徐慧+戴元榮+胡丹紅+夏夢玲
[摘要] 目的 觀察羅紅霉素對煙霧暴露哮喘小鼠組蛋白去乙酰化酶(HDAC2)表達的影響,探討羅紅霉素對煙霧暴露哮喘患者可能的治療作用。方法 SPF級雌性BALB/c小鼠40只,按隨機數字表法隨機分為對照組(C)、哮喘組(A)、煙霧暴露組(S)、羅紅霉素組(R)4組。用卵白蛋白(OVA)致敏和激發的方法制備哮喘和煙霧暴露模型,并用羅紅霉素干預。觀察各組小鼠肺組織病理超微結構變化,分析支氣管肺泡灌洗液(BALF)中的細胞分類計數,并采用Western blot法測定各組小鼠肺組織中HDAC2表達情況。結果 哮喘組和煙霧暴露組嗜酸粒細胞計數比例均顯著高于對照組(均P<0.01),煙霧暴露組中性粒細胞計數比例顯著高于哮喘組(P<0.01);羅紅霉素組與煙霧暴露組相比,嗜酸性粒細胞,中性粒細胞比例明顯下降(P<0.01)。哮喘組和煙霧暴露組肺組織HDAC2表達均低于對照組,煙霧暴露組低于哮喘組(均P<0.01), 羅紅霉素組肺組織HDAC2表達高于煙霧暴露組(均P<0.01)。結論羅紅霉素可能通過上調HDAC2,改善煙霧暴露小鼠氣道炎癥。
[關鍵詞] 哮喘;香煙煙霧;組蛋白脫乙酰基酶類;羅紅霉素
[中圖分類號] R563.9 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701(2014)30-0001-03
支氣管哮喘(簡稱哮喘)是呼吸系統的常見病和多發病,其患病率和死亡率目前呈上升趨勢。嗜酸粒細胞炎癥是哮喘的重要特征,而吸煙哮喘患者氣道卻是以中性粒細胞浸潤為主。吸煙是影響哮喘發生、發展的重要危險因素,可增加哮喘發生的頻率和癥狀的嚴重程度,而且煙霧暴露哮喘患者存在對激素治療不敏感[1]等問題。因此研究吸煙哮喘患者發病機理具有重要意義。哮喘發病危險因素中最重要的是遺傳和環境因素,由于遺傳背景不可能在短時間內出現顯著變化,因此,環境因素可能起到關鍵作用。研究表明組蛋白去乙酰化酶(HDAC)是激素發揮抗炎作用的中介,HDAC2活性的下降會導致哮喘患者對激素敏感性下降[2]。羅紅霉素是臨床上常用的大環內酯類抗生素,近年來研究發現其除了抗菌作用外,還表現出較強的抗炎活性[3]。本實驗通過建立煙霧暴露哮喘小鼠模型,并用羅紅霉素干預,觀察羅紅霉素對HDAC2的影響,為尋找對煙霧暴露哮喘患者有效藥物提供新途徑。
1 材料與方法
1.1 實驗材料
SPF級雌性BALB/c小鼠40只,體重18~22 g,由溫州醫科大學實驗動物中心提供。紅塔山牌過濾嘴香煙(云南省玉溪卷煙廠生產,焦油含量13 mg/支,煙氣一氧化碳量13 mg/支);免疫組化試劑盒和GAPDH(碧云天生物技術研究所);HDAC2(美國CST公司);卵白蛋白(OVA)干粉,羅紅霉素粉劑(美國Sigma公司)。
1.2 實驗方法
1.2.1煙霧暴露哮喘模型的復制 40只小鼠按隨機數字表法隨機平均分為對照組(C)、哮喘組(A)、煙霧暴露組(S)、羅紅霉素組(R)。哮喘組和煙霧暴露組第1天和第14天小鼠腹腔內注射0.2 ml OVA/Al(OH)3混合液[其中OVA 0.1 mg,Al(OH)3 1 mg]致敏;第21天開始霧化吸入1%OVA的生理鹽水 8 mL激發,每次30 min,共18 d。煙霧暴露組從1%OVA霧化激發開始,每日于霧化激發后,參照文獻[4]自制半封閉小鼠吸煙箱,每次點燃2支香煙燃燒8 min,休息5 min后再點燃2支,共10支,1次/d,共18 d。羅紅霉素組在煙霧暴露組的基礎上每次激發前半小時予以羅紅霉素40 mg/kg灌胃。對照組用等量生理鹽水代替OVA激發和羅紅霉素灌胃,最后一次激發后處死,取支氣管肺泡灌洗液(BALF)及肺組織標本備用。
1.2.2 各組小鼠肺組織病理超微結構的變化 石蠟切片HE染色后光鏡下觀察各組肺組織結構,支氣管及血管周圍炎癥浸潤情況,有無上皮損傷。
1.2.3 BALF中細胞分類計數 BALF沉渣用1 mLPBS液重懸,取一滴滴于載玻片上涂片,自然晾干后加瑞氏液固定,再加等量緩沖液與染料混勻,染色5~10 min,沖去染液。選擇涂片體尾交界處染色良好的區域,在高倍鏡下,按一定順序移動視野,根據形態特征對200個白細胞做細胞分類檢測。
1.2.4 Western blot檢測HDAC2蛋白表達 將各組小鼠肺組織用適量蛋白裂解液裂解,提取總蛋白,用BCA法進行蛋白定量。蛋白變性后, 按每孔40 μg蛋白量加樣進行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳,PVDF 轉膜。一抗用兔抗小鼠HDAC2(1﹕600),二抗為辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔(1﹕5000),室溫孵育1~2 h,洗膜,ECL顯影。采用Band Scan電泳圖像分析軟件,以GAPDH蛋白為內參,以目的蛋白和內參的吸光度的比值代表目的蛋白的相對含量,進行半定量分析。
1.2.5 統計學方法 全部數據經SPSS 19.0統計軟件進行分析,所有數據進行正態性檢驗,數據以均數±標準差(x±s)表示。多組樣本均數比較進行方差齊性檢驗,組間比較采用單因素方差分析,兩兩比較方差不齊者用 Dunnett T3 檢驗,方差齊者用Tukey檢驗,以P<0.05為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 肺組織顯微結構變化
肺組織切片HE染色后,光鏡下可見C組小鼠肺組織結構完整,支氣管及血管周圍未見明顯炎癥細胞浸潤。A組小鼠肺組織內支氣管壁各層黏膜皺褶增多,支氣管上皮斷裂、脫落及較多的炎性細胞浸潤。S組肺泡腔不規則擴大,肺泡間隔斷裂或者變薄,氣道壁明顯增厚,支氣管平滑肌肥大,大量淋巴細胞及中性粒細胞浸潤。R組少量炎性細胞浸潤,支氣管壁輕度增厚,跟S組相比,炎癥癥狀明顯減輕,見圖1。
2.2 各組小鼠BALF細胞計數及分類
由表1可見,哮喘組以嗜酸性粒細胞升高為主,而煙霧暴露組則以中性粒細胞升高為主,煙霧暴露組中性粒細胞計數比例明顯高于哮喘組(P<0.01),哮喘組和煙霧暴露組與對照組相比中嗜酸性粒細胞、淋巴細胞、中性粒細胞計數比例均升高(均P<0.01),羅紅霉素組與煙霧暴露組相比嗜酸性粒細胞、中性粒細胞、淋巴細胞明顯下降(P<0.05或P<0.01)。