屏邊野生金線蓮組培快繁技術研究

周 銳，孔 瓊，薛春麗，高維明，普麗波，尹艷玲

（1.開遠市人民政府發展生物產業辦公室，云南開遠661699；2.紅河學院生命科學與技術學院，云南蒙自661199）

金線蓮（Anoectochilus formosanus）是蘭科開唇蘭屬多年生草本植物，主要產于中國、日本、印度等東南亞國家，中國主要分布于福建、廣東、廣西、浙江、云南、貴州等省（區）[1～2]，素有“神藥”、“鳥人參”等美稱，是中國傳統的珍貴藥材，具有降血糖、滋陰降火、消炎止痛、調節內分泌、抗乳腺癌等療效[3～4]。由于其株型小巧，葉型美觀，葉脈金黃呈網狀排列，也是觀賞價值極高的室內觀葉珍品。其生態分布較窄，主要生長于高海拔地區的深山密林下或溪澗旁潮濕的草叢中，呈稀疏、零星分部，很少成片密生；且種子微小呈粉末狀，種胚發育不全，自然繁殖率低，加之人為肆意采挖，野生資源現已瀕臨枯竭，已不能滿足醫藥臨床的需要。

雖然國內外對金線蓮的資源分布、藥用價值、組織培養及其栽培技術等方面已經作了大量的研究[2～10]，為金線蓮的進一步開發利用提供了參考。但在云南省關于金線蓮的組培快繁技術還未成熟，還不太穩定。因此，文章采用云南屏邊野生金線蓮為試材，開展叢生芽誘導增殖培養研究，對提供藥源和種苗具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 供試材料

來源于云南省屏邊縣的野生金線蓮。

1.2 方法

1.2.1 外植體消毒處理

將外植體用洗衣粉溶液浸洗后用自來水沖洗數次，切取長0.5～1.0 cm的莖尖、帶芽眼莖段作為接種材料，放入75%酒精消毒30 s，再用0.1%HgCl2溶液（或加入吐溫-80） 中消毒7～10 min，然后用無菌水清洗5次，置于無菌濾紙上待用。

1.2.2 叢生芽誘導及增殖

將消毒后的接種材料于超凈工作臺上切成0.5～1.0 cm莖尖或帶芽眼莖段（莖節） 接入培養基中，每個配方接種12瓶，每瓶接3個外植體。采用MS、1/2MS為基本培養基，添加不同濃度的植物生長調節劑進行野生金線蓮叢生芽誘導增殖培養配方篩選。誘導階段是基本培養基篩選，其配方為MS+6-BA（0 mg/L、1 mg/L、2 mg/L、3 mg/L、4 mg/L、5 mg/L），1/2MS+6-BA（0 mg/L、1 mg/L、2 mg/L、3 mg/L、4 mg/L、5 mg/L）；增殖階段培養基配方為誘導階段中的最佳培養基，主要是通過不同濃度的植物激素添加，對叢生芽誘導增殖情況進行比較，具體配方見表3。繼代過程為將誘導階段培養出生長良好的無菌苗接種到增殖培養基上進行培養。

1.2.3 壯苗及生根

當增殖苗長至3～4節時，進行壯苗及生根實驗。其基本培養基為1/10MS+NAA 0.5 mg/L+0.05%活性炭[11]，添加香蕉泥、馬鈴薯汁、椰子汁3種天然有機物，觀察其對金線蓮幼苗生長的影響。上述每種培養基均接入無根幼苗10株，重復3次，統計每株凈增加的葉片和發根數。

1.2.4 培養條件

整個試驗過程均采用固體培養基，培養基中含3%蔗糖、0.7%瓊脂，用0.1 M KOH將培養基pH值調為5.5～5.8。培養溫度為25～28℃，光照時數為12 h/d，光照強度為1 000～1 500 Lx。30 d后觀察叢生芽或苗生長情況。

1.2.5 煉苗移栽

選取植株長勢基本一致，有2～4條根的試管苗于溫室內按不同方法進行煉苗。封口方式：瓶苗置于室溫下封口3 d，開蓋6 d（噴水保濕）；松口方式：瓶苗直接開蓋9 d（每3 d噴水保濕1次）。9 d后，取出植株，洗凈培養基，用多菌靈可濕性粉劑800倍液處理 10 min 后植入泥炭∶腐殖土∶珍珠巖=1∶1∶1 配比的基質中，1個月后統計成活率。其試驗條件為遮蔭度50%的溫室，空氣相對濕度保持70%～80%。

2 結果與分析

2.1 不同消毒方法對外植體污染率的影響

針對不同消毒方法處理發現外植體在莖尖和莖節添加吐溫比不加吐溫時滅菌效果更徹底，可降低污染率。由表1可看出，添加吐溫可明顯降低金線蓮外植體的污染率，減少污染幅度達10%左右。

表1 不同消毒方法對外植體污染率的影響

2.2 適宜金線蓮叢生芽誘導的基本培養基

根據表2可知，12種誘導培養基對叢生芽誘導發現不同的培養基配方對金線蓮叢生芽誘導具有較大影響，其中1/2MS培養基優于MS培養基，在1/2MS培養基中當6-BA濃度為4.0 mg/L時，來自于莖節和莖尖的叢生芽增殖倍數達到最大，分別為1.2和0.8；且莖節誘導增殖率高于莖尖。當金線蓮外植體在培養基中培養10 d時，莖尖的腋芽開始突出，并逐漸伸長，25 d左右腋芽的基部又長出新的腋芽，而一些帶芽眼的莖段在25 d時能形成叢生狀的小苗。因此適宜金線蓮叢生芽誘導的基本培養基配方為1/2MS+6-BA 4.0 mg/L，且選用莖節為誘導的外植體材料。

表2 30 d后不同培養基對叢生芽誘導影響

2.3 金線蓮叢生芽增殖試驗

以1/2MS+6-BA 4.0 mg/L為基本培養基，添加不同濃度的NAA和2，4-D（表3），觀察2種不同激素對金線蓮叢生芽的增殖誘導。當NAA濃度為0.4 mg/L時，7 d后莖節的腋芽開始萌動膨大，芽不斷伸展，逐漸形成主葉，極個別莖節上能誘導出2～3個不定芽，30 d后主芽長為1.8 cm，其基部也能再生側芽。添加NAA的出芽率高于2，4-D處理的出芽率，平均高出2倍。而在添加2，4-D的培養基中，一般20 d后可肉眼觀察到黃白色的小芽，隨時間的延長逐漸轉為綠色，出芽率低。當培養60 d后，增殖苗長勢良好，不定芽較多。

表3 不同植物生長激素對金線蓮芽增殖的影響

2.4 壯苗及生根

大量研究表明，較低濃度無機鹽的基本培養基能提高組培苗的生根或煉苗移栽的成活率。筆者以1/10MS+NAA 0.5 mg/L+0.05%活性炭為基本培養基，添加3種不同濃度的有機添加物，探討其對金線蓮組培苗壯苗生根的影響。結果發現（表4），3種有機添加物均能讓金線蓮組培苗壯苗生根，香蕉泥的作用最大，椰子汁其次，最差為馬鈴薯汁；當香蕉泥濃度為200 g/L時，組培苗的發根數和葉片數最多，苗長勢良好。

表4 不同有機添加物對金線蓮壯苗生根的影響

2.5 煉苗移栽

在溫室內采用松口和封口的煉苗方式對金線蓮生根苗進行煉苗，從表5可以看出，不同的煉苗方法影響金線蓮移栽成活率，封口煉苗成活率低于松口煉苗成活率。

表5 不同煉苗方式對苗移栽成活率的影響

3 討論

獲得無菌系是組培試驗的首要基礎。由于種植于室外的各種植物，其植株體內外攜帶較多的真菌和細菌，以致無菌系建立時污染率較高，因此可適當增加酒精和HgCl2滅菌時間或添加一些表面活性劑[6，12]，也可添加一些廣譜性抗生素（慶大霉素、鏈霉素、卡拉霉素） 或殺菌劑（多菌靈、甲基托布津） 等方法[13]，以提高無菌系建立的效率。試驗中以野生金線蓮的莖段或莖尖為外植體，探討添加吐溫對滅菌效果的影響，結果發現當在HgCl2溶液中滴加吐溫時，可以提高外植體的滅菌效果，且莖段的滅菌效果高于莖尖。其具體處理過程：經自來水沖洗后的莖節用75%酒精浸泡30 s后，再用0.1%HgCl2（100 mL中加1～2滴） 處理8 min時滅菌效果最好，此時污染率達11%，而莖尖的污染率為15%。

在植物組織培養過程中，基本培養基、激素種類及其濃度、有機添加物對植物叢生芽的誘導、增殖及其生根壯苗具有較大的影響。通過莖尖和帶芽眼莖段2種外植體的叢生芽誘導試驗發現，在同一種培養基處理中，帶芽眼莖段的增殖倍數高于莖尖，因此金線蓮叢生芽誘導的適宜外植體為帶芽眼的莖段，這與宋麗莎[7]的結果相一致；在不同基本培養基處理中，1/2MS的培養效果優于MS培養基，金線蓮叢生芽誘導的適宜培養基配方為1/2MS+6-BA 4.0 mg/L。生長素NAA或2，4-D的添加能顯著促進叢生芽的增殖和生長，NAA的效果優于2，4-D，適宜叢生芽增殖的配方為1/2MS+6-BA 4.0 mg/L+NAA 0.4 mg/L。在壯苗生根階段，3種有機添加物能明顯改善金線蓮的生長狀況，其中當香蕉泥濃度為200 g/L時，組培苗的長勢最好，這與前人的研究結果相符[8]，因此金線蓮的壯苗生根培養配方為1/10MS+NAA 0.5 mg/L+0.05%活性炭+200 g/L香蕉泥。

由于金線蓮組培苗是在人為控制的理想環境中培養，當移栽到大田間種植時，需要進行人工馴化，適宜的煉苗方法有利于提高金線蓮組培苗的移栽成活率[9～10]。筆者采用封口和松口2種方式對金線蓮組培苗進行溫室內鍛煉，其中松口的煉苗方式能提高移栽成活率。

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