肌鈣蛋白T基因單核苷酸多態性與運動性橫紋肌溶解癥的關聯研究*

白春宏， 薄 海， 秦永生， 彭 朋△

運動性橫紋肌溶解癥(exertional rhabdomyolysis，ERM)是由于不習慣的大強度運動(特別是離心運動)造成肌肉組織崩解、細胞內容物如肌酸激酶(creatine kinase，CK)和肌紅蛋白(myoglobin，Mb)釋放入血循環、最終引起腎衰竭甚至死亡的綜合征［1］。ERM典型癥狀為黑尿(肌紅蛋白尿)、肌痛、僵硬、無力，并發癥包括急性腎衰、骨筋膜室綜合征、高鉀血癥和酸中毒等［1］。普通健康人安靜時出現具有臨床癥狀ERM的發生率極低，但在大強度運動應激時，不同個體的反應差異很大，特別是合并熱應激和脫水時易出現ERM，其具體機制未明。有研究證實，ERM易感性可能與遺傳因素有關［2］。本研究以武警戰士為研究對象，利用一次大強度負重訓練造成亞臨床(非臨床癥狀)ERM，分析慢肌型肌鈣蛋白T(slow troponin T，sTnT)基因第7內含子C7761T位點與快肌型肌鈣蛋白T(fast troponin T，fTnT)基因第8內含子T7955C位點單核苷酸多態性與大強度訓練后血清CK含量之間的關系，探索ERM的可能遺傳機制。

材料和方法

1 研究對象

武警某部戰士85名，男性，年齡(23.3±1.9)歲，身高(1.73 ±0.04)m，體重(64.3 ±4.4)kg，體重指數(body mass index，BMI)(21.4 ± 1.7)kg/m2。排除安靜血清CK(CKrest)超標(＞200 IU/L)者和肌炎、肌病、中暑、心血管及代謝性疾病患者。實驗前2天禁止進行大強度運動訓練以及肌肉治療和服用藥物(包括營養補劑)。

2 亞臨床ERM實驗模型的建立［3］

利用一次大強度負重訓練造成亞臨床ERM，具體方案:受試者用背囊進行負重，背囊重量為自身體重的30%，先進行5 min臺階試驗(臺階高30 cm，登階頻率每分鐘54步，用節拍器控制節律)，緊接著在1 min內完成15次蹲起，每個動作3 s蹲下(延長離心收縮時間)，2 s站起。

3 取血及血清CK測定

清晨7:00～8:00，受試者空腹狀態下指尖取血20 μL，用酶動力學法測定CKrest活性(A6半自動生化分析儀)，肘靜脈取血3 mL測定外周血白細胞sTnT 和 fTnT基因多態性。實驗后12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h、84 h、96 h、108 h 和 120 h 分別取指尖血20 μL測定血清CK活性的變化規律，記錄峰值CK(CKpeak)值并計算 CK最大變化值(ΔCKmax=CKpeak－CKrest)。

4 PCR-RFLP測定sTnT和fTnT基因多態性

取100 μL全血，利用 DNA提取試劑盒(Tiangen)提取白細胞基因組DNA，－80℃低溫冰箱凍存。取基因組DNA 5 μL，PCR技術擴增目的基因，引物設計和擴增片段長度見表1。反應條件為，預變性:95℃ 5 min;35個循環:95℃ 1 min，64℃ 1 min，72℃30 s;72℃5 min。

sTnT基因擴增片段產物長度為221 bp，經Eco47 I內切酶消化后，出現3種基因型:有Eco47 I酶切位點的純合型C/C為174 bp和47 bp 2條帶，無Eco47 I酶切位點的純合型T/T為221 bp 1條帶，雜合型C/T為221 bp、174 bp和47 bp 3條帶。fTnT基因擴增片段產物長度為287 bp，經TspE I內切酶消化后，出現3種基因型:有TspE I酶切位點的純合型T/T為144 bp和143 bp 2條帶，無TspE I酶切位點的純合型C/C為287 bp 1條帶，雜合型T/C為287 bp、143 bp和144 bp 3條帶。

表1 引物設計Table 1.Primer design

5 統計學處理

采用SPSS 15.0 for Windows統計軟件包分析。卡方檢驗計算基因型頻率是否符合哈-溫遺傳平衡定律。按基因型分組后，組間各指標比較使用單因素方差分析，多重比較使用LSD-t檢驗。數據以均數±標準差(mean±SD)表示。以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 sTnT和fTnT基因的分布頻率與受試者的一般特征

sTnT 3 種基因型(T/T:18.8%;C/T:49.4%;C/C:31.8%)和等位基因(T:43.5%;C:56.5%)，以及fTnT 3 種基因型(T/T:8.2%;T/C:41.2%;C/C:50.6%)和等位基因(T:28.8%;C:71.2%)的分布頻率經卡方檢驗均為P＞0.05，符合哈-溫遺傳平衡定律，具有群體代表性，見表2。受試者年齡、身高、體重、BMI等特征在各組均無顯著差異(均 P＞0.05)，具有可比性，見表3。

表2 sTnT和fTnT基因型及等位基因的分布頻率Table 2.sTnT and fTnT genotypic and allelic distribution frequency

表3 受試者一般特征Table 3.Baseline characteristics of the subjects(Mean±SD)

2 運動訓練前后血清CK的時程變化

血清CKrest為(145±33)IU/L，運動訓練后24 h開始逐漸升高，72 h達峰值［CKpeak:(2 972±1 648)IU/L］，隨后開始逐漸下降，見圖1。

Figure 1.Time course of serum CK activity.Mean ± SD.n=85.＊＊P ＜0.01 vs rest(0 h).圖1 血清CK活性的時程變化

3 不同基因型間血清CK活性的比較

sTnT基因:C/T基因型組和C/C基因型組CKrest均高于T/T基因型組(均P＜0.01)，CKpeak和ΔCKmax在各組間無顯著差異(均P＞0.05)。由于T/T基因型組只有16人(18.8%)，為避免統計誤差，將T/T基因型組與C/T基因型組合并為(T/T+C/T)基因型組，即T等位基因組(對fTnT的基因型進行相同的處理)，結果發現，(T/T+C/T)組 CKrest低于C/C基因型組(P ＜0.05)，見表3。

fTnT基因:T/C基因型組和C/C基因型組CKrest均低于 T/T基因型組(分別為 P＜0.05和 P＜0.01)，C/C基因型組CKpeak和ΔCKmax均低于T/T基因型組和T/C基因型組(均P＜0.01)。T等位基因組(即T/T+T/C組)CKpeak和 ΔCKmax均高于C/C基因型組(均 P ＜0.01)，見表4。

討 論

ERM易發于士兵和運動員人群，其最危險的并發癥是由于循環Mb進入腎臟造成的急性腎衰竭，特別是在熱環境和脫水的情況下更容易發生。通常，反復的離心運動會造成肌細胞機械或化學應激損傷［4］，進而導致 ERM。CK 是肌肉崩解的標志物［5］，但不同個體對于大強度運動(特別是離心運動)的反應大相徑庭，有報道血清CK可達到38 517 IU/L(正常值40～170 IU/L)。本研究的受試者CKrest均在正常范圍內，但大強度訓練后，CKpeak為(2 972±1 648)IU/L，237 ～ 7 405 IU/L，ΔCKmax則為 (2 826 ±1 649)IU/L，102 ～7 269 IU/L，即不同受試者對相同運動負荷存在顯著個體差異，其具體機制未明。

表4 不同基因型間血清CK活性的比較Table 4.Comparison of serum CK activity between different genotype groups(IU/L.Mean±SD)

在排除體格、身體素質等因素后，越來越多的研究證實了遺傳基因在ERM發生中的作用，但關鍵基因仍未明確。既往研究證實，胰島素樣生長因子-II［6］、肌酸激酶骨骼肌型［3，7］、白細胞介素 6［8］、腫瘤壞死因子 α［8］、趨化因子配體與受體［9］、α-輔肌動蛋白 3［10］、肌球蛋白輕鏈激酶［10］等多個基因變異與ERM易感性相關聯。這些研究分別從肌肉代謝因子(酶)、炎癥反應、收縮蛋白等方面探討了相關基因多態與肌肉損傷的關系。本研究以武警戰士為受試對象并參照文獻［3］建立亞臨床ERM實驗模型(即血清CK升高，但不伴有臨床癥狀)，從肌肉收縮鈣調控的角度探討sTnT和fTnT基因多態與ERM的關系。

ERM發生的重要機制是細胞能量代謝障礙并導致胞漿內鈣離子的異常升高，細胞內鈣依賴性蛋白酶及磷脂酶被激活，造成肌原纖維、細胞骨架及胞膜蛋白破壞［11-12］。丹曲林鈉(骨骼肌松弛劑)可阻滯肌漿網鈣釋放，對過度運動性肌損傷具有顯著的保護作用［13］。骨骼肌收縮時胞內鈣離子調控蛋白包括肌集鈣蛋白1、蘭尼堿受體1、L型鈣通道以及肌鈣蛋白等［14］。TnT是肌鈣蛋白復合體(由 TnT、TnI和 TnC構成)的一個亞基。TnT將肌鈣蛋白復合體維系在細肌絲上，在骨骼肌細肌絲的Ca2+調控系統中處于核心位置。在沒有TnT的情況下，無論是否存在Ca2+，肌肉同樣可以被激活產生收縮。因此，TnT是在靜息電位時抑制肌肉收縮不可缺少的組分，它可以將TnI和TnC不依賴于Ca2+的活性功能整合為依賴Ca2+的活性功能。人類的TnT有3種同源蛋白:sTnT、fTnT和心肌型TnT(cTnT)，分別在骨骼肌慢肌、快肌和心肌中特異性表達。研究證實，血清TnT水平是診斷運動性損傷的特異標志物，TnT相關基因多態與運動能力［15］可能也存在關聯。因此我們推測，sTnT與fTnT基因多態可能與ERM易感性有關。

本研究發現，fTnT基因T/C基因型組和C/C基因型組CKrest均低于T/T基因型組，sTnT基因C/T基因型組和C/C基因型組CKrest則均高于T/T基因型組，T等位基因組CKrest低于C/C基因型組，提示fT-nT基因T/T基因型、sTnT基因C/T和C/C基因型與安靜時CK高反應有關;一次負重訓練后，fTnT基因T等位基因組CKpeak和ΔCKmax均高于C/C基因型組，而sTnT基因CKpeak和ΔCKmax在各基因型組間均無顯著差異，說明fTnT基因T等位基因具有肌肉損傷促進作用，可能是ERM易感性的分子遺傳學標記。其機制在于，劇烈運動(特別是肌肉離心收縮)時，主要是快肌纖維參與工作，fTnT在調節快肌興奮收縮偶聯中起重要作用，T等位基因(T/C+T/T)變異改變了相應蛋白質的功能，造成其對Ca2+敏感性增強，進而影響了肌肉收縮的效率，肌肉損傷和ERM易感性隨之增加。

本研究證明fTnT基因第8內含子T7955C位點單核苷酸多態性可作為ERM易感性的分子遺傳學標志，T等位基因攜帶者是患ERM的高危人群。

本研究的結果提示某些基因型或等位基因具有肌肉損傷保護或促進作用。攜帶fTnT基因第8內含子T7955C位點T等位基因的個體在運動應激后血清CK會大大升高，是患ERM和急性腎衰竭的高危人群。今后的研究應繼續尋找ERM易感基因，從分子水平揭示CK高反應機制，為軍事訓練提供個性化監控指標——基因標志，同時對于篩查易感人群、及早發現運動損傷危險因素和預防ERM發生具有重要的理論和實踐意義。

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