羅紅霉素對香煙煙霧暴露小鼠HDAC2的影響

徐慧+戴元榮+胡丹紅+夏夢玲

[摘要] 目的 觀察羅紅霉素對煙霧暴露哮喘小鼠組蛋白去乙酰化酶（HDAC2）表達的影響，探討羅紅霉素對煙霧暴露哮喘患者可能的治療作用。方法 SPF級雌性BALB/c小鼠40只，按隨機數字表法隨機分為對照組（C）、哮喘組（A）、煙霧暴露組（S）、羅紅霉素組（R）4組。用卵白蛋白（OVA）致敏和激發的方法制備哮喘和煙霧暴露模型，并用羅紅霉素干預。觀察各組小鼠肺組織病理超微結構變化，分析支氣管肺泡灌洗液（BALF）中的細胞分類計數，并采用Western blot法測定各組小鼠肺組織中HDAC2表達情況。結果 哮喘組和煙霧暴露組嗜酸粒細胞計數比例均顯著高于對照組（均P<0.01），煙霧暴露組中性粒細胞計數比例顯著高于哮喘組（P<0.01）；羅紅霉素組與煙霧暴露組相比，嗜酸性粒細胞，中性粒細胞比例明顯下降（P<0.01）。哮喘組和煙霧暴露組肺組織HDAC2表達均低于對照組，煙霧暴露組低于哮喘組（均P<0.01）， 羅紅霉素組肺組織HDAC2表達高于煙霧暴露組（均P<0.01）。結論羅紅霉素可能通過上調HDAC2，改善煙霧暴露小鼠氣道炎癥。

[關鍵詞] 哮喘；香煙煙霧；組蛋白脫乙酰基酶類；羅紅霉素

[中圖分類號] R563.9 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2014）30-0001-03

支氣管哮喘（簡稱哮喘）是呼吸系統的常見病和多發病，其患病率和死亡率目前呈上升趨勢。嗜酸粒細胞炎癥是哮喘的重要特征，而吸煙哮喘患者氣道卻是以中性粒細胞浸潤為主。吸煙是影響哮喘發生、發展的重要危險因素，可增加哮喘發生的頻率和癥狀的嚴重程度，而且煙霧暴露哮喘患者存在對激素治療不敏感[1]等問題。因此研究吸煙哮喘患者發病機理具有重要意義。哮喘發病危險因素中最重要的是遺傳和環境因素，由于遺傳背景不可能在短時間內出現顯著變化，因此，環境因素可能起到關鍵作用。研究表明組蛋白去乙酰化酶（HDAC）是激素發揮抗炎作用的中介，HDAC2活性的下降會導致哮喘患者對激素敏感性下降[2]。羅紅霉素是臨床上常用的大環內酯類抗生素，近年來研究發現其除了抗菌作用外，還表現出較強的抗炎活性[3]。本實驗通過建立煙霧暴露哮喘小鼠模型，并用羅紅霉素干預，觀察羅紅霉素對HDAC2的影響，為尋找對煙霧暴露哮喘患者有效藥物提供新途徑。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

SPF級雌性BALB/c小鼠40只，體重18～22 g，由溫州醫科大學實驗動物中心提供。紅塔山牌過濾嘴香煙（云南省玉溪卷煙廠生產，焦油含量13 mg/支，煙氣一氧化碳量13 mg/支）；免疫組化試劑盒和GAPDH（碧云天生物技術研究所）；HDAC2（美國CST公司）；卵白蛋白（OVA）干粉，羅紅霉素粉劑（美國Sigma公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1煙霧暴露哮喘模型的復制 40只小鼠按隨機數字表法隨機平均分為對照組（C）、哮喘組（A）、煙霧暴露組（S）、羅紅霉素組（R）。哮喘組和煙霧暴露組第1天和第14天小鼠腹腔內注射0.2 ml OVA/Al（OH）3混合液[其中OVA 0.1 mg，Al（OH）3 1 mg]致敏；第21天開始霧化吸入1%OVA的生理鹽水 8 mL激發，每次30 min，共18 d。煙霧暴露組從1%OVA霧化激發開始，每日于霧化激發后，參照文獻[4]自制半封閉小鼠吸煙箱，每次點燃2支香煙燃燒8 min，休息5 min后再點燃2支，共10支，1次/d，共18 d。羅紅霉素組在煙霧暴露組的基礎上每次激發前半小時予以羅紅霉素40 mg/kg灌胃。對照組用等量生理鹽水代替OVA激發和羅紅霉素灌胃，最后一次激發后處死，取支氣管肺泡灌洗液（BALF）及肺組織標本備用。

1.2.2 各組小鼠肺組織病理超微結構的變化 石蠟切片HE染色后光鏡下觀察各組肺組織結構，支氣管及血管周圍炎癥浸潤情況，有無上皮損傷。

1.2.3 BALF中細胞分類計數 BALF沉渣用1 mLPBS液重懸，取一滴滴于載玻片上涂片，自然晾干后加瑞氏液固定，再加等量緩沖液與染料混勻，染色5～10 min，沖去染液。選擇涂片體尾交界處染色良好的區域，在高倍鏡下，按一定順序移動視野，根據形態特征對200個白細胞做細胞分類檢測。

1.2.4 Western blot檢測HDAC2蛋白表達 將各組小鼠肺組織用適量蛋白裂解液裂解，提取總蛋白，用BCA法進行蛋白定量。蛋白變性后， 按每孔40 μg蛋白量加樣進行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，PVDF 轉膜。一抗用兔抗小鼠HDAC2（1﹕600），二抗為辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔（1﹕5000），室溫孵育1～2 h，洗膜，ECL顯影。采用Band Scan電泳圖像分析軟件，以GAPDH蛋白為內參，以目的蛋白和內參的吸光度的比值代表目的蛋白的相對含量，進行半定量分析。

1.2.5 統計學方法 全部數據經SPSS 19.0統計軟件進行分析，所有數據進行正態性檢驗，數據以均數±標準差（x±s）表示。多組樣本均數比較進行方差齊性檢驗，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較方差不齊者用 Dunnett T3 檢驗，方差齊者用Tukey檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 肺組織顯微結構變化

肺組織切片HE染色后，光鏡下可見C組小鼠肺組織結構完整，支氣管及血管周圍未見明顯炎癥細胞浸潤。A組小鼠肺組織內支氣管壁各層黏膜皺褶增多，支氣管上皮斷裂、脫落及較多的炎性細胞浸潤。S組肺泡腔不規則擴大，肺泡間隔斷裂或者變薄，氣道壁明顯增厚，支氣管平滑肌肥大，大量淋巴細胞及中性粒細胞浸潤。R組少量炎性細胞浸潤，支氣管壁輕度增厚，跟S組相比，炎癥癥狀明顯減輕，見圖1。

2.2 各組小鼠BALF細胞計數及分類

由表1可見，哮喘組以嗜酸性粒細胞升高為主，而煙霧暴露組則以中性粒細胞升高為主，煙霧暴露組中性粒細胞計數比例明顯高于哮喘組（P<0.01），哮喘組和煙霧暴露組與對照組相比中嗜酸性粒細胞、淋巴細胞、中性粒細胞計數比例均升高（均P<0.01），羅紅霉素組與煙霧暴露組相比嗜酸性粒細胞、中性粒細胞、淋巴細胞明顯下降（P<0.05或P<0.01）。