60Co-γ射線輻照協同氫氧化鈉預處理對油菜秸桿酶解產糖的影響＊

張春艷，譚興和，* ，蘇小軍，胡秋龍，王克勤，王 鋒，熊興耀

(1.湖南農業大學食品科技學院，湖南長沙 410006;2.食品科學與生物技術湖南省重點實驗室，湖南長沙 410128;3.湖南省作物種質創新與資源利用重點實驗室，湖南 長沙 410128;4.湖南農科院核農學與航天育種研究所，湖南 長沙 410125)

農作物秸稈等木質纖維素原料是地球上最豐富的可再生能源之一。我國是農業大國，每年大量的植物秸稈，如:油菜秸稈、稻草、玉米秸稈、麥秸稈等被丟棄或者焚燒，這樣既造成資源浪費，又污染環境［1］。近年來，利用這些木質纖維素原料生產燃料乙醇得到了科研工作者的高度關注。但面臨的最大難題是如何通過各種預處理方法有效改變原料結構以提高水解效率。因為木質纖維素原料主要由纖維素、半纖維素和木質素三大組分所組成，纖維素不僅被半纖維素和木質素所包裹，且其本身也存在著高度結晶性使酶制劑很難與纖維素接觸［2，3］，因此，必須借助化學和物理的方法進行預處理，破壞木質纖維素之間的連接，降低纖維素的結晶度，脫去木質素，增加纖維素酶系與纖維素的接觸面積，從而提高酶效率［4，5］。

不同預處理方法可以有效提高木質纖維素原料的酶解率，如傳統的酸水解、堿水解、蒸汽爆破、高壓液態水、機械粉碎、微生物降解等方法對提高后續的酶解產糖和發酵都取得了很好的效果，但都或多或少存在一定的局限性［6-9］。γ射線輻照預處理是一種物理處理法，不需要高溫高壓等極端條件，副產物少，污染少，能夠有效提高酶解效率。輻照可使木質纖維素原料分子內形成自由基，自由基又通過一定的反應來誘發木質纖維素的降解，輻照還可降低纖維素聚合度，增加纖維素的活性，改變分子量的分布特性，使其分子量分布比普通纖維素更集中;還可以使纖維素的結構松散，破壞纖維素的晶體結構，從而使纖維素可及度提高，酶解率提高［10-12］。有研究報道，γ射線輻照處理稻草、稻殼、麥稈、玉米桿、木屑等原料可有效提高酶的可及度，從而提高酶解產糖率［13］。氫氧化鈉溶液的浸泡處理可以增加原料的潤脹性，增加可及表面積，降低結晶度，打斷木質素與碳水化合物之間的連接，破壞木質素的結構以促進其降解［14］。

本文通過輻照協同氫氧化鈉預處理油菜秸稈，研究兩者協同處理對酶解產糖的影響。通過響應面優化設計三因素五水平實驗，考察了輻照與氫氧化鈉處理的相互關系及對酶解產糖的影響，并得出最優化條件，為油菜秸稈的酶解產糖提供一定的實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

油菜秸稈采自湖南農業大學油料作物研究所試驗基地。秸稈采回后清洗烘干(60℃，5 d)，粉碎過40目篩。

纖維素酶購自無錫雪梅酶制劑科技有限公司，檸檬酸、檸檬酸鈉、氫氧化鈉、3，5-二硝基水楊酸等均為分析純試劑。

UV7200可見分光光度計，上海元析儀器有限公司;恒溫振蕩器，杭州艾普儀器設備有限公司;臺式高速冷凍離心機，上海力申科學儀器有限公司;XS型中藥粉碎機，廣州華凱機電設備有限公司;DHG-9423A型電熱恒溫鼓風干燥箱，上海精宏實驗設備有限公司;數顯恒溫水浴鍋，常州中捷實驗儀器公司;JSM-6380LV型掃描電鏡，日本電子株式會社。

1.2 方法

1.2.1 輻照 取一定量的油菜秸稈粉末裝入500mL廣口瓶中，輻照劑量為400 kGy，劑量率為2.0 kGy/h，在自然室溫條件下照射，處理后的樣品在常溫條件下貯藏備用，輻照處理在湖南省原子能農業應用研究所進行，輻射鈷源強度為9.99×1015Bq，輻照后樣品裝于黑色塑料袋中室溫保存，待用。

1.2.2 氫氧化鈉處理 取一定量經400 kGy輻照后的樣品于150mL三角瓶中，以1∶10的固液比，分別于0.25% ～5.25%濃度的氫氧化鈉溶液中，20～100℃溫度下反應0.5～5.5 h時間，反應結束后調節pH值至中性，過濾，洗滌并收集殘渣，60℃烘干24 h，4℃冰箱保存，待酶解。

1.2.3 實驗設計與數據分析 利用響應面(RSM，Design-Expert8.05b)軟件設計三因素五水平實驗，進一步對實驗參數進行優化，采用中心旋轉組合設計方案，共20組實驗。因素水平見表1。

1.2.4 酶解 取一定量上述氫氧化鈉溶液處理后的殘渣于150mL三角瓶中，以1∶30的固液比加入0.05 mol/L，PH4.8 的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，纖維素酶加入量為250 IU/g，于恒溫振蕩器中50℃，150 r/min酶解96 h，離心取上清液，稀釋至一定倍數，測定還原糖含量。

1.2.5 測定方法 還原糖含量測定采用3，5-二硝基水楊酸法(DNS法)［15］;樣品表面形態采用掃描電鏡觀察。

表1 響應面試驗因素水平表Tab.1 Factorsand theirlevelsforresponse surface analysis

2 結果與分析

2.1 響應曲面法試驗設計及結果

響應面法在生物與化學處理中常被廣泛地利用來優化各種復雜的工藝參數。能以較少的試驗次數完成全面的分析研究，評價各因素的影響及交互作用，并快速確定最優條件。通過輻照協同氫氧化鈉預處理后酶解油菜秸稈，為了得到較高產量的還原糖，采用響應面法，根據中心旋轉組合設計原理，本實驗以酶解還原糖含量Y為響應值，對輻照后的樣品氫氧化鈉處理條件進行優化，包括不同的氫氧化鈉濃度、不同處理溫度和不同處理時間。氫氧化鈉處理條件和結果如表2所示。對表2數據進行回歸擬合，建立數學模型方程:

2.2 模型的顯著性檢驗

酶解總還原糖含量的預測值與實際實驗值擬合情況見圖1，顯示預測值和實驗值擬合良好。該模型回歸顯著(P＜0.0001)，失擬項不顯著，該模型決定系數(R2)為 0.9454，校正系數(R2Adj)為 0.8963(表3)，說明此模型擬合良好，自變量與響應值之間線性關系顯著，試驗誤差小，可以用此模型來分析和預測輻照協同氫氧化鈉處理對油菜秸稈酶解產還原糖的結果。由此可以認為以上提出的二次回歸方程模型是合適的，可充分地反映各變量之間的關系。

表2 中心旋轉組合設計及響應值Tab.2 Design of central composite and the results of Y

圖1 總還原糖含量的預測值和實際值的對應關系Fig.1 Plot of model-predicted values against experimental values of the total reducing sugar

通過表3數據可以看出，在本實驗設定的區域范圍內，A、B、AC、A2項對酶解還原糖含量有顯著影響，其他因素影響不顯著。即氫氧化鈉濃度、反應溫度、氫氧化鈉濃度與反應時間的交互作用(它們的“Prob ＞ F”值分別為 ＜0.0001、0.0006、0.0491)對酶解還原糖含量影響顯著，各因素對酶解產糖的影響從大到小依次為氫氧化鈉濃度＞反應溫度＞反應時間。

表3 回歸與方差分析結果Tab.3 Analysis of variance of quadratic polynomial model

2.3 響應面交互作用分析

氫氧化鈉濃度與反應時間對酶解還原糖含量的交互影響如圖2所示。氫氧化鈉與反應時間之間的交互作用顯著，兩者對后續酶解產還原糖的影響較大。

當氫氧化鈉濃度在較低水平時，時間的響應拋物曲線的最高點處于較低水平，隨著氫氧化鈉濃度的增大，時間的響應拋物曲線的最高點向高水平方向移動。響應面的響應值在氫氧化鈉濃度3%～4%，反應時間3.75～4.25小時范圍內較高。說明氫氧化鈉濃度(A)和反應時間(C)交互效應顯著，這與方差分析的結果吻合。

反應溫度與反應時間對酶解還原糖含量的交互影響如圖3所示。當溫度較低時，時間的響應拋物曲線的最高點也處在較低水平，而隨著溫度升高，時間的響應面拋物曲線的最高點向高水平方向移動。

當溫度70～80℃，反應時間在2.25 h內，響應面的響應值較高。由于反應時間對酶解還原糖含量影響不大，且時間過長，影響效率，因此可選擇較短時間內氫氧化鈉處理。

圖2 氫氧化鈉濃度與反應時間對還原糖含量的交互影響Fig.2 Response surface of the effect of NaOH concentration and reaction time on total reducing sugar

圖3 反應溫度與反應時間對還原糖含量的交互影響Fig.3 Response surface of the effect of reaction temperature and reaction time on total reducing sugar

氫氧化鈉濃度與反應溫度對還原糖含量的交互影響如圖4所示。在設定溫度范圍內，還原糖含量都是隨著氫氧化鈉濃度的增加而呈現明顯上升趨勢。隨著反應溫度的增加，還原糖含量也呈現緩慢上升趨勢，只是稍顯平緩。

當氫氧化鈉濃度在低水平時，溫度的響應面拋物曲線的最高點也出于較低水平，隨著氫氧化鈉濃度增大，溫度的響應面拋物曲線的最高點向高水平方向移動。響應面的響應值在溫度60～70℃，氫氧化鈉濃度3%～4%范圍內較高。

2.4 最優條件預測及模型驗證

根據響應面試驗結果和回歸方程，利用Design-Expert軟件預測的最優條件，還原糖含量最高值為524.93 mg/g，此時3個因素的取值為:氫氧化鈉濃度為2.38%，反應溫度為100℃，反應時間為0.5 h。

圖4 反應溫度與氫氧化鈉濃度對還原糖含量的交互影響Fig.4 Response surface of the effect of reaction temperature and NaOH concentration on total reducing sugar

為了檢驗模型預測的準確性，輻照后的油菜秸稈粉末，在最佳堿解條件下，實際測得酶解總還原糖含量為528.51 mg/g。實測值與預測值相近，可見該模型可用于分析和預測輻照協同氫氧化鈉處理對油菜秸稈酶解產還原糖的結果。

2.5 SEM觀察輻照協同氫氧化鈉處理的油菜秸稈結構

掃描電鏡觀察輻照前后及輻照協同氫氧化鈉處理后的油菜秸稈粉末如圖5所示，未經輻照處理的油菜桿，其表面光滑，但有不規則的條狀凸起，除機械破損的痕跡外，無其他明顯特征性狀，經400 kGy輻照的油菜，其表面變得不平整，出現明顯的條狀裂縫，細胞壁結構破損，出現大量小面積碎片和深溝，甚至部分蜂窩狀小孔洞。說明輻照使油菜秸稈表面結構受到破壞，可及表面積增加，從而提高了纖維素酶的可及度和酶解效率。而經400 kGy輻照協同一定條件下的氫氧化鈉處理后的油菜，表面出現的條狀裂縫變得更細，小面積碎片和深溝更多，蜂窩狀空洞結構也更明顯，說明輻照后的油菜在氫氧化鈉的潤脹作用下，表面結構破壞更嚴重，可及表面積增加更明顯，因此酶的可及度更大，酶解效率更高。

3 討論

圖5 輻照協同氫氧化鈉處理的油菜秸稈粉末電鏡掃描圖Fig.5 SEM pictures of treated and untreated straw

射線輻照可以有效破壞油菜秸稈表面結構，打斷木質纖維素之間的交聯，增大酶解可及表面積，從而有效提高酶解還原糖產量，在輻照作用下，部分纖維素、半纖維素甚至直接被降解成為小分子糖，使得原料中還原糖含量增加;氫氧化鈉溶液處理可以增加原料的潤脹性，增加可及表面積，打斷木質纖維素素與碳水化合物之間的交聯，有利于纖維素酶進入木質纖維素內部，提高酶解效率。唐洪濤等人研究發現［16］，輻照結合氫氧化鈉溶液浸泡處理，對玉米秸稈酶解效果的影響，認為輻照與氫氧化鈉溶液處理具有很好的協同效果，能夠顯著提高玉米秸稈的產糖率。本研究得到相似結果，即輻照結合氫氧化鈉預處理對油菜秸稈酶解產還原糖協同效應明顯。

利用響應面進行優化，各因素對酶解產糖的影響從大到小依次為氫氧化鈉濃度＞反應溫度＞反應時間;得到最佳堿解條件為:氫氧化鈉濃度為2.38%，反應溫度為100℃，反應時間為0.5 h。試驗驗證的實測值與模型預測值524.93 mg/g相近。掃描電鏡觀察發現，輻照協同氫氧化鈉處理能夠有效破壞油菜秸稈表面結構，出現大量孔洞和深溝結構，從而增大酶的可及表面積，提高酶解效率。

［1］胡代澤.我國農作物秸稈資源的利用現狀與前景［J］.資源開發與市場，2000，16(1):19-20.HU Daize.The utilizing status and prospects of the crop straw resources in China［J］.Resource Development＆ Market，2000，16(1):19-20.

［2］計紅果，龐浩，張容麗，等.木質纖維素的預處理極其酶解［J］.化學通報，2008，(5):329-334.JI Hongguo，PANG Hao，ZHANG Rongli，et al.Pretreatment and enzymatic hydrolysis of lignocellulose ［J］.Chemistry，2008，(5):329-334.

［3］黃忠乾，龍章富，彭衛紅，等.農作物秸稈資源的綜合利用［J］.資源開發與市場，1999，15(1):32-34.HUANG Zhongqian，LONG Zhangfu，PENG Weihong，et al.Studies on the comprehensive utilization for crops straw ［J］.Resource Development＆ Market，1999，15(1):32-34.

［4］BALAT M.Production of bioethanol from lignocellulosic materials via the biochemical pathway:a review ［J］.Energy Convers Manag，2011，52(2):858-875.

［5］SILVERSTEIN R A，CHEN Y，SHARMA-SHIVAPPA R R，et al.A comparison of chemical pretreatment methods for improving sacchari?cation of cotton stalks［J］.Bioresour Technol，2007，98(16):3000-3011.

［6］WANG K，XIONG X，CHEN J，et al.Comparison of gamma irradiation and steam explosion pretreatment for ethanol production from agricultural residues［J］.Biomass and Bioenergy，2012，46:301-308.

［7］楊崎峰，王雙飛，黃崇杏，等.蒸汽爆破蔗渣漿的微觀研究［J］.中國造紙學報，2005，20(2):27-30.YANG Qifeng，WANG Shuangfei，HUANG Chongxing.Microlevel study of explosion pulp of bagasse［J］.Transactions of China Pulp and Paper，2005，20(2):27-30.

［8］TARKOV H，FEIST W C.A mechanism for improving the digestibility of lignocellulosic materials with dilute alkali and liquid ammonia［J］.Adv Chem，1969，95(1):197-218.

［9］CAZETTA M L，CELLIGOI M A P C，BUZATO J B，et al.Fermentation of molasses by Zymomonas mobilis:effects of temperature and sugar concentration on ethanol production ［J］.Bioresource Technology，2007，98(15):2824-2828.

［10］KHAN F，AHMAD S R，KRONFLI E.Gamma-radiation induced changes in the physical and chemical properties of lignocellulose［J］.Biomacromolecules，2006，7(8):2303-2309.

［11］TAKáCS E，WOJNáROVITS L，BORSA J，et al.Effect of γirradiation on cotton-cellulose［J］.Radiation Physics and Chemistry，1999，55(5-6):663-666.

［12］KUMAKURA M，KAETSU I.Radiation-induced degradation and subsequent hydrolysis of waste cellulose materials［J］.The International Journal of Applied Radiation and Isotopes，1979，30(3):139-141.

［13］KUMAKURA M，KAETSU I.Radiation-induced decomposition and enzymatic hydrolysis of cellulose ［J］.Biotechnology and Bioengineering，1978，20(8):1309-1315.

［14］FANG L T，GHARPURAY M M，LEE Y H.Cellulose hydrolysis biotechnology monographs［M］.Springer，Berlin，1987.

［15］范玲，閆建慶，鄭春霞，等.3，5-二硝基水楊酸(DNS)比色法在分析棉花纖維還原糖含量中的應用研究［J］.棉花學報，1996，8(3):151-154.FAN Ling，YAN Jianqing，ZHEN Chunxia，et al.Research on applying 3，5-dinitrosalicylic acid method to analysing the content of cotton reducing sugar［J］.Acta Gossypii Sinica，1996，8(3):151-154.

［16］唐洪濤，王鋒，李偉明，等.γ射線輻照與NaOH溶液協同預處理對玉米秸稈酶解產糖率及微觀結構的影響［J］.核農學報，2012，26(3):535-542.TAO Hongtao，WANG Feng，LI Weiming，et al.Effect of γrays irradiation and alkali solution pretreatment on hydrolyzing enzyme and microcosmic structure of corn straw ［J］.Journal of Nuclear Agricultural Sciences，2012，26(3):535-542.