MicroRNA-29a、-133a在持續性房顫模型犬心房肌中的表達變化*

李發鵬， 張 健， 許國軍， 甘天翊， 湯寶鵬， 李耀東， 毛 婷， 姜 濤

在臨床實踐中，心房顫動(atrial fibrillation，AF)是常見的心律失常之一。近年來隨著對房顫的臨床和基礎研究的不斷深入，人們發現結構重構與老年持續性房顫密切相關，并且認為，結構重構是房顫發生和維持的重要原因。而在結構重構中心房肌的纖維化被認為是房顫發生的重要結構基礎［1］。房顫的發生隨心房纖維化程度的增加而增加，持續性房顫的維持和難以轉復與心房肌纖維化有關［2］。MicroR-NA(miRNA)是近來發現的一類高度保守的、非編碼的、能在轉錄后水平調節基因表達的小分子RNA。近年來，miRNA在心臟的生長發育以及心血管疾病發生發展中所起的作用日益為研究人員所關注，特別是心律失常方面。心肌細胞具有特異性的miRNA表達譜。而最新研究發現miRNA與心肌纖維化的關系很密切。miRNAs直接參與心肌纖維化，能直接作用于心臟成纖維細胞，調控心臟成纖維細胞的存活［3］。MicroRNA-29a和-133a在心肌中特異性表達及與纖維化密切相關［4-5］。本研究通過制備犬持續性房顫模型，利用病理學及分子生物學方法檢測持續性房顫模型犬心房肌中膠原的分布情況以及microRNA-29a、-133a表達變化，探索持續性房顫與心房肌間質纖維化及miRNA表達改變的關系。

材料和方法

1 對象

選用健康的成年比格犬10只，雌雄不限，犬齡平均(2.2±0.3)歲，體重(10.24±1.38)kg，由新疆醫科大學第一附屬醫院實驗動物中心提供。實驗設計及實施均經過新疆醫科大學第一附屬醫院動物倫理委員會的審核批準。

2 方法

2.1 分組和持續性房顫犬模型的建立 選用健康成年比格犬10只，隨機分為假手術組(竇性心律)5只，持續性房顫模型組5只。為建立持續性房顫模型，選健康比格犬5只，記錄年齡、性別和體重，并行心臟超聲測量心房及心室大小。常規消毒手術器械及手術環境。基礎麻醉后行氣管插管，呼吸機輔助呼吸。動態記錄犬正常II導聯心電圖。犬右側臥位，打開心包，暴露左心耳，將起搏電極縫合固定于左心耳的底部。用起搏分析儀測量各項電參數(電壓閾值＜1 V，阻抗500～1 000Ω)，然后將電極尾端與實驗用動物埋藏式高頻心臟起搏器(上海復旦大學電子工程系制造)相連，用Lead-2000多道電生理記錄儀描記標準體表心電圖，磁鐵靠近后開啟起搏器，觀察起搏器工作狀態，若起搏功能良好，快速起搏后出現心房顫動，每分鐘約600次，關閉起搏器，檢查心包、胸腔出血情況，將起搏器埋藏于胸部皮下囊袋內。觀察犬的癥狀及體征。犬的一般情況穩定后開啟起搏器予以連續起搏4周左右，動態監測心電圖證實為持續性心房顫動，持續時間大于15 min的心房顫動定義為持續性心房顫動［6］。假手術組埋置起搏器后不起搏。模型建立成功后，使用心臟超聲儀分別測量2組犬的心臟結構，包括左右心房、心室的大小及射血分數等參數。由于正式實驗前進行了充分的預實驗，因此本次實驗較為成功。假手術組犬全部順利完成實驗，慢性房顫模型組犬中有5只順利完成實驗，有1只因為術后感染、囊袋血腫于術后1周左右死亡。持續性房顫模型組犬在快速起搏8周以后，有3只(60%)出現自發性房顫，須經直流電復律或迷走刺激方能終止。采用程序刺激，4只(80%)可誘發出持續性房顫，平均房顫持續時間(45±12)min。采用高頻Burst刺激全部(100%)誘發出持續性房顫，平均房顫持續時間(52±14)min。在無菌狀態下取左心房組織并保存于液氮中，后轉入-80℃冰箱保存備用。

2.2 Masson三色法染色鑒定持續性房顫模型犬左心房組織纖維化程度 建模成功后取左心房游離壁，生理鹽水漂洗干凈，10%甲醛溶液固定，石蠟包埋，切片。Masson三色法染色(福州邁新)，彩色圖像分析系統計算出膠原容積分數(collagen volume fraction，CVF)=膠原面積/全視野面積×100%。

2.3 實時熒光定量PCR檢測左心房組織中microRNA-29a及microRNA-133a表達的水平 。建模成功后取100 mg左心房組織，用Trizol(Invitrogen)一步法提取總RNA。取2μg總RNA參照逆反錄試劑盒(Promega)進行操作逆轉錄成cDNA。引物由Gene Copoeia公司合成。引物序列見表1。

表1 引物序列Table 1.Sequences for primers

采用染料法(SYBR Green I)進行相對定量分析，實驗設計是按照ΔΔCt解析法來進行。Real-time PCR體系(20 μL):待測樣品cDNA稀釋5倍，然后取 cDNA 2 μL，2 × All-in-OneTMqPCR mix 10 μL(Gene Copoeia)，PCR forward primer(2 μmol/L)2 μL，universal adaptor PCR primer(2 μmol/L)2 μL，ddH2O 4 μL。反應條件:95℃預變性10 min，隨后進入PCR循環，95℃ 10 s，60℃ 20 s，72℃ 10 s，40個循環。反應完成后利用iQ5 real-time PCR Detection System(Bio-Rad)根據 Ct值計算 2-ΔΔCt得出目的microRNA相對表達量。

3 統計學處理

數據采用SPSS 17.0統計軟件分析，計量資料以均數±標準差(mean±SD)表示，首先對數據進行正態性檢驗和方差齊性檢驗，組間比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 2組犬超聲心動圖資料比較

1.1 假手術組犬與持續性房顫模型組犬造模前超聲心動圖資料比較 假手術組犬與持續性房顫模型組犬比較均未發現心臟結構有明顯異常，與假手術組犬相比，持續性房顫模型組犬超聲心動圖指標如:左心房內徑、右心房內徑、左心室內徑、右心室內徑、右心室流出道內徑和射血分數差異均無統計學意義，見表2。

表2 假手術組犬和持續性房顫模型組犬超聲心動圖資料比較Table 2.The dog echocardiographic data comparison of the control and persistent atrial fibrillation model group(Mean±SD.n=5)

1.2 持續性房顫模型組犬造模前后超聲心動圖資料比較 持續性房顫模型組犬造模前后相比，左、右心房內徑和射血分數與造模前比較無明顯差異，左心室內徑、右心室內徑和右心室流出道內徑等變化均無統計學意義，見表3。

表3 持續性房顫模型組犬造模前后超聲心動圖資料比較Table 3.The echocardiography data comparison of persistent AF group and before modeling(Mean±SD.n=5)

2 Masson三色染色結果

通過染色后在光鏡下我們可以觀察到:膠原纖維、黏液等呈現出藍色，細胞核呈現出黑藍色，而胞漿、胞質、肌纖維和纖維素等呈現出紅色。假手術組即竇性心律組心房肌主要以紅色的肌纖維為主，并且排列整齊，藍色的膠原纖維分布較少，分布在血管周圍，見圖1。持續性房顫模型組心房肌，心肌纖維間隙增寬，并且排列紊亂，相互交織，藍色的膠原纖維顯著增多，見圖2。分別計算假手術組及持續性房顫模型組犬左心房心肌中膠原容積分數，發現持續性房顫模型組心房肌中的膠原容積分數明顯高于假手術組，見表4。

表4 假手術組和持續性房顫模型組CVF比較Table 4.The comparison of CVF between control group and persistent atrial fibrillation model group(Mean±SD.n=5)

Figure 1.Masson staining of atrium section in control group(×200).圖1 假手術組Masson染色

Figure 2.Masson staining of atrium section in persistent atrial fibrillation model group(×200).圖2 持續性房顫模型組Masson染色

3m iRNAs的表達

假手術組與持續性房顫模型組心房肌中2種miRNAs表達含量見表5。與假手術組相比，持續性房顫模型組心房肌組織中microRNA-29a及microRNA-133a表達水平明顯下降。

表5 2組犬左心房肌組織中miR-133a和miR-29a表達量的比較Table 5.The comparison of expression of miR-133a and miR-29a in left atrium muscle organization between control group and persistent atrial fibrillation model group(Mean±SD.n=5)

討 論

大量研究表明，心房結構重構在房顫的發生及維持過程中起重要作用。心房電重構在持續性房顫復律后短時間內并非完全消失，由于結構重構持續存在［7-8］，這時房顫有可能再度發生。因此，心房電重構在房顫最初階段起部分作用，后期則是心房結構重構起作用［9］。心房的結構重構表現為心房肌細胞結構變化，如心房擴大、心房肌間質的纖維化。并且有研究表明心房容積的大小與房顫的穩定性顯著正相關，心房擴大后使得房顫復律后更易復發。該實驗發現持續性房顫模型組犬在成模后與造模前相比，左右心房內徑有增大趨勢，射血分數降低，但差異不具有統計學意義。造模后射血分數降低可能是房顫時心房擴大導致心房主動收縮功能喪失，心房射血量降低，從而導致心室充盈量減少，同時房顫時心室率增快，心律絕對不規則，舒張期縮短，左室充盈量受限，因此射血分數下降。另外，房顫的持續時間越長，心房擴大越明顯，但因造模時間較短，房顫持續時間較短，心房內徑呈增大趨勢，但增大的幅度無統計學意義。

心房肌的纖維化是結構重構的重要表現，也是房顫發生的重要結構基礎。心肌纖維化表現為膠原合成代謝和分解代謝失衡。當膠原降解平衡被打破后，導致心肌細胞外基質(extracellular matrix，ECM)合成與降解的動態失衡，促使大量ECM積聚而沉積在心肌細胞間質中，并使心肌細胞排列錯亂，導致了心肌纖維化的發生。該實驗研究發現與假手術組相比，持續性房顫模型組犬左心房心肌組織中膠原成份明顯增多，粗細纖維混亂交織，排列紊亂，其中以粗纖維為主。并且通過計算其膠原容積分數后，持續性房顫模型組犬的膠原容積分數較假手術組明顯增高。從組織病理學上證實了持續性房顫模型組纖維化程度明顯加重，證實了心房纖維化是房顫發生及維持的重要基質，這與既往的研究一致。

miRNAs在心血管疾病的發育以及病理生理過程中扮演著十分重要的角色［10］。在某些如擴張型心肌病、缺血性心肌病、心肌梗死等病理狀態下，miR-1、miR-21、miR-29、miR-30、miR-208、miR-320 及 miR-199a等可促進或抑制心肌纖維化的形成，參與心律失常發生［3，11-15］。國外學者將 Smad3-/-小鼠和正常小鼠經過主動脈縮窄后，實驗組與對照組相比，小鼠的心肌纖維化程度減少大約60%，并檢測到實驗組小鼠心肌中miRNA-29a表達水平較對照組增高，提示miRNA-29a有抑制心肌纖維化的作用，機制可能與調節Smad3通路相關［16］。并有研究發現在心肌梗死小鼠模型和心梗患者的梗死邊緣帶心肌組織中miR-29的表達水平明顯下降，并將miR-29低表達后發現心肌組織中最多的Ⅰ型及Ⅲ型膠原蛋白和原纖蛋白mRNA水平上調，心肌組織中膠原含量增高，纖維化程度加重，心肌重塑增加，均表明了miR-29參與了心肌纖維化過程［14］。Duisters 等［15］研究發現miR-133過表達可使結締組織生長因子(connective tissue growth factor，CTGF)mRNA表達水平下降，減少心肌膠原蛋白的生成，抑制心肌纖維化，并推測在CTGF的mRNA的3′末端存在miR-133的靶點。最近的一項報道發現煙草中的尼古丁成分可以使房顫模型犬及吸煙的房顫患者心肌中miR-133下調，同時發現使其下調的原因是心肌中TGF-β1、轉化生長因子β受體Ⅱ (TGF-βRⅡ)信使RNA的降解減少了，使得心肌成纖維細胞增生，膠原合成增加，膠原蛋白含量升高，心肌纖維化程度加重，促進了心房結構重構，從而與房顫的發生及維持密切相關［12］。張瑩等［17］通過制備犬持續性房顫模型，應用基因芯片技術分析了犬房顫心肌中10個miRNAs的表達譜，發現了其中4個上調，6個下調，其中miR-133a的表達水平下調，提示miR-133a可能通過影響心房結構重構參與了持續性房顫的發生。本研究發現，持續性房顫模型組犬左心房組織miR-29a及miR-133a表達明顯降低，這與既往的研究是一致的，表明它們是與纖維化密切相關的因子之一，在心房纖維化形成中發揮了潛在作用，與房顫的發生及維持密切相關。其表達水平下調后可促進纖維化，可能是通過影響膠原蛋白、纖維蛋白以及彈性蛋白的表達，使其合成增加，調節TGF-β/Smad、CTGF等多條與纖維化相關的信號通路，使致纖維化因子大量釋放共同作用的結果。

MicroRNAs的出現為人們進一步研究房顫的發病機制提供了全新的視角。并且有研究者提出“miRNAs調控失衡致心律失常假說”，心房肌中miRNA表達失衡，可導致心肌結構發生重構，心肌細胞發生電活動紊亂，誘發各種心律失常。該實驗初步探索到miR-29a、-133a可能在心房結構重構過程中發揮重要作用，通過上調或下調其表達水平，抑制纖維化發生，減少房顫的發生與維持時間，為房顫的治療提供了理論依據，但它們具體的作用靶基因及調控機制和藥物研發有待進一步研究。

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