不同來源地骨皮藥材中地骨皮甲素和乙素及阿魏酸的含量測定分析

趙曉玲 ，張鑫瑤 ，何春年 ，彭 勇

(1．中國醫學科學院北京協和醫學院藥用植物研究所，北京 100193; 2．國家教育部中草藥物質基礎與資源利用重點實驗室，北京 100193)

地骨皮為茄科植物枸杞 Lycium chinense Mill．或寧夏枸杞Lycium barbarum L．的干燥根皮，主產于山西、陜西、寧夏以及華北等地，味甘，性寒，歸肺、肝、腎經[1]。地骨皮為常用中藥，具有涼血除蒸、清肺降火的功能，用于陰虛潮熱、骨蒸盜汗、肺熱咳嗽、咯血、內熱消渴等癥[2]。從20世紀80年代開始，對地骨皮進行了一系列化學成分和藥理活性研究，發現其主要成分包括黃酮、有機酸、多肽類、甾醇、香豆素和揮發油等，藥理作用主要為降血壓、降血糖、解熱和鎮痛等。然而，迄今地骨皮有效成分尚不明確，《中國藥典》也沒有含量測定項[3]。為了更好地控制地骨皮藥材質量，本試驗對地骨皮中有較明確藥理活性的地骨皮甲素/乙素和阿魏酸兩類化合物進行含量測定研究。

地骨皮甲素和地骨皮乙素(結構見圖1)屬于精胺生物堿。地骨皮甲素、乙素體外可以從源頭阻斷細胞的炎癥活化，避免免疫反應紊亂，體內可對脂多糖和CpG DNA發揮拮抗作用，因此地骨皮甲素、乙素是糾正免疫紊亂、發揮防止膿毒癥和自身免疫性疾病作用的重要物質基礎[4];另外，還具有錐蟲基硫還原酶抑制[5]和細菌內毒素拮抗[6]等活性。地骨皮甲素和乙素同時存在于中藥地骨皮中，是主要的降血壓有效成分[7];兩者系同分異構體，在常規色譜條件下難以分離[8-9]。同時，兩者藥理活性均非常明顯，因此在本試驗中作為同一指標進行測定。

圖1 化學結構式

阿魏酸(結構見圖1)是植物中廣泛分布的一種芳香酸，具有抗血小板聚集、抑制血小板5-羥色胺釋放、抑制血小板血栓素A2的生成[7]、增強前列腺素活性、鎮痛、緩解血管痙攣等作用[8]。因此，在本試驗中采用高效液相色譜-二極管陣列檢測器(HPLC-DAD)法同時測定了不同來源地骨皮藥材中地骨皮甲素、乙素和阿魏酸含量，比較分析其含量在該藥材中存在的一般規律，以期為該藥材的質量控制、評價以及資源開發利用等提供一定依據。

1 儀器與材料

Agilent 1200型高效液相色譜儀，包括 G1322A型在線脫氣機、G1311A型液相泵、G1329A自動進樣器、G1316A柱溫箱、G1315B型DAD檢測器、Agilent色譜工作站;UV2550型紫外光譜儀(日本島津公司);AL204型梅特勒-托利多電子天平;DTC-21型ULVAC薄膜真空泵;C9860A型超聲波清洗器(上海杰恩普超聲設備有限公司)。色譜純為乙腈(美國Honeywell B＆JACS公司)，實驗用水為娃哈哈純凈水;其他試劑均為分析純。地骨皮乙素對照品(批號為12021708)、阿魏酸對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號為100519)。地骨皮藥材包括筆者采集的來源于野生和栽培的品種及購自全國各大藥店的樣品，經北京協和醫學院藥用植物研究所彭勇研究員鑒定為枸杞 Lycium chinense Mill．或寧夏枸杞 L．barbarum L．的干燥根皮。

2 方法與結果

2．1 色譜條件

色譜柱:Synergi 4u Hydro-RP 80A柱(250 mm ×4．6 mm，4 μm);流動相:乙腈(A)-0．5%三氟乙酸水溶液(B)，梯度洗脫，0～3 min時 10%A，3～10 min時 10% ～12%A，10～20 min時12% ～14%A，20～35 min時 14% ～15%A;流速:1．0 mL/min;柱溫:30℃;檢測波長:278 nm;進樣量:10 μL。色譜圖見圖2。

圖2 高效液相色譜圖

2．2 溶液制備

精密稱取地骨皮甲素對照品13．67 mg、地骨皮乙素對照品27．34 mg，阿魏酸對照品 2．30 mg，分別置 1，10 mL 容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得每1 mL含地骨皮甲素13 670 μg、地骨皮乙素27 340 μg和阿魏酸230 μg的對照品溶液。取本品粉末約1．5 g，精密稱定，置30 mL西林瓶中，加甲醇15 mL，冷浸1 h，40℃超聲處理1 h，靜置，放冷至室溫，濾過，用10 mL甲醇分2次洗滌殘渣，過濾，合并兩次濾液，蒸干;殘留物用甲醇分次溶解，轉移至2 mL容量瓶中，并定容置刻度，搖勻，過0．45 μm微孔濾膜，即得供試品溶液。

2．3 方法學考察

線性關系考察:取地骨皮乙素對照品溶液，將其依次稀釋成質量濃度分別為 27 340．0，13 670．0，1 367．0，273．4，136．7 μg/mL，將阿魏酸對照品溶液依次稀釋成質量濃度分別為230．0，57．5，23．0，11．5，4．6 μg/mL，按擬訂色譜條件測定，記錄色譜圖。以進樣質量濃度為橫坐標、峰面積為縱坐標繪制標準曲線，得回歸方程，地骨皮乙素為 Y=2．462 2X-329．607 3，r2=0．999 5(n=5)，阿魏酸為 Y=23．5955X-5．8775，r2=1．0000(n=5)。結果表明，地骨皮乙素與阿魏酸質量濃度線性范圍分別為136．7～27340μg/mL和 4．6 ～230 μg/mL。

精密度試驗:精密吸取供試品(32號樣品)溶液，按擬訂色譜條件，連續進樣6次，記錄峰面積。結果地骨皮乙素與阿魏酸峰面積積分值的 RSD分別為0．54%和0．92%，表明儀器精密度良好。

重復性試驗:取32號地骨皮樣品粉末1．5 g，共6份，精密稱定，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件檢測。結果地骨皮乙素和阿魏酸峰面積積分值的 RSD分別為1．61%和1．05%(n=6)，表明方法重復性良好。

穩定性試驗:精密吸取供試品(32號樣品)溶液，室溫下，分別于制樣后 0，2，4，8，12，24 h 時按擬訂色譜條件進樣檢測。結果地骨皮乙素和阿魏酸峰面積的 RSD分別為 0．65% 和2．23%(n=6)，表明供試品溶液中地骨皮乙素和阿魏酸在24 h內穩定。

加樣回收試驗:取已知含量的32號地骨皮樣品各9份，每份約1．5 g，精密稱定，分別加入定量地骨皮乙素和阿魏酸對照品，依法制備供試品溶液，測定樣品中地骨皮乙素和阿魏酸含量，計算加樣回收率。結果見表1。

表1 加樣回收試驗結果(n=9)

2．4 樣品含量測定

精密吸取各批次供試品溶液10 μL，按擬訂色譜條件進樣，以外標法計算樣品中地骨皮乙素和阿魏酸的含量，結果見表2。可見，在野生的8個 L．chinense樣品中，山西、陜西和寧夏的樣品1，2，3，5，6 號中地骨皮乙素含量較高，均不低于 8．969 mg/g，但阿魏酸含量不一，含量最低值8．602 μg/g出現在5號的山西樣品中;在3個栽培的 L．barbarum樣品中，地骨皮乙素的含量均相對較高，介于9．090～15．026 mg/g，而阿魏酸含量則處于中等偏下水平，均小于11．292 μg/g;在市售的33個樣品中，產地為安徽、內蒙古和湖南的 12，13，14，33，34，41，42 號樣品中地骨皮乙素的含量均在1 mg/g以下，含量相對較低，呈現了一定的地域規律，除兩個北方的內蒙樣品外，其他均為南方購買藥材，而阿魏酸含量則介于 10．208 ～34．336 μg/g，無明顯的地域差異。分析L．chinense和 L．barbarum這兩個種間的地骨皮乙素和阿魏酸含量，L．chinense中地骨皮乙素的含量相對偏高，除了上述提到的地域差別外，只有17，20，25號樣品中地骨皮乙素含量低于5 mg/g;而 L．barbarum中除38號樣品地骨皮乙素的含量為8．609 mg/g外，其他樣品的含量均低于5．021 mg/g，兩個種間阿魏酸含量的4 個最高值都出現在 L．chinense樣品中，分別是 27，32，36，37 號樣品。

表2 樣品中阿魏酸含量測定結果(n=3)

3 討論

本試驗采用了不同比例的甲醇、乙醇為提取溶劑進行超聲提取，發現甲醇提取的粗提物中雜質峰相對較少;考察了不同流動相及添加酸水種類，發現以乙腈和含0．5%三氟乙酸作為流動相檢測，地骨皮乙素和阿魏酸色譜峰分離度好，無干擾，因此選擇乙腈-0．5%三氟乙酸水系統進行梯度洗脫。此外，本試驗也比較了不同檢測波長，發現在278 nm波長處地骨皮乙素具有最大吸收，同時阿魏酸也有較好的分離度且峰形較好，可較準確地測定含量，因此選擇278 nm作為檢測波長[10]。

本試驗測定的地骨皮甲素、乙素和阿魏酸各有其特有的生物活性。地骨皮甲素是錐蟲基硫還原酶的有效抑制劑[4]，地骨皮乙素是一種新型的天然抗敗血癥劑[11]，且兩者在地骨皮中的含量較大;而阿魏酸作為一種化感物質，在根內可以表現出抑制競爭性植物生長的作用[12]，在枸杞栽培的過程中可能會產生一定的影響。此外，地骨皮甲素和乙素兩者系同分異構體，紫外檢測條件下在同一保留時間出峰(見圖2)[8-9]。鑒于此，本試驗在前期準備中利用紫外分光光度計測定并計算相同條件下兩者的摩爾吸光系數 ε，分別為 1．69 ×105L/(mol·cm)和 1．68 ×105L/(mol·cm)，兩者差別不大。如圖2所示，在購買到的對照品中地骨皮甲素的純度只有85%，因此本試驗將地骨皮甲素和乙素作為一個指標，以地骨皮乙素作對照品進行成分含量的共同標定，試驗結果證明該方法是可行的。結合含量測定結果，將地骨皮甲素、乙素作為地骨皮質量控制的特征性指標是合適的，且地骨皮中地骨皮甲素、乙素以地骨皮乙素計，含量不應低于1 mg/g。

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