兩種模式生物核小體定位比較研究

盧 英，豐繼華，單秋甫，陳攀峰，單增輝

(云南民族大學(xué)電氣信息工程學(xué)院，云南昆明650500)

采用模式生物進行研究的理論基礎(chǔ)源自于物種間基本生命過程的保守性，即從一個生物得到的知識可能外推到包括人在內(nèi)的另外一個生物上。例如單細胞生物可以用來研究基本的細胞生化過程，避免了研究多細胞生物體內(nèi)組織和器官分化所帶來的復(fù)雜性。但是，采用同樣的方式卻不能用單細胞生物的代謝來解釋控制多細胞生物所需要的每一個過程。每種生物都具有其獨特性。因此，對過度外推模式生物得到的結(jié)論必須保持謹慎。具體選擇哪種模式生物更好，需要根據(jù)具體情況而定。

每個模式生物各有利弊。為此，有必要在兩個以上不同模式生物中做平行實驗。為了全面揭示真核生物核小體的定位特點，我們分別選取一個單細胞生物和一個多細胞生物作為研究對象。原因在于:(1)酵母作為單細胞生物，其基因組較小，核小體的定位特征相對簡單，對其染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的研究及認識也較為清楚［1－2］，能得到相對準確而清晰的數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)和圖譜。(2)果蠅胚胎期是一個由單細胞到多細胞的分化過渡的階段，研究這一時期的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，相對于直接研究分化后的果蠅成體困難要小得多。且與單細胞酵母細胞相比，果蠅胚胎期又具有某些單細胞生物的特點，因而在酵母染色質(zhì)研究中獲得的知識，可用于對果蠅的研究，二者具有可比性。(3)以往研究已經(jīng)通過實驗獲得了酵母與果蠅胚胎期的核小體占位率數(shù)據(jù)和H2AZ核小體定位數(shù)據(jù)［3］，因此研究具有可行性。

通過對現(xiàn)有實驗數(shù)據(jù)和實驗條件進行綜合考察后，本文最終選取了在遺傳研究上最具代表意義的兩個模式生物:釀酒酵母(S.cerevisiae)和黑腹果蠅(D.melanogaster)［8］作為研究對象，希望通過比較分析這兩種生物的核小體定位數(shù)據(jù)［9］，得出有生物學(xué)意義的結(jié)論。對今后推廣到其他物種的核小體定位模式的研究有著極為重要的現(xiàn)實意義和實際應(yīng)用價值。事實也證明，通過對酵母和果蠅的相關(guān)基因組核小體的圖譜分析，我們發(fā)現(xiàn)了兩者的基因內(nèi)染色體組織架構(gòu)具有顯著的共同點與差異性。

1 實驗方法

1.1 數(shù)據(jù)準備

本研究數(shù)據(jù)主要來自兩個部分:第一、酵母核小體定位實驗數(shù)據(jù)，包括Lee等人研究中給出的高分辨率核小體占位率實驗數(shù)據(jù)［2］，來自NCBI數(shù)據(jù)庫中的酵母16條染色體DNA編碼序列、David等人文獻中給出的4 792個高置信度酵母基因組實驗數(shù)據(jù)［1］，以及Albert等人實驗得到的 H2A.Z核小體位置數(shù)據(jù)［4］。第二部分果蠅的核小體定位的實驗數(shù)據(jù)，包括Mavrich等人在實驗中得到的果蠅胚胎期H2AZ核小體定位數(shù)據(jù)、總體核小體(bulk nucleosome)占位率數(shù)據(jù)［5］，以及 Pavel Tomancak 等人對果蠅胚胎期不同表達模式基因的分類數(shù)據(jù)［6］。由于以上核小體定位實驗數(shù)據(jù)來自不同實驗平臺，具有異構(gòu)性，我們根據(jù)研究目的利用信號處理方法對與本研究有關(guān)的數(shù)據(jù)進行了重構(gòu)。

1.2 數(shù)據(jù)處理

1.2.1 核小體定位實驗數(shù)據(jù)的處理

(1)高分辨率核小體占位率實驗數(shù)據(jù)的處理

由于Lee等人提供的酵母高分辨率核小體占位率實驗數(shù)據(jù)來自每隔4 bp采樣的全基因組微陣列平臺 (an Affymetrix tiling microarray)［2］，而由 Travis N.Mavric等人提供的果蠅實驗數(shù)據(jù)卻是每隔36 bp采樣的全基因組微陣列數(shù)據(jù)［5］。在此，我們通過插值方法得到一個覆蓋全基因組每1 bp的核小體占位率數(shù)據(jù)，以供后續(xù)對齊使用。通過三次樣條插值(spline)，我們得到了精度較高，平滑度較好的包括了酵母16條染色體的實驗預(yù)備數(shù)據(jù)。由于果蠅數(shù)據(jù)的間隔較大(36 bp)，因此獲得的果蠅6條染色體的實驗預(yù)備數(shù)據(jù)精度相對于酵母要低一些。

(2)H2AZ核小體定位數(shù)據(jù)的處理

由于Albert等人提供的酵母H2A.Z核小體定位原始實驗數(shù)據(jù)和由Travis N.Mavric等人同時提供了果蠅胚胎期基因組的H2A.Z核小體定位原始實驗數(shù)據(jù)，都包括了H2A.Z核小體的起始位點、終止位點以及一些核小體的物理性質(zhì)數(shù)據(jù)。正是因為其中核小體的位置以及與其定位強度有關(guān)的物理性質(zhì)恰好符合高斯分布的特性，我們認為具有良好的數(shù)理統(tǒng)計規(guī)律特性的高斯分布能很好的應(yīng)用在核小體的定位研究上。我們利用高斯分布圖形對核小體定位數(shù)據(jù)進行重建，這高斯分布公式如下:

在每一個核小體的位置上構(gòu)造一個高斯分布圖形(見圖1)，期望值取核小體定位數(shù)據(jù)的中點，并且基于高斯分布中的“2σ原則”，我們將標準差取為核小體長度的1/4，以最大限度的減少誤差。最后，利用實驗數(shù)據(jù)中的峰值數(shù)據(jù)(peakhigh)作為這個核小體高斯分布的中點值，peakhigh是表示該核小體存在于這個位置的可能性大小的物理性質(zhì)。

圖1 核小體定位的正態(tài)分布重構(gòu)示意圖Fig.1 Normal distribution reconstruction graph of the Nucleosome positioning

1.2.2 基因數(shù)據(jù)的重構(gòu)

由Pavel Tomancak等人提供的果蠅原始實驗數(shù)據(jù)包括了不同表達模式型的基因的名稱數(shù)據(jù)［6］，結(jié)合Travis N.Mavric等人提供的基因位置數(shù)據(jù)［5］，分離出不同類表達模式基因的位置，包括廣泛表達型(broad)的2 627條基因、限制性表達型(restrict)的2 085條基因、沉默型(silent)的8 941條基因。

1.2.3 基于中心對齊的基因排序

通過前期處理和篩選，得到了酵母和果蠅全體基因組(所有基因)、果蠅廣泛表達基因組(胚胎期所有時期均被翻譯)、果蠅限制性表達基因組(胚胎期部分時期被翻譯，部分時期不被翻譯)、果蠅沉默型基因組(胚胎期不被翻譯)中的基因位置數(shù)據(jù)。這些組數(shù)據(jù)包括基因所在染色體上的位置，基因的起始位點和終止位點，基因正轉(zhuǎn)錄(W型)和反轉(zhuǎn)錄(C型)情況。

為了得到以上每組基因的一個二維繪圖(hot map)。首先分別將每組基因按照基因長度從小到大依次遞增的原則進行重排列，并提取每條基因的中心點，這樣我們得到各組由短基因到長基因排列的基因位置數(shù)據(jù)。其次將此類位置數(shù)據(jù)分別映射到酵母和果蠅的全核小體占位率數(shù)據(jù)與H2A.Z核小體的定位數(shù)據(jù)中。在各條染色體上找到每條基因的中心點，并在每個基因的中心點周圍，截取上、下游各Nbp的長度范圍的核小體占位率數(shù)據(jù)或在該范圍內(nèi)含H2A.Z核小體的定位數(shù)據(jù)，取N的原則為各組基因中20%的最長基因的平均值。最后對截取的數(shù)據(jù)進行中心對齊(其中C型基因?qū)?yīng)的數(shù)據(jù)要進過反向處理)排列，這樣就得到了每組基因中心對齊的核小體的定位數(shù)據(jù)。將對齊后的數(shù)據(jù)進行二維繪圖(hot map)，由此得到了各組基因中心對齊的核小體的定位圖譜。

1.2.4 圖譜

這里用hot map繪圖法繪出以下多組二維繪圖(hot map)，展示了一個明顯的、有組織的核小體排列序列。我們從不同層次、從外到內(nèi)、從頂端到低端、從最短基因到最長基因的去分析，有組織的核小體的剖面圖被生動形象的展現(xiàn)出來。

從圖2A中很明顯的觀測到酵母中基因5’端處的邊界顯示強度明顯比基因3’端邊界顯示強度大，這一點與Cedric Vaillant等人的關(guān)于酵母全體基因上發(fā)現(xiàn)的規(guī)律一致，即在核小體缺失區(qū)域(NFR)的基因3’端的存在著5個核小體影響著基因，在核小體缺失區(qū)域(NFR)基因5’端則存在著7個核小體的影響著基因［7］。然而，圖2B中所顯示出來的果蠅全體基因的中心點周圍H2A.Z核小體分布圖中，基因5’端的邊界卻與基因3’端的邊界顯示出輪廓對稱，且顯示強度也一致，這一點與酵母中觀察到的完全不同。在酵母中，一般認為H2A.Z核小體與基因的轉(zhuǎn)錄相關(guān)，并且傾向于定位在具有轉(zhuǎn)錄活性的基因5＇端。但是在果蠅胚胎中看到的情況卻是;基因5＇端核小體缺失區(qū)域(NFR)與基因3’端核小體缺失區(qū)域(NFR)兩側(cè)具有同樣數(shù)目或至少是數(shù)目相差不H2AZ核小體，且邊界上的核小體數(shù)量也遠遠超過酵母。

這種從單細胞生物到多細胞生物間的差異性，體現(xiàn)了生物界中的進化特性。從果蠅胚胎的H2A.Z核小體分布看，單細胞生物和多細胞生物有著顯著差別。原因在于當果蠅胚胎處于不同發(fā)育階段時，一些基因必須嚴格按發(fā)育程序保持的沉默，否則對幼蟲可能是致命的。這就需要果蠅進化出比單細胞生物酵母更為復(fù)雜的染色體調(diào)控機制。因此，H2A.Z核小體在酵母中的作用可能在果蠅中只得到了部分保留。

圖2 酵母與果蠅全基因中心點周圍H2A.Z核小體分布Fig.2 H2A.Z nucleosome distribution around the center point of genes in Yeast and Drosophila

圖3為酵母和果蠅果蠅胚胎期沉默型基因中心點周圍H2A.Z核小體分布圖，這里選取果蠅果蠅胚胎期沉默型基因組圖是因為它表現(xiàn)出的特征是最明顯的。從圖3A中可以發(fā)現(xiàn)，當L＜1.5 kbp時，在核小體缺失區(qū)域的兩個邊界處呈現(xiàn)出明顯的周期性包裝，并且出現(xiàn)了一個定義明確有著均勻間隔的核小體數(shù)n。隨著L的增加，這種晶體狀的基因簇在基因區(qū)域呈現(xiàn)出與核小體相同的數(shù)目n(2＜n＜10)。對于L＞1.5 kbp的基因，周期性核小體的位置是可見的，但因受兩邊界的誘導(dǎo)，顯示周期性規(guī)律的中心點處核小體位置所需的強力限制性減弱，從而使周期性出現(xiàn)比較模糊現(xiàn)象。從圖3B果蠅中同樣可以發(fā)現(xiàn)酵母中發(fā)現(xiàn)的規(guī)律，但是較酵母所表現(xiàn)的出來的更模糊更復(fù)雜的圖像。

圖3 酵母全基因和果蠅胚胎期沉默型基因中心點周圍H2A.Z核小體分布Fig.3 H2A.Z nucleosome distribution around the center point of genes in silent gene of Yeast and Drosophila embryo

圖4為酵母和果蠅果蠅胚胎期沉默型基因中心點周圍核小體占位率分布，從圖4A中也發(fā)現(xiàn)了前面兩組A圖中發(fā)現(xiàn)的兩個核小體排列特征，并且此圖更為清晰明確。而圖4B中卻只能看到一個兩個核小體確實區(qū)域所組成的輪廓。原因之一可能是酵母高分辨率核小體占位率實驗數(shù)據(jù)來自每隔4 bp采樣的全基因組微陣列平臺，而果蠅實驗數(shù)據(jù)卻是每隔36 bp采樣的全基因組微陣列平臺，其精度相差太大。原因之二可能就是果蠅較酵母是更高級的生物，其基因組織結(jié)構(gòu)也更復(fù)雜，這也解釋了前一組圖組果蠅的周期性比酵母模糊的疑問。

圖4 酵母和果蠅胚胎期沉默型全基因中心點周圍全部核小體占位率分布Fig.4 The occupancy rate distribution of all nucleosome around the center point of genes in yeast and silent genes in Drosophila

2 結(jié)論

本文從高分辨率核小體占位率實驗數(shù)據(jù)和H2AZ核小體定位數(shù)據(jù)分別去研究酵母和果蠅胚胎期核小體定位及染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)不同物種和同一物種中不同表達模式的基因與全體基因上，核小體分布會呈現(xiàn)出不同的特征。酵母全體基因中核小體對NFR的基因3’端影響較NFR基因5’端影響小，果蠅的全體基因中核小體對NFR的基因3’端影響較NFR基因5’端影響卻是一樣的。酵母與果蠅胚胎期沉默型基因的核小體缺失區(qū)域的兩個邊界中間處都出現(xiàn)了一個明確有著均勻間隔的核小體數(shù)n，且隨著基因長度L的變長其周期性特性逐漸變模糊，只是果蠅相對來說比酵母的更為復(fù)雜和模糊。

上面所述的差異性體現(xiàn)了在‘硬’遺傳和‘軟’遺傳方面，兩個物種基因組進化的不同。在‘軟’遺傳方面，發(fā)現(xiàn)了核小體在兩個物種啟動子和終止子區(qū)的核小體缺失區(qū)域在范圍上的差異性;在‘硬’遺傳方面，揭示了兩個物種與‘硬’遺傳上所呈現(xiàn)的相關(guān)的核小體數(shù)目與位置上的進化差異。結(jié)果表明，從單細胞酵母生物到多細胞果蠅生物間基因組的進化過程中，核小體組織的演化既有變異性，也具有保守性。

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