)展、人口增長(zhǎng)和生活水平的提高，能源危機(jī)、糧食短缺、環(huán)境污染等問題已引起世界各國(guó)的廣泛關(guān)注[1-3]。為了逐漸擺脫對(duì)化石能源的過度依賴，保證糧食安全，減少溫室氣體排放等，各國(guó)紛紛研究適合自己國(guó)情的生物質(zhì)能源，而燃料乙醇作為可再生液體燃料資源，是較理想的替代品。其中，纖維素類資源作為地球上最豐富的可再生資源，具有廣闊的發(fā)展前景[4]。

我國(guó)是一個(gè)農(nóng)業(yè)大國(guó)，同時(shí)也是世界秸稈大國(guó)[5]，農(nóng)作物秸稈年產(chǎn)量約7億t，占世界作物秸稈的20%～30%。其中，玉米作為重要的糧飼兼用作物[6]，其秸稈是我國(guó)三大秸稈資源之一[7]，年產(chǎn)量達(dá)2.5億t，約占農(nóng)作物秸稈總量的40%[8-10]。目前，僅有有限的部分被有效利用，而大部分以燒荒、堆積等形式處理，造成極大的資源浪費(fèi)和環(huán)境污染[11]，所以將其作為燃料乙醇轉(zhuǎn)化原料潛力巨大，且有利于人類社會(huì)的可持續(xù)發(fā)展[12]。近年來，我國(guó)甜玉米種植面積達(dá)33多萬(wàn)hm2[13]。廣東省作為我國(guó)乃至全世界重要的甜玉米生產(chǎn)基地之一[14]，2010年甜玉米種植面積達(dá)14.4萬(wàn)hm2，近年達(dá)20萬(wàn)hm2，其種植面積占全國(guó)50%以上，占世界近10%[13,15-16]，所以甜玉米秸稈資源豐富。康利平等[17]研究了甜高粱莖稈同步糖化發(fā)酵生產(chǎn)燃料乙醇，當(dāng)耐高溫釀酒酵母接種量3%，纖維素酶10 FPU/g、β-葡萄糖苷酶10 CBU/g，40℃發(fā)酵24 h，乙醇得率為7.5% DM，與不添加酶相比，乙醇得率提高了14.6%。王菁莎[18]采用鄭單958、邢抗2個(gè)品種的玉米秸稈進(jìn)行加酶和不加酶發(fā)酵試驗(yàn)，結(jié)果添加纖維素酶提高了乙醇產(chǎn)量。本研究以新鮮甜玉米秸稈為原料直接發(fā)酵生產(chǎn)燃料乙醇，旨在充分利用農(nóng)作物秸稈及為燃料乙醇的工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

2012年6月18日收獲處于乳熟期的農(nóng)甜88玉米(Zeamaysvar.rugosa)秸稈，此品種由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院甜玉米組培育。收獲后帶回實(shí)驗(yàn)室，機(jī)械切短1～2 cm，混合均勻。稱量100 g鮮樣3份，用于化學(xué)組分分析，其余用于發(fā)酵試驗(yàn)。

1.2 添加劑

釀酒酵母(J)購(gòu)于廣東省微生物所；纖維素酶(E)購(gòu)于美國(guó)Sigma公司，濾紙酶活16000 FPU/g；乳酸菌HT1(R)為乳桿菌屬鼠李糖乳桿菌，華南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院草產(chǎn)品實(shí)驗(yàn)室分離菌株。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)設(shè)添加劑和發(fā)酵時(shí)間兩因素。添加劑分為J、JR(J+R)、JE(J+E)、JER(J+E+R)、MJ(滅菌后添加J)、MJER(滅菌后添加J+E+R)、CK(對(duì)照)，發(fā)酵時(shí)間分為10，20，30，40 d，共28個(gè)處理，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。

1.4 處理、發(fā)酵

釀酒酵母添加量為105cfu/g FM、乳酸菌為106cfu/g FM，纖維素酶為20 FPU/g DM，對(duì)照不添加任何添加劑。原料與添加劑混勻后裝入30 cm×20 cm的聚乙烯青貯袋，每袋300 g，每個(gè)處理3袋。用真空密封機(jī)抽氣、密封，在室溫下發(fā)酵。

1.5 測(cè)定項(xiàng)目及方法

1.5.1化學(xué)組分分析 干物質(zhì)(DM)含量采用105℃干燥法測(cè)定；纖維素、半纖維素和木質(zhì)素含量在Van Soest法的基礎(chǔ)上使用改進(jìn)的濾袋分析法測(cè)定[19]；灰分含量采用灼燒法測(cè)定[20]；可溶性碳水化合物(WSC)含量采用蒽酮-硫酸法測(cè)定[21]。

1.5.2乙醇產(chǎn)量測(cè)定 乙醇產(chǎn)量采用氣相色譜儀GC7890Ⅱ測(cè)定，色譜條件：毛細(xì)管柱TM-FFAP(30 m×0.32 mm×0.25 μm)，柱溫140℃，進(jìn)樣口溫度200℃，F(xiàn)ID檢測(cè)器溫度300℃。氣流速度：氫氣流量30 mL/min，空氣400 mL/min，尾吹(氮?dú)?30 mL/min。進(jìn)樣量1 μL[22]。

1.5.3pH值及有機(jī)酸含量測(cè)定 發(fā)酵結(jié)束開封時(shí)，稱取20 g混合均勻的青貯料放入聚乙烯塑料封口袋中，加入80 mL蒸餾水，在4℃下浸泡18 h后過濾，用pH計(jì)測(cè)定浸提液pH值[23]。有機(jī)酸含量用Agilent 1100型高效液相色譜儀測(cè)定[24]，色譜條件：色譜柱(RSpak KC-811昭和電氣)，流動(dòng)相為3 mmol/L的高氯酸溶液，流速1 mL/min，柱溫60℃，檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel和SPSS 17.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 甜玉米秸稈原料的化學(xué)組分

通常青貯料適宜收獲的含水量為75%～80%或更高[25]，本試驗(yàn)收獲的玉米秸稈含水量為76.21%，所以比較適宜青貯。因玉米秸稈仍處于乳熟期，所以其可溶性碳水化合物含量相對(duì)較高，達(dá)13.59%，所以為發(fā)酵提供了較多的糖源。任天寶[26]發(fā)酵生產(chǎn)乙醇使用的玉米秸稈纖維素含量為35%～40%，半纖維素含量為20%～30%，木質(zhì)素含量為10%～20%[27-28]。與此相比，本試驗(yàn)玉米秸稈的纖維素含量相對(duì)較低(24.75%)(表1)。

2.2 發(fā)酵甜玉米秸稈的化學(xué)組分

表1 甜玉米秸稈的化學(xué)組分Table 1 Chemical compositions of sweet corm stalk

注：FM：鮮物質(zhì)，DM：干物質(zhì)。下同。

Note： FM: Fresh matter, DM: Dry matter, WSC: Water soluble carbohydrates. The same below.

WSC含量隨發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)而顯著降低(P<0.05)，發(fā)酵30和40 d的纖維素含量顯著低于發(fā)酵10和20 d的(P<0.05)，發(fā)酵40 d的半纖維素含量顯著低于發(fā)酵10和20 d的(P<0.05)。各添加劑處理的WSC含量與CK比，僅J、JR和MJ處理顯著降低，其余高于或與CK無(wú)顯著差異；半纖維素含量?jī)HMJ處理的顯著高于其余各處理(P<0.05)；而纖維素含量均與CK無(wú)顯著差異(P>0.05)。發(fā)酵時(shí)間和添加劑互作顯著影響甜玉米秸稈的WSC含量，而對(duì)纖維素和半纖維素含量無(wú)顯著影響(表2)。

2.3 發(fā)酵甜玉米秸稈的乙醇產(chǎn)量、pH值及有機(jī)酸含量

MJ處理在各發(fā)酵時(shí)間段乙醇產(chǎn)量均最高，發(fā)酵10 d時(shí)乙醇含量可達(dá)17.89% DM，MJER處理在各發(fā)酵時(shí)間段的乙醇產(chǎn)量稍低于MJ處理，其余處理均與CK無(wú)明顯差異(圖1)。正如圖2和圖3所示，MJ處理的pH值明顯高于其他處理，總酸(乳酸、乙酸、丙酸、丁酸)含量均低于其他處理；MJER處理的pH值與其余處理無(wú)差異，總酸含量發(fā)酵10,20和40 d時(shí)與其余處理無(wú)差異而發(fā)酵30 d時(shí)也均低于其他處理。表明MJ處理在發(fā)酵過程中僅有少量糖轉(zhuǎn)化為有機(jī)酸。基于以上試驗(yàn)結(jié)果，最佳的發(fā)酵條件是滅菌后添加釀酒酵母、發(fā)酵10 d，乙醇產(chǎn)量達(dá)17.89% DM。

3 討論

甜玉米秸稈所有處理發(fā)酵后的乙醇產(chǎn)量和有機(jī)酸含量的總和為17.08%～32.26% DM，其值均大于甜玉米秸稈原料的WSC含量(13.59% DM)，說明在發(fā)酵過程中原料的纖維素和半纖維素不斷轉(zhuǎn)化為WSC，為酵母菌發(fā)酵提供了糖源，有利于提高乙醇產(chǎn)量。表2也證明了這一事實(shí)：隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，纖維素、半纖維素含量顯著降低(P<0.05)。

目前，乳酸菌多用于改善青貯飼料的品質(zhì)[29-31]，而在發(fā)酵生產(chǎn)燃料乙醇中的應(yīng)用還比較少。據(jù)報(bào)道[32]，添加乳酸菌和酵母菌混合發(fā)酵，會(huì)增加乙醇產(chǎn)量，可能是由于乳酸菌使發(fā)酵液pH值降低，為酵母菌的生長(zhǎng)代謝創(chuàng)造了適宜的條件，導(dǎo)致乙醇產(chǎn)量增加。而本試驗(yàn)添加乳酸菌發(fā)酵后并未提高乙醇產(chǎn)量，原因可能是酵母菌的最適生長(zhǎng)pH值為4～5[32-33]，而甜玉米秸稈發(fā)酵后pH值為3.45～4.68(圖2)。所以在發(fā)酵過程中無(wú)論是否添加乳酸菌，各處理的pH值均已降到酵母菌生長(zhǎng)的酸性環(huán)境。

表2 發(fā)酵甜玉米秸稈的化學(xué)組分Table 2 The chemical compositions of sweet corn stalk after fermenting % DM

注：表中同列中同一因素不同字母表示在P<0.05水平差異顯著，*:0.05水平作用顯著，NS：作用不顯著。

Note： Means of the same factor with the different letters in the same column are significantly different at the 0.05 level, *: Significant atP<0.05, NS: Not significant.

圖1 發(fā)酵甜玉米秸稈的乙醇產(chǎn)量Fig.1 The ethanol yield of sweet corn stalk after fermenting

纖維素酶是影響糖化和發(fā)酵效率的重要因素[34]。纖維素酶使纖維素和半纖維素轉(zhuǎn)化為糖類，再由微生物進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為乙醇[35]。目前，傳統(tǒng)的釀酒酵母仍比其他酵母、真菌或細(xì)菌生產(chǎn)乙醇的效率高，它能在完全缺氧的條件下生長(zhǎng)，耐高糖，且乙醇耐受力較強(qiáng)，可達(dá)150 g/L[36]。但由于缺乏木糖代謝途徑的關(guān)鍵酶基因，因而它只能發(fā)酵葡萄糖、果糖、麥芽糖和蔗糖，不能轉(zhuǎn)化半纖維素中的戊糖[37]，而半纖維素水解產(chǎn)物中約90%為木糖[38]。如能高效利用纖維原料中的木糖，將木糖轉(zhuǎn)化為乙醇，在理論上可提高纖維原料發(fā)酵乙醇產(chǎn)量達(dá)25%，降低生產(chǎn)成本[39-41]。田沈等[42]構(gòu)建的大腸桿菌(Escherichiacoli)(PGM-PA)使乙醇產(chǎn)量明顯提高，固定化大腸桿菌(PGM-PA)發(fā)酵混合糖的乙醇產(chǎn)率達(dá)到理論值的85%，木糖利用率達(dá)到80%，混合糖利用率達(dá)83%。而本研究滅菌后添加酵母菌、乳酸菌和纖維素酶的處理在發(fā)酵后乙醇產(chǎn)量稍低于滅菌后僅添加酵母菌的處理，其原因可能是乳酸菌的存在也消耗了部分糖，導(dǎo)致乙醇產(chǎn)量相對(duì)低一些[43]，MJER處理的有機(jī)酸含量比MJ處理高45.19%。或可能是滅菌后添加酵母菌、乳酸菌和纖維素酶的處理酶解得到的戊糖未被利用，因?yàn)镸JER處理半纖維素含量顯著低于MJ處理(表2)。此外，同步糖化發(fā)酵法存在酵母發(fā)酵與酶水解最適溫度不一致的問題[17]。酶的最佳水解溫度為45～50℃，而酵母發(fā)酵的最佳溫度為28～35℃，同步糖化發(fā)酵常在32～38℃，這使酶解效率受到影響[37,44-45]，減少了糖的含量，從而降低了乙醇產(chǎn)量。本試驗(yàn)僅在室溫下發(fā)酵，溫度相對(duì)較低，可能也是影響乙醇產(chǎn)量的原因之一。因此，篩選耐高溫的發(fā)酵菌株，提高產(chǎn)乙醇的發(fā)酵溫度，從而提高發(fā)酵效率，是乙醇生產(chǎn)需要解決的重點(diǎn)問題之一。

圖2 發(fā)酵甜玉米秸稈的pH值Fig.2 The pH value of sweet corn stalk after fermenting

圖3 發(fā)酵甜玉米秸稈的總酸含量Fig.3 The total acid content of sweet corn stalk after fermenting

一般經(jīng)過預(yù)處理的纖維素秸稈，其酶解率可達(dá)理論值的90%以上，若對(duì)原料不采用任何預(yù)處理，其酶解率低于20%[46]。EI-Zawawy等[47]以蒸汽爆破法、化學(xué)制漿法、微波處理為前處理分別與酸解酶解進(jìn)行組合試驗(yàn)處理玉米芯和稻草，結(jié)果玉米芯和稻草分別采用蒸汽爆破法與酶解組合、化學(xué)制漿法與酶解組合可獲得較高的乙醇產(chǎn)量。Chen等[48]研究了青貯對(duì)大麥稈、小麥稈和棉花稈的總纖維含量(纖維素+半纖維素)、糖化率的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)青貯均會(huì)降低3種原料的總纖維含量(約1.31%～9.93%)、提高糖化率(約1.3%～5.2%)。本試驗(yàn)也同樣采用了青貯方法，所以青貯可能也可替代常用的預(yù)處理方式，將其應(yīng)用于燃料乙醇生產(chǎn)中，不僅降低投資成本和能源投入，而且有利于提高乙醇產(chǎn)量，這與Yukiko和Hiroko[49]研究青貯對(duì)發(fā)酵作用的結(jié)果相似。

Kitamoto等[50]以250 g含水量62%的新鮮飼料稻為原料，添加纖維素酶和葡萄糖淀粉酶，在28℃下發(fā)酵20 d后乙醇產(chǎn)量為16.9% DM。本試驗(yàn)發(fā)酵的乙醇產(chǎn)量為17.89% DM，可能是因發(fā)酵原料不同而各自的WSC含量存在差異。Kitamoto等[50]使用的是飼料稻，而本試驗(yàn)使用的是處于乳熟期的甜玉米秸稈，WSC含量相對(duì)較高，可利用的可溶性碳水化合物較多，所以乙醇產(chǎn)量相對(duì)較高。此外，可能滅菌過程消除了不利于乙醇生產(chǎn)的微生物，促進(jìn)了發(fā)酵，從而提高了乙醇產(chǎn)量。

4 結(jié)論

不同添加劑和發(fā)酵時(shí)間對(duì)直接發(fā)酵甜玉米秸稈生產(chǎn)乙醇有不同的影響。在室溫下甜玉米秸稈滅菌后添加酵母菌、發(fā)酵10 d，乙醇產(chǎn)量最高，達(dá)17.89% DM。