印染廢水中活的但非可培養(yǎng)狀態(tài)細菌的發(fā)現(xiàn)

金夷　胡佳丹　張麗　楊娜　馬英川　梅榮武　韋彥斐　陳建榮　王慧榮　王方園　李明智　吳冬梅　徐鴻　徐龍乾　沈佳琪　吳霞

摘 要：【目的】探明印染廢水生物反應器中活的非可培養(yǎng)（viable but non-culturable，VBNC）細菌及其系統(tǒng)關系。【方法】利用土質(zhì)濾材構建生物反應器，基于復蘇促進因子（resuscitation promoting factor，Rpf） 對VBNC細菌的復蘇刺激生長作用，采用最大可能數(shù)法（most probable number，MPN）及其MPN培養(yǎng)系判斷樣品中的細菌總數(shù)，稀釋平板法分離其中復蘇可培養(yǎng)化的VBNC菌株，解析16S rRNA基因系統(tǒng)關系。【結果】（1）MPN培養(yǎng)系中，處理組MPN值對應的細菌總數(shù)為9.3×106～2.4×108，大于對照組MPN值對應的細菌總數(shù)4.3×106～9.3×106，表明添加Rpf后可培養(yǎng)化細菌總數(shù)最高從每g樣品的7.5×106提高到2.4×108；（2）添加Rpf可使樣品中細菌分離豐度提高2.2～32倍，表明印染廢水生物反應器中存在對Rpf敏感、復蘇可培養(yǎng)化的VBNC優(yōu)勢菌群；（3）MPN培養(yǎng)系中處理組稀釋段培養(yǎng)液的OD660值大于對照組的OD660值，表明Rpf對部分細菌菌種有生長刺激作用。【結論】利用復蘇促進因子Rpf，探明了印染廢水生物反應器中存在對Rpf敏感的VBNC菌種，包括放線菌、革蘭氏陽性以及革蘭氏陰性菌。本研究結果揭示了印染廢水中存在大量活的但非可培養(yǎng)狀態(tài)細菌，這將為其形成機理、復蘇活性化機制以及印染廢水深度處理工程工藝改進等方面的深入研究提供重要的思路與方法。

關鍵詞：印染廢水 生物反應器 VBNC菌 Rpf 16S rRNA基因序列系統(tǒng)關系

中圖分類號：X703 文獻標識碼：A 文章編號：1674-098X（2014）07（b）-0103-02

全球每年都會排放大量的印染廢水，因其成分復雜，堿度、有機物含量、色度以及化學需氧量高，生化降解性相對較低，排放量大、水質(zhì)變動范圍廣，屬難處理的工業(yè)廢水。大量難降解染料的過量使用及排放已造成嚴重的環(huán)境污染，某些毒性物質(zhì)對人類健康構成嚴重威脅，印染廢水的深度處理已經(jīng)引起社會廣泛關注，而其中高效微生物處理技術的開發(fā)已經(jīng)成為行業(yè)令人矚目的研究熱點。

利用傳統(tǒng)的純培養(yǎng)技術從土壤、活性污泥、海水、湖水、沉淀物以及城市污水處理系統(tǒng)等環(huán)境中能分離培養(yǎng)的微生物只占總數(shù)的0.01%～10%，其他的為未培養(yǎng)（uncultivated microorganisms） 或為活的但非可培養(yǎng)（viable but nonculturable， VBNC），表明多種生態(tài)環(huán)境中絕大部分微生物尚處于未知狀態(tài)。

自從1982年Xu等人首次在環(huán)境中發(fā)現(xiàn)生存但不可培養(yǎng)的霍亂弧菌和大腸桿菌后，至今國內(nèi)外已有大量文獻報道了VBNC菌的相關內(nèi)容。細菌由于多種因素導致進入VBNC狀態(tài)，該類微生物在不良環(huán)境條件下具有生物活性，用常規(guī)培養(yǎng)法無法檢出，但在一定條件下可以復蘇并保存原有功能的一種特殊生理狀態(tài)。盡管VBNC菌處于低代謝狀態(tài)，但1998年Mukamolova等報道了藤黃微球菌 Micrococcus luteus在對數(shù)期后期分泌的一種蛋白質(zhì)能使該菌以及近緣的分枝桿菌Mycobacterium屬的一些處于VBNC狀態(tài)的細胞復蘇成為可培養(yǎng)化，這種蛋白質(zhì)被命名為復蘇促進因子Rpf（resuscitation promoting factor）。已有研究表明Rpf能復蘇刺激大量革蘭氏陽性菌的生長，包括Mycobacterium， Rhodococcus，Arthrobacter， Leifsonia，Bacillus， Nocardia， Kitasatospora，Streptomyces 和Paenibacillus屬的細菌。丁等研究表明Rpf對難培養(yǎng)微好氧貧營養(yǎng)革蘭氏陰性菌Curvibacter fontanus具有良好的促進生長的功能。

該文介紹利用復蘇促進因子Rpf蛋白信號分子對VBNC細菌的復蘇刺激生長作用，在設計的MPN培養(yǎng)系中，通過計數(shù)MPN值換算獲得樣品細菌總數(shù)，驗證Rpf對VBNC菌種的復蘇促進作用，從印染廢水處理系統(tǒng)中分離處于VBNC狀態(tài)菌群、解析其組成與16S rRNA基因系統(tǒng)進化關系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 Rpf的制備

實驗菌種藤黃微球菌Micrococcus luteus IAM 14879（=NCIMB 13267）由東京大學分子細胞生物學研究所國際菌種保藏中心提供。依據(jù)介紹的方法制備M. luteus的DNA，確定rpf基因引物進行PCR 擴增，利用pET15b質(zhì)粒載體并轉化大腸桿菌DE3 表達，以SDS-PAGE 檢驗獲取純化重組蛋白。rpf基因陽性菌（MpET15brpf-P）在LB培養(yǎng)基（Tryptone 10 g/L，Yeast extract 5 g/L， NaCl 10 g/L）、37 ℃、120/rpm條件下培養(yǎng)，以IPTG最佳條件誘導獲得高表達Rpf蛋白，再以SDS-PAGE 檢驗確證標的蛋白。將培養(yǎng)液離心經(jīng)0.22 μm膜過濾，保存在-20 ℃作為含Rpf的實驗處理組添加材料。同時以rpf基因陰性菌（MpET15brpf-N）相同方法進行培養(yǎng)、離心和過濾的培養(yǎng)液作為不含Rpf的實驗對照組添加材料。

1.1.2 樣品及處理

利用特殊土質(zhì)過濾材料構建連續(xù)流生物反應器。印染廢水為浙江某印染廢水處理廠經(jīng)處理后的，經(jīng)生物反應器（串聯(lián)多塔式）連續(xù)流運行61 d、83 d和366 d，分別從生物反應器最初出水段三點取樣共取3g土（折算為干重）至滅菌的100 mL錐形瓶中，加入27 mL滅菌蒸餾水攪拌20 min均勻做成懸液待用。實驗重復三次。

1.1.3 培養(yǎng)基

MPN培養(yǎng)系中液體培養(yǎng)基組成：蛋白胨5.0 g，酵母膏0.5 g，葡萄糖5.0 vg，NaCl 2.5 g，苯乙醇（分析純）3.0 mL，去離子水1000 mL，pH調(diào)至 7.0。稀釋平板分離用固體培養(yǎng)基為加瓊脂20.0 g /L。實驗所用培養(yǎng)基均經(jīng)121 ℃、15 min高壓滅菌鍋滅菌后使用。endprint

1.1.4 主要試劑及儀器

SK1201-UNIQ-10柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒，UNIQ-10 DNA膠回收試劑盒，16S rRNA基因PCR擴增所用酶、引物和試劑均購于上海生工公司；PCR反應擴增儀（TP600日本Takara公司），凝膠成像系統(tǒng)（121409美國UVP公司），酶標儀（1510美國Thermo公司）。

1.2 方法

1.2.1 MPN法和MPN培養(yǎng)系

本實驗利用MPN法和MPN培養(yǎng)系計數(shù)樣品可培養(yǎng)細菌總數(shù)。以2.5～5 mL透明玻璃瓶作為培養(yǎng)容器，添加1%（v/v，用量確定實驗數(shù)據(jù)未顯示）含Rpf制備液至液體培養(yǎng)基中作為處理組，以添加等量不含Rpf制備液作為對照組，將以10%（v/v） 的樣品懸液（在前項1.1.2所述），以十倍濃度梯度稀釋到10-8，每組重復3次，30℃靜置培養(yǎng)。根據(jù)培養(yǎng)時間測定處理組與對照組吸光值的變化（OD 660nm），并以OD660值以及肉眼判斷，記錄處理組與對照組培養(yǎng)液的混濁情況，渾濁為陽性，不渾濁為陰性。利用MPN表查出MPN值對應的處理組與對照組中的細菌總數(shù)。

1.2.2 Rpf復蘇效果與VBNC狀態(tài)菌的判斷

本實驗中以處理組與對照組MPN值分別對應的細菌總數(shù)之比作為Rpf復蘇效果，基于Rpf效果確定復蘇可培養(yǎng)化的VBNC以及促進生長作用的細菌。當復蘇效果大于5（95%置信度），處理組的最前方某稀釋段培養(yǎng)液渾濁（陽性），而對照組與之相同稀釋段為不渾濁（陰性）時，處理組渾濁培養(yǎng)液經(jīng)稀釋平板分離，純化所得的菌為單位樣品中總數(shù)處于優(yōu)勢的VBNC狀態(tài)菌。

1.2.3 菌株分離純化與保存

經(jīng)3～14 d靜置培養(yǎng)并視MPN值趨于穩(wěn)定情況，將處理組與對照組中最先端呈渾濁的培養(yǎng)液稀釋，利用平板分離法篩選、純化獲得相應的可培養(yǎng)化的細菌菌種。將純化的細菌擴大培養(yǎng)用于細菌鑒定，以及添加10%的甘油做成冷凍甘油管在-80 ℃保存。

2 結果

2.1 MPN培養(yǎng)系中MPN值與樣品細菌總數(shù)

從印染廢水連續(xù)流生物反應器中共取樣3次，在MPN培養(yǎng)系中處理組與對照組的MPN值與每g樣品中的細菌總數(shù)分別是2.4×107、2.4×108 、9.3×106和9.3×106、7.5×106 、4.3×106。表明基于添加Rpf后，從單位樣品中檢出的可培養(yǎng)細菌總數(shù)分別提高了62.0%、97.0%和54.0%，換言之，樣品中至少分別有62.0%、97.0%和54.0%的細胞原來處于VBNC狀態(tài)，表明利用一般培養(yǎng)基能被分離的細菌不到半數(shù)，甚至只有3%。證實印染廢水生物反應器中存在一般培養(yǎng)基不能檢出、添加Rpf后能復蘇生長成為可培養(yǎng)化的VBNC狀態(tài)細菌。

2.2 Rpf復蘇效果及其培養(yǎng)液OD660值的變化

實驗中我們定義了處理組可培養(yǎng)細菌總數(shù)除以對照組可培養(yǎng)細菌總數(shù)，表示Rpf復蘇效果。實驗結果看，不同運行時間段取樣分析的Rpf復蘇效果分別為2.6、32和2.2，表明印染廢水生物反應器中，取樣點單位樣品中存在對Rpf敏感的VBNC優(yōu)勢菌群，同時量化的2.6、32和2.2為Rpf實際復蘇效果。

2.3 分離菌株的16S rRNA基因序列同源性與系統(tǒng)樹

分離純化菌種經(jīng)PCR擴增，擴增產(chǎn)物送上海生工生物有限公司測序，所得菌株16S rRNA基因序列結果在國際基因庫DDBJ登錄取得菌株登錄號碼。本實驗研究分離的菌株為該基因庫首次向世界公布的利用Rpf在MPN培養(yǎng)系中分離取得的VBNC菌。如YRJ6菌株的近緣菌種Moraxella osloensis，登錄網(wǎng)址：http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AB847896/，/isolation_source =“printing and dyeing wastewater”。資料顯示該菌種為從印染廢水中基于Rpf和MPN培養(yǎng)系分離取得的VBNC菌。

3 討論

本實驗研究利用復蘇促進因子Rpf，在MPN培養(yǎng)體系中，添加Rpf后單位樣品中處理組比對照組檢出的細菌總數(shù)增加了54.0%～97.0%，證實了印染廢水中存在著大量處于VBNC狀態(tài)的細菌。Rpf有效復蘇效果為2.2～32，表明印染廢水生物反應器中存在對Rpf敏感的VBNC優(yōu)勢菌群。處理組培養(yǎng)液的OD660值均大于對照組，表明Rpf對處理組中的細菌具有明顯的生長刺激作用。通過稀釋平板分離后，從處理組中分離到較多的菌株表現(xiàn)出更高的多樣性，其中YDWLR1， YDWLR2， YDWLR6， YDWHR2， YDWLR5， YRJ1和YRJ6菌株，單位樣品中可培養(yǎng)細菌總數(shù)達到106～108數(shù)量級，它們分別是Tepidimonas， Cupriavidus， Gordonia， Staphylococcus， Bucillus， Moraxella， Ochrobactrum和 Enhydrobacter屬的近緣菌種，而在對照組培養(yǎng)液中，細菌總數(shù)106～108同等數(shù)量級中，則沒有發(fā)現(xiàn)這些菌種。因而這些細菌可視為經(jīng)Rpf復蘇生長促進作用成為可培養(yǎng)化的VBNC細菌。實驗結果發(fā)現(xiàn)Bucillus屬的處于VBNC狀態(tài)細菌在印染廢水中出現(xiàn)概率較高，占分離菌株的48%。同時也發(fā)現(xiàn)了該屬細菌中雖不處于VBNC狀態(tài)，但Rpf對其具有明顯的生長促進作用的菌種。

參考文獻

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