α—突觸核蛋白在常見神經(jīng)退行性疾病致病機理研究進展

鄶子昱

摘要 目前研究表明，α-突觸核蛋白功能異常會導致路易小體疾病，以及體的產(chǎn)生。路易小體的產(chǎn)生，被認為是帕金森病（Parkinson disease， PD）的主要病因，而路易小體相關(guān)軸退變被認為是阿爾茲海默病（Alzheimers disease， AD）的病理之一。認識突觸核蛋白在PD和AD中致病機理才能找到有效的治病方法。突觸核蛋白與Aβ蛋白存在緊密關(guān)系，在未來通過識別兩種蛋白的抗體對PD和AD進行治療，效果可能會更好。

關(guān)鍵詞 α-突觸核蛋白 帕金森病 阿爾茲海默病 抗體治療

α-突觸核蛋白（α-synuclein，α-syn）是第4號染色體q21.3～q22基因編碼的高度保守小分子蛋白質(zhì)，由140個氨基酸組成，正常生理狀態(tài)下為可溶性天然隨機螺旋（非折疊或無序）構(gòu)象，缺乏二級或三級構(gòu)象。α-syn一級結(jié)構(gòu)包括3結(jié)構(gòu)域：N端區(qū)、NAC區(qū)和C端區(qū)。①N端區(qū)（1～60）由11個氨基酸殘基構(gòu)成7個不完全重復序列XKTKEGVXXXX（X是任意氨基酸）組成，該區(qū)易形成兩親性α螺旋，可與脂質(zhì)與磷脂相結(jié)合，在α-syn異常聚集中起重要作用。②NAC區(qū)（61～95）：β淀粉樣蛋（Aβ）蛋白樣成分，是α-syn自我聚積的關(guān)鍵區(qū)域，疏水性最強，具有很強的形成β片層結(jié)構(gòu)的趨勢。③C端區(qū)（96～140）：屬于親水部分，富含脯氨酸殘基，具有強酸性和負電荷，在正常狀態(tài)下α-syn保持無規(guī)則卷曲狀態(tài)的重要區(qū)域。突觸核蛋白功能尚不明確，目前研究可能存在參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、突觸的發(fā)育參與調(diào)節(jié)多巴胺的生物合成，影響神經(jīng)傳遞，參與突觸前膜囊泡的產(chǎn)生、轉(zhuǎn)運，調(diào)節(jié)脂質(zhì)的攝取，維護突觸的功能，分子伴侶等功能。其功能異常會導致路易小體疾病（Lewy body disease，LBD），以及體的產(chǎn)生。路易小體的產(chǎn)生，被認為是PD的主要病因，而路易小體相關(guān)軸退變被認為是阿爾茲海默病（Alzheimers disease，AD）的病理之一。

一、α-syn與PD帕金森病（Parkinson disease， PD）又稱震顫麻痹癥，是一種極為常見的神經(jīng)退行病，其發(fā)病率僅次于阿爾茲海默癥。在臨床上表現(xiàn)為一系列運動障礙，如靜止性震顫、肌肉僵直、姿勢反射障礙以及運動遲緩、隨意運動減少、靜止性震顫。此外還存在一些其他運動和非運動障礙。中腦多巴胺能神經(jīng)功能的減退和破壞是發(fā)生PD的主要原因。研究證明，黒質(zhì)與紋狀體存在環(huán)路聯(lián)系。黒質(zhì)中存在大量多巴胺神經(jīng)元，其組成的上行多巴胺投射纖維至紋狀體，主要功能在于抑制紋狀體內(nèi)乙酰膽堿系統(tǒng)的功能。由于PD患者中腦的黒質(zhì)發(fā)生病變，黒質(zhì)合成多巴胺能力降低，導致紋狀體內(nèi)乙酰膽堿遞質(zhì)系統(tǒng)功能亢進。目前普遍認為突觸核蛋白在PD中的致病機理主要有以下三種機制。1.引起線粒體功能障礙通過電子顯微鏡檢測到A53T突變的轉(zhuǎn)基因小鼠在軸突與樹突的線粒體出現(xiàn)膨脹和空泡狀的現(xiàn)象，免疫標記法測定線粒體外膜上的P53蛋白增多，P53蛋白可以通過激活Bax，BCL-2途徑調(diào)節(jié)線粒體膜通透性和細胞凋亡。說明突觸核蛋白在正常生理功能下，可以抑制P53蛋白引起的線粒體凋亡。研究表明低濃度α-突觸核蛋白對線粒體正常運轉(zhuǎn)必不可缺，如果突觸核蛋白形成大于600kDa的沉淀就會產(chǎn)生NADH脫氫酶抑制劑的作用，就會對線粒體造成損傷，損傷包括復雜的功能障礙以及氧化應激壓力增大，同時淀粉樣沉積會改變線粒體膜通透性使細胞色素c流失。細胞色素c與凋亡蛋白激活因子1、caspase9形成復合體，激活caspase9，最終導致細胞死亡。外部和內(nèi)在的信號通路在某些情況下又相互關(guān)聯(lián)。如caspase9通過蛋白水解促進凋亡因子Bid移位于線粒體誘導細胞色素c釋放導致細胞凋亡。利用免疫熒光手段，通過激光掃描共焦顯微鏡檢測了過表達α-syn各片段后與線粒體分布情況。結(jié)果證明，α-synN端能夠與線粒體共定位；JC1染色流式細胞術(shù)檢測結(jié)果提示，該組細胞線粒體存在膜電位降低趨勢。同時被截去N末端的突觸核蛋白不會形成高分子量復合體，也不會影響線粒體功能。2.引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激反應錯誤折疊的蛋白可導致慢性的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激，并觸發(fā)一個未折疊蛋白反應（unfolded protein response， UPR）。在生理狀態(tài)時，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)降解底物一旦從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜轉(zhuǎn)位到細胞質(zhì)，主要依靠泛素蛋白酶體蛋白降解系統(tǒng)（ubiquitin-proteasome system， UPS）進行泛素化、識別、攝入，最終被降解。在細胞出現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)降解底物功能喪失而不能進行上述生物化學過程的代償時，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)降解底物在細胞質(zhì)內(nèi)堆積和聚集，形成非纖維化聚集物。在A53T轉(zhuǎn)基因小鼠模型中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激效應下游產(chǎn)物eIF2α磷酸化程度顯著提高，caspase-12也有顯著提高。而對A53T突變的轉(zhuǎn)基因小鼠使用治療內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的藥物Salubrinal，可以明顯減輕小鼠病情。突觸核蛋白與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的結(jié)合是非特異性的，一小部分突觸核蛋白通常位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)微粒體，當出現(xiàn)衰老或其他因素時突觸核蛋白形成寡聚化，進而形成不溶聚合物。最初可溶性蛋白和低聚物不暴露在細胞溶質(zhì)中，后期由于膜的不穩(wěn)定性使可溶蛋白與寡聚物進入胞質(zhì)。錯誤折疊的蛋白可以降低內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶與UPR受體結(jié)合活性，這也是為什么內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激啟動UPR途徑后仍然會再次啟動細胞凋亡。3.引發(fā)泛素-蛋白酶體系統(tǒng)功能異常突觸核蛋白單體和二聚體通過分子侶伴介導的自噬（chaperone-mediated autophagy， CMA）途徑降解，但寡聚體無法通過CMA途徑降解。氧化和硝基化的突觸核蛋白可以輕微抑制CMA途徑，而磷酸化與多巴胺修飾的突觸核蛋白則可完全抑制該途徑。研究表明異常的蛋白與溶酶體結(jié)合活性增高，但無法被溶酶體內(nèi)吞。有學者認為突觸核蛋白被磷酸化和修飾后，導致構(gòu)像改變，封鎖了溶酶體，使溶酶體攝取與溶解其他蛋白受到干擾，使蛋白降解效率低下。高水平寡聚化突觸核蛋白產(chǎn)生毒素消耗葡糖腦苷脂酶，使溶酶體產(chǎn)生功能障礙，促進自身進一步聚集，并形成正反饋，最終致病性超過閾值。在P12和SH-SY5Y細胞系中，CMA途徑的抑制沒有引起細胞自噬與細胞凋亡。在患者腦部情況不同，細胞自噬體與巨自噬體LC3-I和 LC3-II含量有明顯增高，并導致細胞凋亡。endprint

二、α-syn與AD阿爾茲海默病（Alzheimers disease， AD），又稱認知障礙癥或老年癡呆癥，是由于神經(jīng)元缺失和神經(jīng)炎癥導致的一種神經(jīng)退行性疾病。臨床早期表現(xiàn)主要為患者記憶力的減退和生活自理能力的下降，最終導致發(fā)生進行的認知功能障礙和缺失、神經(jīng)行為異常，出現(xiàn)精神狀況及生活自理能力的完全喪失。其主要病理學特征為腦部出現(xiàn)異常蛋白沉積，主要表現(xiàn)為神經(jīng)元內(nèi)神經(jīng)纖維纏結(jié)（Neurofibirilary tangle， NFT）的沉積和細胞外β淀粉樣蛋白（β-Amyloid， Aβ）的沉積。研究表明雙螺旋纖維主要是由過度磷酸化的Tau蛋白組成。細胞外Aβ主要由于淀粉樣蛋白前體（amyloid precursor protein， APP）經(jīng)蛋白酶水解的產(chǎn)物。Aβ級聯(lián)學說認為由于APP和早老素（Presenilin， PS）基因的突變，產(chǎn)生過多的Aβ或高集聚能力的Aβ1-42在腦組織內(nèi)沉積，對周圍的突觸和神經(jīng)元產(chǎn)生毒性作用，最終引起神經(jīng)元細胞死亡。突觸核蛋白與Aβ，Tau蛋白的毒性作用以及磷酸化都有密不可分的關(guān)系。1.α-syn與Aβ1993年Ueda等在阿爾茨海默病（Alzheimer disease， AD）淀粉樣斑塊中分離到非AB蛋白的成分（nonamyloidβ compound， NAC），后來證實NAC的前體蛋白（nonamyloidβ component precursor， NACP）即為α-syn。1995年Hogyu Han等人體外試驗中發(fā)現(xiàn)，Aβ在NAC存在的情況下，形成淀粉樣纖維速度比自我形成纖維快了近60%。同時發(fā)現(xiàn)Aβ也可以促進NAC形成沉淀。實驗表明，Aβ與α-syn可以互相促進沉淀形成。Masliah E等人用免疫印跡法發(fā)現(xiàn)在AD患者路易小體樣斑塊中存在α-syn。而且確定了α-syn存在于AD患者淀粉樣斑塊的邊緣部分。說明Aβ與α-syn可能共同誘發(fā)了AD。而后的實驗發(fā)現(xiàn)NACP可以結(jié)合Aβl-38和Aβ25-35，而敲去102-131氨基酸的NACP-112也可以與結(jié)合Aβl-38和Aβ25-35。而Aβ25-35可以抑制NACP-112與Aβl-38結(jié)合。實驗數(shù)據(jù)表明，Aβ25-35是與NACP結(jié)合的主要表位。而載脂蛋白E與補體組分C1q被證實可以與Aβl-28結(jié)合。研究表明，Aβ1-42可以增強α-syn對神經(jīng)元的損傷，Aβ寡聚物則可以抑制突觸核蛋白介導的囊泡回收。對與α-syn轉(zhuǎn)基因小鼠對比，α-syn/APP轉(zhuǎn)基因小鼠的海馬體CA3區(qū)最體細胞層的mGluR5與突觸核蛋白表達量有明顯升高，而mGluR5的升高被認為是產(chǎn)生細胞毒的標志之一。研究表明，Aβ的寡聚物可以提高胞內(nèi)鈣離子，蛋白酶1的水平以及突觸核蛋白降解，從而引發(fā)caspase-3介導的細胞凋亡。2.α-syn與tau根據(jù)定量蛋白組學分析，突觸核蛋白與肌動蛋白骨架的許多組分有關(guān)系。突觸核蛋白與微管的結(jié)合可以改變細胞質(zhì)內(nèi)多巴胺的傳輸。而在A30P和A53T突變的小鼠模型中，突觸核蛋白并沒有顯示出微管結(jié)合活性。Leo Chen等證明聚集的突觸核蛋白可以中斷微管的形成，錯誤折疊可以干擾微管組裝而影響軸突運輸。Tau蛋白與突觸核蛋白可以互相促進聚集，通過親和層析發(fā)現(xiàn)突變的突觸核蛋白可以有效誘導tau蛋白聚集以及磷酸化。在A30P突變的轉(zhuǎn)基因小鼠中，突觸核蛋白可以誘導Ser202，Thr205，Ser396，Ser404的磷酸化，并使不可溶的肌氨酸增加25%。而磷酸化的Tau蛋白周圍并沒有大量突觸核蛋白聚集。研究表明，A53T突變蛋白可誘導tau蛋白262和356位氨基酸磷酸化，在A53T突變的患者腦部發(fā)現(xiàn)，突觸核蛋白在Tau蛋白周圍聚集。突變的突觸核蛋白可以使微管蛋白磷酸化導致微管功能異常，引發(fā)JNK細胞凋亡途徑。Tau蛋白的磷酸化調(diào)節(jié)依賴激酶和磷酸酶以及輔助蛋白例如早老素1和突觸核蛋白。突觸核蛋白可以改變蛋白激酶A和 Ser262活性激酶，調(diào)控Tau蛋白的磷酸化。突觸核蛋白也可以通過影響囊泡轉(zhuǎn)運調(diào)控Tau蛋白的胞間運輸運輸有學者認為突觸核蛋白α-syn通過N端兩親性α-螺旋與囊泡脂質(zhì)可逆性的連接，通過出芽或翻轉(zhuǎn)方式來調(diào)節(jié)囊泡的轉(zhuǎn)運。該過程同時受磷酸酶調(diào)節(jié)，磷酸酶D2可以將中性的磷脂酰膽堿轉(zhuǎn)化為酸性磷脂酸，這種改變有利于突觸核蛋白的結(jié)合，同時突觸核蛋可以抑制磷酸酶D2活性。

三、帕金森病與阿爾茲海默病的抗體治療單克隆抗體治療AD時，是使用主動免疫的方法。免疫疫苗AN-1792（人體內(nèi)聚集的Aβ42）的模型小鼠出現(xiàn)淀粉樣斑塊的溶解和認知能力虧損改善。但由于老年人的免疫力降低，部分老人接種后未能夠出現(xiàn)抗體。在Ⅱ期試驗中，多例患者出現(xiàn)了嚴重的中樞神經(jīng)系統(tǒng)非細菌性炎癥，試驗被迫中斷。并且在對AN-1792疫苗長期影響的最新研究發(fā)現(xiàn)，盡管主動免疫后出現(xiàn)了淀粉樣斑塊的清理和高抗Aβ抗體滴度，但沒有證據(jù)顯示延遲疾病進展。王加才等人構(gòu)建含有CpG基元的α-syn核酸疫苗，免疫慢性帕金森模型小鼠。觀察小鼠行為學變化及中腦黑質(zhì)α-syn表達和多巴胺能神經(jīng)元數(shù)目變化，取得良好效果。但在后期實驗中發(fā)現(xiàn)該核酸疫苗在免疫治療時發(fā)現(xiàn)會加重小鼠中腦黑質(zhì)區(qū)炎癥反應。Masliah等用重組人類α-syn（human alpha-synuclein，hα-syn）抗體接種hα-syn轉(zhuǎn)基因PD小鼠，產(chǎn)生了DA神經(jīng)元保護作用。接種后產(chǎn)生高親和力抗體，不僅抗體滴度高，而且可識別α-syn的C末端表位；研究表明中樞神經(jīng)系統(tǒng)循環(huán)的hα-syn抗體可識別與神經(jīng)細胞膜結(jié)合的α-syn聚集體，進而激活溶酶體途徑促進清除異常聚集的α-syn。我們猜想由于突觸核蛋白與Aβ蛋白存在緊密關(guān)系，突觸核蛋白應該存在某種機制抑制或促進Aβ的寡聚化和纖維沉淀，由于突觸核蛋白和Aβ都對神經(jīng)損傷和神經(jīng)元缺失有重要貢獻，而且兩者有結(jié)合位點，可以通過可以識別兩種蛋白的抗體進行治療，效果可能會更好。

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